Старение - это естественный процесс, связанный с постепенным снижением физиологических функций и являющийся одним из основных факторов риска развития таких заболеваний, как нейродегенеративные, сердечно-сосудистые, метаболические и злокачественные опухоли. В 2013 году Lo'pez-Otin et al.. определили "Признаки старения". Эта работа постепенно стала наиболее цитируемой в области старения. Эти признаки включают первичные маркеры старения (нестабильность генома, истощение теломер, эпигенетические изменения и потеря протеостаза), антагонистические маркеры старения (дисфункция митохондрий, клеточное старение и дерегулированное восприятие питательных веществ) и интегративные признаки (истощение стволовых клеток и изменение межклеточных коммуникаций). На ранней стадии старения эти три противодействующих маркера обеспечивают защиту и компенсацию клеток, чтобы противостоять четырем основным маркерам, запускающим старение. Однако по мере прогрессирования старения их компенсаторная способность постепенно утрачивается, и три противодействующих маркера переходят в состояние, способствующее старению, о чем свидетельствуют 2 интегративных признака [1, 2]. Эти 9 признаков послужили основой для разработки системных схем лечения заболеваний, связанных со старением.

Поскольку многие старческие или связанные с возрастом заболевания до сих пор не имеют эффективного лечения, внимание исследователей привлекают методы лечения, направленные на различные стадии и признаки старения. Например, NAD+ играет конструктивную роль во всем процессе старения [3-8]; resveratrol индуцирует митофагию, регулирует ощущение питательных веществ и и метаболизм и одновременно повышает активность sirtuin 1 (SIRT1) на эпигенетическом уровне [9-12]; Senolytics избирательно очищают старческие клетки, проявляющие старческий секреторный фенотип (SASP) [13-17]; ингибиторы mTOR, напр. Эти стратегии в настоящее время находятся на разных стадиях разработки, и их реальная терапевтическая эффективность, а также побочные реакции еще далеки от удовлетворительных. Поэтому эти стратегии не нашли широкого применения в клинической практике.

Прогрессирование болезней, связанных со старением, часто начинается с изменения одного или даже нескольких генов. Кроме того, эффективность лекарственных препаратов часто снижается по мере прогрессирования заболевания, а при увеличении дозы, направленной на лечение прогрессирующего заболевания, возникают неизбежные побочные реакции. Генотерапия, напротив, дает надежду на то, что в будущем эти заболевания могут быть излечены, поскольку она направлена в первую очередь на первичные маркеры старения. Генотерапия, или генная терапия, первоначально относилась к методам лечения генетических нарушений путем введения новой ДНК в определенные клетки или коррекции существующей ДНК [23]. В 1960-х годах Nirenberg предложил применение генной инженерии, которая позволила бы проводить генотерапию человека. В XXI веке были созданы и развиты различные технологии генотерапии, в частности технология кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR). Эти технологии позволяют осуществлять не только редактирование, такое как нокаут, гомологичная рекомбинация, редактирование оснований, но и эпигенетическую модификацию (изменение экспрессии белков без изменения генетической информации), такую как репрессия, активация и деметилирование интересующих генов, и другие операции. Эти методы позволяют более лаконично и точно регулировать экспрессию генов [24], обеспечивая более широкое применение генотерапии. В данной статье рассматриваются основы генотерапии и результаты последних исследований; приводится обзор репрезентативных генов-мишеней и освещается их потенциал для лечения старения и возрастных заболеваний.

Первоначально под генотерапией подразумевалось введение экзогенной копии комплементарной ДНК (кДНК) в целевые ткани или клетки для коррекции или компенсации дефектных эндогенных генов [25]. С развитием знаний и технологий генотерапия стала ориентироваться на манипулирование экспрессией определенного гена [26] или изменение генетической информации, ответственной за заболевание. Таким образом, генотерапия включает в себя не только операции на уровне ДНК, но и модификацию на уровне мРНК, что обусловлено ее способностью передавать генетическую информацию (рис. 1).

Figure 1. Strategies of gene therapy. The schematic enumerates the strategies of gene therapy summarized in this review.

Замена генов, которая была первоначальной стратегией генотерапии, в настоящее время означает замену патогенного гена копией здорового гена или замену физиологического гена генной инженерией, с помощью которой его преимущества были усилены. В этой стратегии наиболее распространенной системой доставки является экзогенный перенос кДНК, опосредованный вирусными векторами [27]. В 2003 г. в Китае был разрешен к применению первый коммерциализированный препарат генотерапии - Gendicine (рекомбинантный аденовирус человека р53) [28], обладающий широким спектром противоопухолевого действия. С тех пор терапевтический потенциал различных вирусных векторов расширяется. Наиболее широко применяются рекомбинантные адено-ассоциированные вирусы (rAAVs) и лентивирусы. Хотя упаковочная способность, иммуногенность и биобезопасность всегда остаются актуальными проблемами, правильный и тщательный выбор альтернативных путей замены (in vivo против ex vivo) и способов введения (системное против местного), а также улучшение тканевой селективности вирусных векторов часто позволяют проводить лечение без серьезных побочных реакций. Таким образом, на практике замена происходит в основном на функциональном уровне, а не на уровне точного изменения генетической структуры.

Функциональная замена на уровне РНК, когда терапевтическая мРНК доставляется в основном через липидные наночастицы, получила свое развитие с разработкой вакцин COVID-19 и в настоящее время является одним из важных методов генотерапии. С одной стороны, доставленные терапевтические мРНК могут быть непосредственно транслированы в функциональные терапевтические белки, которые изначально не могли быть экспрессированы пациентами. С другой стороны, сконструированные мРНК могут экспрессировать экзогенные инструменты, такие как CRISPR-Cas, для осуществления редактирования или модификации генов [29]. Первый подход считается более безопасным, чем прямая геномная инженерия, учитывая недолговечность нуклеиновых кислот мРНК, поэтому он может быть более гибким в применении in vivo, в то время как второй подход предоставляет больше возможностей для доставки терапевтических средств.

Эта стратегия предпочтительна при заболеваниях, вызванных дефектом одного гена, и наиболее оптимальна для достижения локального эффекта без сложных системных взаимодействий.

Альтернативой отмене экспрессии гена, вызывающего заболевание, является прямое устранение его действия путем изменения локальных специфических последовательностей ДНК для получения точных целевых мутаций или небольших indels на геномном уровне. Эти изменения включают в себя вставку здоровой или модифицированной последовательности и пересмотр, удаление или замену вызывающей заболевание последовательности. На эту стратегию возлагаются большие надежды в области генотерапии. Существует три мощных инструмента для редактирования генома: транскрипционная активатор-подобная эффекторная нуклеаза (TALEN), нуклеаза с цинковыми пальчиками (ZFN) и CRISPR. Технология CRISPR является наиболее распространенной благодаря своей доступности, высокой эффективности и лучшей расширяемости. К широкой категории CRISPR-инструментов относятся РНК-направляемые эндонуклеазы, которые в основном индуцируют двунитевые разрывы (DBS) и осуществляют негомологичное концевое соединение (NHEJ), микрогомологичное концевое соединение (MMEJ) и гомологично-направленную репарацию (HDR). Из всех эндонуклеаз нуклеазы Cas9 наиболее часто стали применяться в клетках млекопитающих и человека, а нуклеазы Cas12 в основном применяются в клетках не млекопитающих, поскольку их протоспейсерный смежный мотив (PAM) богат основаниями TT [30]. Нуклеазы Cas13 способны разрезать одноцепочечную РНК, осуществляя редактирование и регуляцию на уровне РНК. Не вызывая разрывов нитей, редакторы оснований нацелены на преобразования, а прайм-редакторы - на точные замены, инсерции и делеции [30]. Кроме того, ADAR-опосредованное редактирование РНК - еще один замечательный метод, находящийся в стадии разработки и использующий естественные эндогенные механизмы [31].

Что касается клинического и до-клинического применения, то в ограниченном числе зарегистрированных и опубликованных исследований осторожно изучалось редактирование генов без вспомогательных клеточных продуктов in vivo, в основном с использованием транспортных средств, а также локального введения для борьбы с высокоразвитыми опухолевыми тканями [32, 33]. Хотя сообщение о препарате NTLA-2001 для лечения транстиретинового амилоидоза ознаменовала первый шаг к созданию in vivo продукта для редактирования генов CRISPR [34], и он был признан Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) сиротским препаратом, и его успех имеет ограниченное распространение. Поскольку некоторые DSB, indels и делеции, индуцированные Cas9, оказались неожиданными, их небезопасно проводить в естественных условиях, эти неопределенности и этические споры должны быть разрешены до начала дальнейших исследований. В настоящее время редактирование генов в основном применяется для создания продуктов ex vivo [35] в случае опасных эффектов вне-мишени.

Несмотря на приведенные выше результаты, следует отметить, что редактирование оснований, не приводящее к разрывам нитей ДНК, может оказаться более безопасным вариантом. Kathiresan et al. с помощью инкапсулированных в липидные наночастицы (LNP) CRISPR-редакторов оснований для снижения уровня холестерина и лечения атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний осуществили практически полный нокдаун PCSK9 в печени обезьян синегнойной породы; они продемонстрировали эффективное редактирование с незначительным off-target эффектом [36]. Недавно Monian et al. разработали эффективный инструмент - короткие химически модифицированные олигонуклеотиды AIMers, которые рекрутируют эндогенный ADAR без необходимости использования экзогенных ферментов и векторов доставки для редактирования оснований РНК аденин (A)->инозин (I) [31]. Стереочистые химически модифицированные AIMers позволили добиться эффективного редактирования и у обезьян-циномолгусов. Прекрасные примеры редактирования оснований могут ускорить разработку препаратов для редактирования генов in vivo.

Другие перспективные подходы к лечению заболеваний предполагают модификацию на генетическом уровне без изменения последовательностей нуклеиновых кислот. Эти подходы изменяют передачу генетической информации, например инактивируют ген, вызывающий заболевание, активируют гены-антагонисты для генов, вызывающих заболевание, корректируют дисбаланс в экспрессии генов или исправляют аномальные химические модификации [37-39]. С развитием технологии эффекторов CRISPR/Cas были сконструированы и разработаны такие инструменты, как CRISPRa/CRISPRi (непосредственно регулирующие экспрессию генов [30]), CRISPRoff (инициирующие метилирование ДНК [40]), слитый с TET3 каталитически неактивный Cas9 (dCas9) (деметилирующий метилированную ДНК [41]) и Cas13-направленная метилтрансфераза (обеспечивающая эффективные модификации m6A в эндогенных транскриптах РНК [42]). Эти инструменты позволяют осуществлять более разнообразные и тонкие эпигенетические модификации, чем те, которые опосредуются регуляторными не-кодирующими РНК [например, короткими шпилечными РНК (shRNA) и малыми интерферирующими РНК (siRNA)][43]. Поэтому операционные процедуры эпигенетической регуляции, как следствие, имеют тенденцию к стандартизации. В настоящее время эта стратегия находится в стадии разработки и в основном опробована для лечения злокачественных опухолей и CRISPR-скрининга in vivo [37-39].

Согласно классификации FDA от 2018 года, существует 5 основных категорий продуктов генотерапии [26]. Однако не все из этих 5 категорий пригодны для широкого применения в клинической практике; кроме того, другие новые продукты квалифицированы для прямой доставки и демонстрируют значительные перспективы (табл. 1).

Таблица 1 Сравнение принципов и характеристик различных продуктов генотерапии, имеющих клиническое и доклиническое применение.

Рекомбинантные адено-ассоциированные вирусы (rAAV) в настоящее время являются наиболее часто применяемыми векторами в интервенционных клинических исследованиях по трансдукции генов. rAAV состоит из непокрытой белком, линейной одноцепочечной последовательности ДНК. По сравнению с аденовирусными, ретровирусными и лентивирусными векторами упаковочная способность rAAV-векторов невелика, поэтому для трансдукции интересующих генов необходимо использовать несколько или гибридные векторы. Однако rAAV обладают относительно высокой безопасностью, низкой иммуногенностью и эффективностью трансдукции в широкий спектр тканей-мишеней. Даже если загруженный экзогенный ген не может быть вставлен в геном хозяина, он может стабильно экспрессироваться in vivo в качестве сателлита в течение длительного времени [44].

Благодаря наличию различных серотипов (серотипы 1-12) и синтетических серотипов вирусных капсидных белков, векторы rAAV могут быть сконструированы для воздействия на определенные клетки или ткани при соответствующем способе введения [45]. Среди этих серотипов наиболее распространенными платформами доставки являются векторы на основе серотипа AAV2. Другие платформы также находятся в стадии разработки. Например, серотипы AAV9 и AAVRh.10 способны преодолевать гематоэнцефалический барьер (BBB) и обеспечивать экспрессию трансдуцированных генов в нейронах и глиоцитах при внутривенном введении [46]. В настоящее время rAAV-векторы успешно применяются для лечения следующих заболеваний: гемофилии, наследственных заболеваний глаз и некоторых нейродегенеративных заболеваний [47-49].

Лентивирусные векторы (LV) являются модификацией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ); в процессе модификации их способность заражать, реплицироваться и вызывать заболевания была снижена, а экспрессия перенесенной плазмиды - повышена [50]. По сравнению с rAAVs, LV вставляют в геном экзогенную ДНК, что, вероятно, приводит к геномным мутациям, и обладают более высокой иммуногенностью. Однако LV способны загружать более крупные последовательности и могут использоваться для избыточной экспрессии крупных белков и CRISPR-скрининга [44]. Тем не менее, применение LV для генетической модификации клеточных продуктов (т.е. стволовых клеток и иммуноцитов) ex vivo или путем локального введения, такого как интрацеребровентрикулярная инъекция и стереотаксическая инъекция, в иммунологически привилегированных местах привело к мощной эффективности метода [48, 50]. В настоящее время LVs хорошо зарекомендовали себя в клинической практике первичных иммунодефицитных заболеваний, гемоглобинопатий и в клинических испытаниях нейродегенеративных заболеваний [50].

Помимо своей основной роли в качестве векторов для заместительной генотерапии, вирусные векторы могут также доставлять инструменты, включая систему CRISPR и некодирующие РНК. Таким образом, вирусы играют незаменимую и многообразную роль в генотерапии.

Несмотря на наличие оптимизированных с точки зрения стратегии классических вирусных векторов, а также клеточных продуктов, постоянно ведутся поиски более удобных и воспроизводимых продуктов.

Системы липидных наночастиц (LNP) являются первыми не-биологическими или химическими продуктами генотерапии, позволяющими осуществлять прямую доставку модифицирующих средств. Процесс производства LNPs прост и стандартизирован, не требует соблюдения требований биобезопасности [51]. Популярность этой технологии, являющейся основной платформой доставки мРНК-вакцины COVID-19, стремительно возросла за последние два года [52]. Задолго до появления исследований, посвященных мРНК-вакцине COVID-19, LNP-системы уже показали свою перспективность для генной медицины, в частности, для доставки siRNA, мРНК и плазмид [53]. В настоящее время их доступность возросла в области генотерапии. Недавно Rizvi et al. создали транзиентно модифицированные мРНК-LNPs, экспрессирующие в гепатоцитах фактор роста гепатоцитов (HGF) и эпидермальный фактор роста (EGF). Эти LNPs эффективно индуцировали регенерацию печени в мышиных моделях хронического неалкогольного жирового повреждения печени и острого повреждения печени, вызванного acetaminophen [54]. Kenjo et al. разработали рН-зависимый ионизируемый липид, который в сочетании с мРНК Cas9 и однонаправленной РНК (sgRNA) превратили в LNPs, избирательно воздействующие на скелетные мышцы. Он вызывал устойчивый пропуск экзонов генома и восстанавливал белки дистрофина в мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна [55]. По сравнению с инъекциями rAAV, LNP показал более низкую иммуногенность даже при многократных внутримышечных инъекциях. Кроме того, Rurik et al. создали транзиторную антифибротическую конструкцию химерного антигенного рецептора (CAR), кодируемую модифицированной мРНК, доставленной с помощью LNPs нацеленных на CD5, для получения CAR Т-клеток in vivo, что позволило уменьшить фиброз и ухудшение сердечной функции, вызванные повышенной постнагрузкой сердца в мышиной модели [56]. Кроме того, может быть разработан аналог липосомной наночастицы [57]. Несмотря на то, что эффективность, таргетные возможности и воспроизводимость LNPs, как видно из приведенных выше исследований, были повышены, остается возможность их совершенствования и расширения для лечения других патологических процессов.

Наночастицы золота (AuNPs) также рассматриваются в качестве перспективного вектора для доставки CRISPR-инструментов in vivo, однако их разработка пока находится на ранней стадии [51].

Virus-like particles (VLPs) представляют собой само-собирающиеся структуры, которые по форме и размерам близко напоминают вирусную частицу, но не способны к репликации, так как не несут генетического материала [58]. VLPs являются перспективным инструментом для создания вакцин, а также в настоящее время рассматриваются как потенциальное средство доставки в области генотерапии [58]. В настоящее время исследования VLPs для генотерапии сосредоточены на выборе референтных вирусных капсидов и оптимизации стратегий обогащения. Недавно Ling et al. разработали систему mLP-CRISPR, в которой лентивирусные частицы, несущие мРНК, доставляют мРНК, кодирующие SpCas9 и направляющую РНК (gRNA), одновременно по модульному принципу, аналогичному классическому процессу упаковки вирусов. Применение mLP-CRISPR, направленнs[ против фактора роста эндотелия сосудов A (Vegfa), в мышиной модели возрастной влажной макулярной дегенерации позволило снизить экспрессию Vegfa на 44% и уменьшить неоваскуляризацию хориоидальной ткани после однократной субретинальной инъекции [59]. Учитывая этот вывод, Yin et al. непосредственно нацелились на геном вируса простого герпеса 1 (HSV-1), используя стратегию mLP-CRISPR (обозначенную как HSV-1-erasing lentiviral particles; HELP). Это исследование наглядно продемонстрировало высокий терапевтический потенциал CRISPR для лечения инфекционных заболеваний путем нацеливания на геном вируса [60]. Хотя модифицированные VLPs показали хорошую эффективность при лечении заболеваний глазного яблока, их избирательность, иммуногенность и воспроизводимость еще предстоит изучить, поскольку иммунный механизм глаза отличается от других органов. Для оптимизации эффективности средств доставки in vivo Banskota et al. использовали стратегию рибонуклеопротеидов (RNPs) для проведения редактирования генов. После отбора нескольких поколений они рекомендовали четвертое поколение инженерных вирусоподобных частиц (eVLP), обеспечивающих более чем 50%-ный нокдаун мишени и не обнаруживающих вне-целевых эффектов при однократном введении [61].

Extracellular vehicles (EVs) применяются для доставки CRISPR-инструментов in vitro и лекарств in vivo. В большинстве прошлых исследований, посвященных использованию EVs в генотерапии, применялись siRNAs и микроРНК (miRNAs) [62]. В настоящее время для доставки CRISPR-инструментов in vivo описано больше подходов, например, Cas9-sgRNA с использованием РНП (см. раздел VLP) [63]. Транзитивность EVs для эффекторов CRISPR, особенно эффекторов редактирования генома, является преимуществом, поскольку снижает вероятность off-target и иммунных реакций [63]. Однако при этом возникают проблемы с эффективностью и результативностью. На ранней стадии разработки Kim et al. сообщили об экзосомной доставке CRISPR/Cas9 in vivo, полученной из раковых клеток SKOV3. По сравнению с контрольными экзосомами, полученными из эпителиальной клеточной линии HEK293, экспериментальные экзосомы, полученные из раковых клеток SKOV3 и несущие CRISPR/Cas9, не только эффективно ингибировали поли (ADP-рибоза) полимеразу-1 (PARP-1), индуцированный апоптоз при раке яичников, но и преимущественно накапливались в очаге поражения в ксенотрансплантационной мышиной модели SKOV3, обеспечивая тропизм-зависимое нацеливание [64]. Для повышения эффективности доставки EVs Yao et al. разработали механизм активного обогащения, использующий взаимодействие между РНК-аптамером и аптамер-связывающим белком (ABP). Этот подход позволил усовершенствовать стратегию, основанную на использовании RNPs. Они модифицировали sgRNA с помощью RNA aptamer com и модифицировали оба конца tetraspan-белка CD63, обычно экспрессирующегося на поверхности экзосом, с помощью com-связывающего ABP Com таким образом, com-модифицированная Cas9-sgRNA RNP обогащалась слитым белком CD63-Com за счет взаимодействия Com/com. После проверки результатов in vitro они далее наблюдали высокую экспрессию дистрофина у мышей del52hDMD/mdx благодаря EV-доставке RNPs, нацеленных на экзон 53 DMD [63]. Кроме того, были предложены и другие интеллектуальные модификации, позволяющие сделать EVs более доступными для генотерапии [65-68].

В 2021 г. Zhang et al. разработали принципиально новую систему доставки мРНК, получившую название selective endogenous encapsidation for cellular delivery (SEND). Она была реализована путем модульной инженерии PEG10, котрансфицированного грузовой РНК и плазмиды fusogen, для упаковки, секреции и доставки [69]. Хотя в их публикации не было приведено результатов in vivo, PEG10 (гомолог капсидного белка млекопитающих, проверенный на мышах и людях) обладает высокой гистосовместимостью и низкой иммуногенностью. Таким образом, применение SEND in vivo в ближайшее время может произвести глубокое влияние.

Генетически модифицированные клеточные продукты считаются относительно более стабильными, чем вирусные векторы. Происхождение этих клеток может быть аутогенным или аллогенным, но применимость аутогенных продуктов шире, чем аллогенных, из-за гистосовместимости. Поскольку данный подход зародился в технологии трансплантации костного мозга, предыдущие исследования, в которых геном клеток модифицировался ex vivo, были сосредоточены на заболеваниях периферической гемолимфы. В 2017 году FDA одобрило CAR T-клетки - клеточный продукт, генетически модифицированный [70] для усиления его действия на опухоли гемолимфы, что стало очередной вехой в генотерапии. В дальнейшем были разработаны технологии CAR, включающие естественные клетки-киллеры (NK-клетки), естественные -киллеры Т клеток (NKT-клетки), макрофаги [71-73] и другие модификации иммунных клеток, даже в сочетании с CRISPR-редактированием [74] и целенаправленным воздействием на другие характерные молекулярные маркеры.

Клетки, генетически модифицированные в клеточные продукты, в основном состоят из иммунных клеток и стволовых клеток. Одним из представителей модифицированных иммунных клеток является CAR T. Лечение CAR T не только предоставило больше клинических возможностей для лечения опухолей гемолимфы, но и открыло путь к таргетной терапии солидных опухолей в контексте прецизионной медицины [75-77]. Теоретически наличие характерных молекулярных маркеров может направить CAR-структуру не только на опухоли, но и на другие патологические процессы. Например, CAR T, нацеленные на белок активации фибробластов (FAP), были разработаны для лечения фиброза миокарда [56]. В скором времени CAR-конструкция может быть направлена даже на характерные молекулярные маркеры старения для лечения заболеваний, связанных со старением. Модификации стволовых клеток были направлены в основном на гемопоэтические стволовые клетки (HSCs) и мезенхимные стволовые клетки (MSCs). При гемоглобинопатиях патологический гемоглобин может быть заменен нормальным гемоглобином, полученным из аутогенных HSCs, скорректированных по генам ex vivo, что решает проблему тканевого соответствия [50]. Так, в клинике успешно применяются HEMACORD® и другие препараты стволовых клеток пуповинной крови. Для лечения злокачественных опухолей клетки MSCs обладают хорошей гистосовместимостью, низкой иммуногенностью и легко получаются; их способность предоставлять жильё (homing) и к миграции в опухоль, а также естественные противоопухолевые свойства были продемонстрированы на различных животных моделях [78]. Инженерия может еще больше повысить их способность воздействовать на специфические опухоли. В недавнем до-клиническом исследовании в качестве последовательной терапии после резекции глиобластомы (GBM) использовались сконструированные аллогенные MSCs [79]. Эти MSCs были сконструированы с помощью LV-инфекции и условно экспрессировали TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL), который является лигандом CD146, чтобы увеличить ориентацию и тропизм MSCs к GBM. Далее моделируются клинический около-операционный процесс, процесс подготовки и интраоперационного внутриопухолевого введения на ксенотрансплантатах GBM, полученных на мышах. Выживаемость этих мышей в данном исследовании была продлена, что свидетельствует о безопасности и эффективности терапии с использованием преобразованных MSCs. Кроме того, в клиническую практику постепенно могут войти и другие источники стволовых клеток, в том числе персонализированные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), например, полученные из биоптата кожи [80].

Операции ex vivo с клетками (часто с использованием вирусного вектора, в основном LV) позволили проводить более смелые модификации, заменяя изначально поврежденные клетки или усиливая их иммунную роль. С учетом особенностей, присущих иммунным и стволовым клеткам, генетически модифицированные клеточные продукты могут позволить очищать и замещать стареющие клетки. Однако безопасность и эффективность этих продуктов для широкого применения остаются во многом неизвестными.

По мере развития исследований в области старения и совершенствования технологий секвенирования [81-86] выявляется все большее число генов, связанных со старением. Были проведены детальные сравнения между различными группами тканей и клеток, находящихся на разных стадиях и в разных пространствах. Возможно, в будущем будут идентифицированы миллионы генов, связанных со старением [87], проявляющих положительную и отрицательную корреляцию со старением. Более того, в некоторых исследованиях отмечается совпадение спектров возрастных или связанных со старением заболеваний и связанных со старением генов [87], что позволяет предположить, что разработка связанных со старением генов в качестве терапевтических мишеней может иметь большой потенциал (рис. 2).



Figure 2. Schematic of the cellular components of proteins encoded by representative aging-related genes.

Ген теломеразы. Теломеры - это структуры на концах хромосом, которые необходимы для поддержания длины теломерной ДНК и сохранения стабильности хромосом. В хромосомах человека последовательности ДНК теломер представляют собой некодирующие 5'-TTAGGG-3' повторы длиной около 15-20 кб; теломеры поддерживаются за счет de novo добавления с помощью теломеразы [88]. Ген теломеразной обратной транскриптазы (TERT) кодирует каталитический белок TERT, являющийся субъединицей теломеразы [89, 90]. Исследования теломер и теломеразы проводились с самого начала изучения старения. Многие исследования показали, что дефекты теломер или теломеразы оказывают существенное влияние на развитие заболеваний, связанных со старением [91-96]. Современные представления о TERT позволили нацелить ген TERT на лечение заболеваний человека. В 1999 г. Bodnar и его сотрудники трансдуцировали различные TERT-отрицательные эндотелиальные клетки человека вирусом миелопролиферативной саркомы или плазмидным вектором, несущими hTERT, in vitro. Разница между отрицательными контрольными клонами и клонами, экспрессирующими hTERT, послужила первым убедительным доказательством влияния TERT на замедление старения и удлинение теломер при сохранении нормального кариотипа [97]. В последующих исследованиях на других типах клеток с использованием аналогичных методов высокая активность и расширенный репликативный потенциал теломеразы способствовали дальнейшим исследованиям.

В некоторых экспериментах in vivo уже были получены данные о том, что генотерапия TERT демонстрирует потрясающую эффективность при лечении различных заболеваний. Maria A. Blasco и ее сотрудники добились больших успехов в изучении различных заболеваний на мышиных моделях с помощью замены генов (табл. 2). В своих ранних исследованиях Bernardes de Jesus et al. предварительно ввели с помощью AAV-генома Tert 12- и 24-месячным мышам и обнаружили заметное улучшение различных молекулярных биомаркеров, связанных со старением. Интересно, что по сравнению с контрольной группой с каталитически неактивным TERT наблюдалось также увеличение средней продолжительности жизни[98]. Позднее Bar et al. сконструировали вектор AAV9, экспрессирующий Tert в кардиомиоцитах, для лечения сердечной недостаточности после инфаркта миокарда (MI). Внутривенное введение этого вектора в мышиные модели инфаркта миокарда показало, что у мышей с вектором, экспрессирующим TERT, наблюдалось меньшее повреждений сердечных показателей как структуры, так и функции, снижение смертности и улучшение биомаркеров [99]. В последующем исследовании Bar et al. пришли к выводу, что высокие дозы AAV9-Tert могут воздействовать на костный мозг в двух различных моделях апластической анемии, вызванной короткой теломерой (Trf1- и Tert-дефицитные мыши). В частности, оказалось, что гемопоэтические стволовые клетки костного мозга восстановили свои функции, апластический фенотип был устранен, а длина теломер в клетках периферической крови и костного мозга, показатели крови и выживаемость были улучшены [100]. Впоследствии Povedano et al. исследовали генотерапию TERT с помощью аналогичного метода на мышиной модели фиброза легких, вызванного низкими дозами блеомицина [101]. Whittemore et al. также применили этот метод в мышиной модели нейродегенерации, обусловленной короткими теломерами [102]. В обеих этих моделях наблюдалось оптимистичное фенотипическое улучшение. Кроме того, в исследованиях сообщалось о повышении уровня экспрессии гена TERT под действием активатора теломеразы (TA), который оказывает терапевтический эффект. Например, Wan et al. вводили порошок TA-65 трансгенной мышиной модели, избыточно экспрессирующей человеческий α-синуклеин дикого типа, который индуцировал болезнь Паркинсона, и наблюдали увеличение экспрессии TERT, улучшение двигательной функции и усиление аутофагии [103]. Кроме того, в указанных исследованиях при повышении экспрессии TERT не наблюдалось тенденции к развитию злокачественных опухолей, что служит основанием для дальнейших исследований и продвижения в клинических испытаниях.

Table 2 Representative anti-aging mammalian experiments of gene replacement therapy

Помимо замены гена TERT, уровень экспрессии эндогенной TERT/теломеразы можно относительно точно регулировать путем модификации с помощью широко распространенноq технологии CRISPR (табл. 3). В настоящее время эти исследования проводятся в основном на злокачественных опухолях, главным образом с учетом безопасности пациентов. Аномальная активация TERT/теломеразы, позволяющая избежать истощения теломер и клеточного старения, является основой для иммортализации клеток и их злокачественной трансформации [104, 105]. Поэтому ингибирование TERT/теломеразы в опухолевых клетках [106] или стимулирование экспрессии ее антагониста являются достаточно эффективными методами лечения. Dai et al. представили систему экспрессии теломеразой активируемых генов (Tage), состоящую из искусственного транскрипционного фактора теломерных повторов и эффекторного теломеразно-активируемой Cas9, которые доставлялись с помощью rAAV. Эта система эффективно обрезает аномальные теломеры и вызывает повреждение ДНК в клетках злокачественных опухолей, но не затрагивает нормальные ткани in vitro и in vivo [107]. Li et al. объединили редакторы адениновых оснований для инактивации CRISPR/Cas9 у Campylobacter jejuni. С помощью sgRNA-направленного редактирования одного основания мутация C->T промотора TERT, расположенная на расстоянии -124 перед стартовыми кодонами, была исправлена на нуклеодит C. Эта коррекция блокировала связывание членов семейства транскрипционных факторов E26, подавляя аномальную активацию промотора TERT и, в конечном итоге, вызывая старение и остановку пролиферации в глиобластоме [32]. Кроме того, имеются сообщения о лечении анти-TERT анти-смысловыми олигонуклеотидами (ASO) [108].

Table 3 Representative anti-aging mammalian experiments of gene therapy through the CRISPR technology modifications.

При генотерапии теломеразой эффекты активации и ингибирования, на первый взгляд, противоречат друг другу, но отражают временную и пространственную специфику экспрессии гена. Теломераза относительно молчалива в большинстве нормальных соматических клеток, но активируется в 90% раковых клеток; поэтому терапевтические стратегии направлены на активацию экспрессии теломеразы в нормальных соматических клетках и ингибирование ее в злокачественных клетках. Однако это обусловливает более жесткие требования к таргетингу при разработке терапевтических стратегий.

После проведения предварительных экспериментов на млекопитающих некоторые исследователи приступили к клиническим испытаниям (табл. 4). Препарат LGT, представляющий собой вектор AAV-hTERT, в 2019 году прошел I фазу клинических испытаний по трем направлениям: 1) таргетное лечение старения путем внутривенного введения (NCT04133649) [109], 2) таргетное лечение болезни Альцгеймера путем внутривенного введения в сочетании с интратекальным введением (NCT04133454) [110] и 3) таргетное лечение критической ишемии конечностей путем внутривенного введения (NCT04110964) [111]. Эти клинические исследования должны были завершиться к январю 2021 г., однако данные о них пока не опубликованы.

Table 4 Existing interventional clinical trials of aging-related genes for aging- or age-related diseases.

APOE. В настоящее время признано, что ген APOE имеет устойчивую ассоциацию с продолжительностью жизни человека [112]. Белок аполипопротеин Е (APOE) является ключевым регулятором липидного обмена и широко распространен в печени, почках, жировой ткани и мозге [113]. Аллель ε4 достоверно отрицательно прогнозирует продолжительность жизни, а генотипы ε2ε2 или ε2ε3 достоверно положительно прогнозируют продолжительность жизни[112]. Более того, по данным многочисленных крупномасштабных геномных ассоциативных анализов (GWAS) и геномных ассоциативных мета-анализов, аллель APOE ε4 является самым сильным генетическим фактором риска развития спорадической болезни Альцгеймера (AD), а аллель APOE ε2 - самым сильным наследственным фактором защиты. В одном из недавних исследований было показано, что APOE функционирует как дестабилизатор гетерохроматина в опосредовании клеточного старения [114]. Однако механистическая роль этого фактора в старении и AD еще далеко не ясна. Современные исследования связи APOE с патогенезом болезни Альцгеймера касаются β-амилоида (Aβ), нейрофибриллярной дегенерации tau, реакций микроглии, астроцитов и BBB [115, 116]. Эти патологические процессы тесно связаны с когнитивными нарушениями, что в будущем может привести к созданию терапевтической мишени. Терапевтическое применение APOE в мышиных моделях человеческого аллеля APOE гораздо более разнообразно по сравнению с описанными выше генами и кодирующими их продуктами, включая увеличение или уменьшение экспрессии APOE, усиление его липидирования и блокирование взаимодействия между APOE и Aβ [117, 118]. Тем не менее эти методы не могут заменить успешного переключения аллелей APOE с помощью стратегий генотерапии в нейронах и глиальных клетках [119]. Переключение изоформ с APOE ε4 на APOE ε2 с помощью векторов AAVrh.10h APOE ε2 было изучено в клиническом исследовании I фазы (NCT03634007) [120] (табл. 4). На сегодняшний день остается актуальным более детальное изучение механизмов его действия, ассоциаций с другими заболеваниями, связанными со старением, а также применение технологии редактирования CRISPR/Cas9 в мышиных моделях.

KL, KLB и семейство FGF. KL, еще один классический ген, связанный со старением, имеет гораздо более короткую историю исследований, чем ген TERT, - чуть более двадцати лет. В 1997 году японские ученые Kuro-o et al. сообщили о мутантных мышах с дефицитом этого гена. У этих мышей наблюдался фенотип, сходный с человеческим преждевременным старением с дегенерацией и отказом многих органов [121], однако спасение KL задерживало их старение и увеличивало продолжительность жизни на 30% [122]. Дальнейшие исследования показали, что белки Klotho, кодируемые KL и KLB, представляют собой семейство белков, в том числе α-Klotho и его гомолог β-Klotho, которые являются важнейшими компонентами комплекса рецепторов эндокринного фактора роста фибробластов (EGF) (FGFR), обеспечивая высокое сродство при связывании соответствующего типа FGF. KLB, кодирующий β-Klotho, экспрессируется в основном в адипоцитах, печени, семенниках и желудке, однако этот ген и его белок изучены недостаточно. KL кодирует α-Klotho, и именно на эти гены и белки, связанные со старением, мы обычно ссылаемся, когда обсуждаем klotho. Экспрессия KL особенно высока в почках. Он может транскрибироваться в два различных транскрипта. Один из них транслируется и экспрессируется на клеточной мембране (m-KL). Это основная форма, которая взаимодействует с FGF23 и FGFR для регуляции фосфатного гомеостаза. Дефекты m-KL могут приводить не только к фенотипам, связанным с хронической болезнью почек (CKD), но и к мультисистемному синдрому старения с вовлечением центральной нервной системы, дыхательной системы, репродуктивной системы и других систем [123-125]. m-KL может расщепляться металлопротеазами Adam 10 или Adam 17, образуя другую растворимую форму (s-KL). Другой транскрипт транслируется в другую растворимую форму с характерной С-концевой последовательностью и секретируется внеклеточно [126, 127]. s-KL играют сложную роль в гуморальных и даже дальних эндокринных процессах через различные рецепторы и сигнальные пути, включая ингибирование сигнального пути инсулин/IGF-1, сигнального пути WNT, p53/p21, повышение уровня фосфорилирования forkhead box подгруппы О (FOXO), опосредование фосфорно-кальциевого обмена, а также оказание различных антивозрастных эффектов, включая антиокислительный стресс, противодействие клеточному старению, стимулирование аутофагии, противодействие истощению стволовых клеток и др. [128, 129]. Кроме того, другие исследователи утверждают, что FGF может быть основой антивозрастных эффектов Klotho [130]. Kuro-o et al. также обобщили их эффекты как "эндокринную ось белков FGF-Klotho" [123].

Изучение конкретных моделей млекопитающих (в основном мышиных) заболеваний, связанных со старением, выявило терапевтический эффект усиления экспрессии KL при нейродегенеративных заболеваниях, хронических заболеваниях почек, сердечно-сосудистых заболеваниях и др.

В более ранних исследованиях KL изучалась его роль в нейродегенеративных заболеваниях. Dubal et al. скрестили трансгенных мышей, избыточно экспрессирующих KL, с трансгенными мышами AD с белком-предшественником амилоида человека (hAPP)-J20. Среди потомства, экспрессировавшего hAPP и Klotho, наблюдалось снижение уровня преждевременной смертности, ослабление дисфункции сети и увеличение постсинаптической плотности субъединицы GLUN2B рецептора N-метил-D-аспартата (NMDAR), связанного с обучением и памятью [131]. Zeng и Zhao et al. intracerebroventricularly вводили лентивирусы, кодирующие Klotho, трансгенным мышам, моделирующим AD, содержащей белок-предшественник амилоида/пресенилин 1 (APP/PS1), и наблюдали клиренс Aβ путем аутофагии и улучшение когнитивных функций у мышей [132] (табл. 2). В них подробно исследованы механизмы различных клеточных фенотипов, включая когнитивную функцию, Aβ-связанную нейропатологию и микроглиальную трансформацию. И переноса Aβ проводилось с помощью лентивирусов, несущих полноразмерную кДНК мышиного Klotho [133], что еще больше подтверждает использование KL в качестве терапевтической мишени.

В исследованиях заболеваний почек Xu et al. соединили каталитический домен TET3 (катализирующий гидроксиметилирование метилированной ДНК) с высокодостоверной неактивной Cas9 (dHFCas9) и ввели эту комбинацию в мышиную модель односторонней обструкции мочеточника (UUO) при повреждении почек (табл. 3). Под руководством Rasal1-sgRNA и KL-sgRNA была восстановлена экспрессия генов и ослаблен фиброз почек, что непосредственно продемонстрировало роль гена KL в поддержании функции почек [41]. Исследования по применению в сердечно-сосудистых заболеваниях продвинулись не так далеко, как в нейродегенеративных заболеваниях и болезнях почек. Olejnik et al. последовательно исследовали влияние Klotho на ишемически-реперфузионное повреждение in vitro в кардиомиоцитах человека и на модели перфузии изолированного сердца Лангендорфа крысы. Лечение белком klotho способствовало повышению жизнеспособности и метаболической активности кардиомиоцитов, что подтверждает целесообразность использования klotho и KL в качестве направления терапии при некоторых сердечно-сосудистых заболеваниях [134]. Кроме того, некоторые исследования косвенно указывают на потенциальную роль белка Klotho в развитии заболеваний, связанных со старением. Например, усиление взаимодействия FGF21 с его ко-рецептором β-Klotho с помощью вектора AAV-FGF21 запускает сигнальные пути ERK1/2 и MAPKs для борьбы с метаболическими заболеваниями [135, 136].

До-клинические исследования показали, что Klotho обладает широкими терапевтическими возможностями для лечения различных заболеваний, связанных со старением. Однако интервенционные клинические испытания для оценки клинического потенциала KL и Klotho не проводились.

FOXOs. Влияние гена FOXO на продолжительность жизни было обнаружено при сравнении долгожителей из Японии (95-100 лет) и типичных пожилых людей (смерть в возрасте до 81 года) [137]. Семейство белков FOXO представляет собой семейство транскрипционных факторов, которые активируются при стрессовых обстоятельствах, включая голодание, дефицит энергии, окислительный стресс и повреждение ДНК; эти транскрипционные факторы затем способствуют пост=трансляционным модификациям, таким как фосфорилирование, монобициклирование, метилирование и гликозилирование [138], регулируя нижележащие гены, вовлеченные в клеточный цикл, гибель клеток, аутофагию, клеточный метаболизм, клеточные антиоксиданты и т.д.[139, 140]. Среди членов семейства FOXO у млекопитающих встречаются FOXO1, FOXO3, FOXO4 и FOXO6 [139]. В нейрональных стволовых клетках FOXOs необходимы для поддержания состояния покоя и очистки от реактивных форм кислорода (ROS), а в зрелых нейронах транскрипционная активность FOXO критична для защиты аксонов от возраст-зависимой дегенерации [138, 141]. Исследования нейродегенеративных заболеваний показывают, что снижение экспрессии FOXO тесно связано с нарушением когнитивных и двигательных функций и способствует прогрессированию болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, болезни Хантингтона и др. [138, 140, 141]. В злокачественных опухолях, хотя FOXOs в основном оказывают противоопухолевое действие [142], в некоторых случаях они могут способствовать развитию опухолевого генеза, пролиферации и лекарственной устойчивости, например, способствовать прогрессии различных сарком и поддерживать лейкемические инициирующие клетки (LISs), что приводит к лекарственной устойчивости после ингибирования рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) при HER2(+) раке молочной железы [143]. Кроме того, FOXOs модулируют метаболизм и улучшают инсулинорезистентность [143]. Современные исследования FOXOs сосредоточены на изучении механизмов, лежащих в основе заболеваний, связанных со старением, и в настоящее время разрабатывается несколько моделей мышей с нокаутом FOXO [144, 145].

SIRT. В настоящее время у человека известно семь генов SIRT (SIRT1-7). Кодируемый ими белок семейства сиртуинов является достаточно четким фактором, негативно связанным со старением, и его функция была впервые продемонстрирована на дрожжах. У млекопитающих семейство белков сиртуинов представляет собой группу гистоновых деацетилаз (HDAC) III класса, гомологичных белку молчащего информационного регулятора 2 (Sir2) у дрожжей. Эти гены кодируют белки с различными функциями, сродством к субстратам и субклеточной компартментализацией. Однако все эти белки имеют сходные каталитические домены и используют NAD+ в качестве кореактивного субстрата для регуляции эпигенетической модификации генов [146]. В настоящее время эти семь белков изучены в разной степени. Наиболее хорошо изучен SIRT1. Он играет важнейшую роль в митохондриальном сигнальном пути, хроническом воспалении, метаболизме и взаимодействии с множеством других сигнальных путей, включая NF-κB, AMPK, mTOR, P53, PGC1α и FOXOs [147]. SIRT6 находится в центре внимания при старении, поскольку он регулирует стабильность генома и эпигенома [148]. SIRT4 участвует в поддержании катаболизма глутамина и гомеостаза аденозинтрифосфата (АТФ) [149]. SIRT7, самый недавно идентифицированный сиртуин млекопитающих, по имеющимся данным, регулирует ответ на повреждение ДНК и репарацию ДНК [150]. Функции SIRT2, SIRT3 и SIRT5, напротив, остаются не до конца ясными. Исследования SIRT переходят от знакомства с сигнальными путями к их использованию в моделях нейродегенерации, нефропатии, сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний у млекопитающих [8, 151-155], а некоторые из этих белков проявляют противоопухолевый эффект [152]. Соответственно, появились и прошли клинические испытания некоторые препараты для регуляции этих сигнальных путей, такие как SRT2104 (селективный малый молекулярный активатор SIRT 1) [156] и MIB-626 (форма никотинамида мононуклеотида (NMN)), повышающие уровень NAD+ [157]. Широко распространено мнение, что среди перечисленных заболеваний SIRT наиболее тесно связана с сердечно-сосудистыми и метаболическими заболеваниями. Поэтому генотерапия с использованием SIRT начинается именно с этих заболеваний и находится в стадии разработки. Sun et al. создали условную модель knock-in прогерина (LmnaG609G), индуцированного Tie2-Cre, для лечения синдрома Хатчинсона-Гилфорда (HGPS) [158]. Они наблюдали связанные с SIRT7 дефекты микрососудов и воспалительный ответ, а также облегчили фенотип заболевания и увеличили продолжительность жизни мышей с прогерией путем доставки SIRT7 через AAV1 (табл. 2). Кроме того, Han et al. проанализировали данные из базы данных Oncomine и клинических образцов, подтвердив экспрессию SIRT6 и его потенциальный механизм в прогрессировании рака простаты. В итоге они заблокировали SIRT6 с помощью сконструированных экзосом, доставляющих siRNA, что позволило эффективно подавить рост и метастазирование опухоли на ксенотрансплантированных опухолевых моделях мышей [159]. Ожидается, что дальнейшие исследования будут продолжены in vivo.

VEGF. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) оказывает широкое влияние на весь организм человека, а формирование и функционирование кровеносных сосудов в значительной степени зависит от VEGF. VEGF отрицательно ассоциирует со старением, а высокая экспрессия VEGF оказывает защитное действие на сердечно-сосудистую систему [160]. Однако во многих исследованиях он рассматривается как потенциальная мишень при злокачественных опухолях и считается способствующим фактором [161]. Поэтому остается открытым вопрос о том, будет ли он индуцировать рак при применении anti-aging генотерапии. Grunewald et al. провели эксперимент, основанный на гипотезе, что сосудистое старение является основополагающим фактором старения организма. В ходе эксперимента, продолжавшегося более 30 месяцев, было отмечено увеличение продолжительности жизни и физиологических функций после применения системы усиления функции трансгенного VEGF и AAV-ассистированной трансдукции VEGF. Кроме того, был раскрыт механизм влияния VEGF на множество систем органов (за счет возрастного увеличения decoy-рецепторов), что подтверждает первоначальную гипотезу [162] (табл. 2). Таким образом, VEGF, по-видимому, играет парадоксальную роль в старении, подобно гену теломеразы, что побуждает к дальнейшему систематическому и тщательному изучению потенциальных методов лечения.

Генная терапия вызывает споры с момента своего появления. В настоящее время вопрос перешел от того, следует ли развивать генотерапию человека, к тому, как она должна развиваться, контролироваться и приносить предварительный успех. 13 сентября 1999 года 18-летний Jesse Gelsinger умер от множественной органной недостаточности через 4 дня после инъекции носителя аденовируса. Это событие, предположительно вызванное чрезмерной иммунной реакцией на аденовирусный носитель, послужило толчком к углубленному и систематическому изучению генотерапии, а также к адекватному пониманию ее ключевых проблем. Таким образом, последовательные стратегии, использующие обновленные препараты генотерапии, постоянно повышали их безопасность и целесообразность. В настоящее время стратегия замены генов, опосредованная rAAV, представляется наиболее перспективной для применения в клинической практике для лечения заболеваний, связанных со старением. Этот метод не изменяет последовательность и структуру генома, что исключает введение факторов нестабильности генома и повышает безопасность. Поэтому rAAV-опосредованное замещение генов широко используется в клинических испытаниях различных методов генотерапии, включая старение, но не ограничиваясь им. Более того, многочисленные и новые серотипы rAAV позволяют нацеливать их на анатомически и функционально различные части тела. Хотя LNPs и другие невирусные носители также обладают хорошей безопасностью и, вероятно, будут широко применяться в клинической практике, они все еще находятся в стадии разработки для достижения более высокой тканевой или органной специфичности, и для достижения большей реализуемости требуются сложные конструкции. Для решения различных задач можно применять стандартизированные процедуры, позволяющие регулировать качество лечения. Таким образом, rAAV-опосредованное замещение генов имеет более широкие перспективы применения. В настоящее время примерами применения этой стратегии являются препараты Zolgensma® для лечения спинальной мышечной атрофии и Luxturna® для лечения дистрофии сетчатки, связанной с RPE65, оба из которых одобрены для включения в перечень, что свидетельствует о безопасности и целесообразности применения этой стратегии в будущем.

Генотерапия, особенно в области старения, дает новые надежды на лечение заболеваний. Однако не все гены, связанные со старением, могут стать мишенями. Удовлетворительная эффективность достигается только при сочетании их с адаптивной операционной стратегией и эффективными носителями. Кроме того, некоторые гены могут быть просто предикторами прогноза или способны отсеивать эффективные препараты для лечения заболеваний [163-166]. Чтобы стать терапевтической мишенью, ген-кандидат должен иметь относительно четкую и ясную роль. При этом обязательно должен быть хороший синергизм с другими генами и сигнальными путями, чтобы избежать последующей избыточной сигнализации или сигнальных каскадов [44, 107], которые приводят к неконтролируемым побочным реакциям. Несмотря на то, что многие виды генотерапии оказались эффективными в моделях млекопитающих, наиболее используемой стратегией по-прежнему остается генная заместительная терапия с использованием векторов rAAV. Совершенствование стратегий и препаратов генотерапии позволит повысить ее эффективность и снизить количество побочных реакций. Мы ожидаем, что со временем появятся новые испытания и продукты. Кроме того, кажущийся парадокс участия гена теломеразы и VEGF в старении позволяет лучше понять целевую направленность и целостную перспективу. Будущие исследования должны быть направлены на выбор и применение генов, связанных со старением, разработку оптимальных методов лечения, а также на повышение таргетности, воспроизводимости и эффективности в клинической практике. Несмотря на то, что перевод прикладных разработок со стенда на стол может быть медленным, пациенты, страдающие от возрастных заболеваний, в конечном итоге могут быть омоложены.