Целенаправленное редактирование оснований митохондриальной ДНК млекопитающих (мтДНК) - мощная и универсальная технология,^1-11 которая может быть использована для моделирования митохондриальных генетических заболеваний в клеточных линиях и у животных^12-19 и для разработки новых методов терапии, которые могут быть использованы для исправления патогенных мутаций в будущем.^20,21 Программируемые деаминазы, состоящие из индивидуального ДНК-связывающего белка и nucleobase деаминазы, позволяют целенаправленно редактировать мтДНК.^17,22-29 Существует два типа программируемых деаминаз, которые были разработаны для редактирования генома органелл: редакторы цитозиновых оснований,^17,22,24-32 включая DddA-производные редакторы цитозиновых оснований (DdCBEs) и деаминазы с цинковыми пальчиками, которые вызывают редактирование C-to-T (=G-to-A на другой нити ДНК), и редакторы адениновых оснований,²³ называемые транскрипционными активатор-подобными эффекторами (TALE)-связанными деаминазами (TALEDs), которые катализируют редактирование A-to-G (=T-to-C). Эти редакторы оснований связываются с целевым участком ДНК в митохондриальном геноме и деаминируют цитозин или аденин с образованием урацила или гипоксантина, соответственно, которые сопрягаются с аденином или цитозином, соответственно, во время репликации или репарации ДНК. В результате редакторы оснований цитозина или аденина целенаправленно вызывают преобразования C-to-T или A-to-G, соответственно. Поскольку большинство митохондриальных генетических заболеваний вызвано переходными мутациями (пурин в пурин или пиримидин в пиримидин), а не трансверсионными мутациями (пурин в пиримидин или наоборот), то редакторы цитозиновых и адениновых оснований, вместе могут исправить ~85% патогенных мутаций мтДНК, включая те, которые связаны с наследственной зрительной нейропатией Leber (LHON), митохондриальной энцефаломиопатией, молочнокислым ацидозом, инсультоподобными эпизодами (MELAS), синдромом Leigh и др. (www.mitomap.org).

В отличие от цитозиновых редакторов оснований, TALEDs содержат TadA8e, дезокси-аденин-деаминазу, сконструированную из тРНК-специфического белка TadA из E. coli-производных. TadA8e³³ и родственные варианты TadA^34,35 также являются важными компонентами РНК-направляемых адениновых редакторов оснований (ABE) CRISPR³⁶ , широко используемых для редактирования оснований A-to-G в ядерной ДНК. Однако РНК-направленные ABE не могут быть использованы для редактирования ДНК органелл из-за сложности доставки направляющей РНК в органеллы.³⁷ Кроме того, TadA8e в ABE обладает остаточной деаминазной активностью в отношении субстратов РНК, что приводит к нежелательному, транскриптомному, вне-целевому редактированию оснований.^38-44 Здесь мы показываем, что TALED, нацеленные на мтДНК, с последовательностью, нацеленной на митохондрии (MTS), также могут вызывать вне-целевое редактирование РНК, что приводит к цитотоксичности и остановке роста у эмбрионов мыши. Мы также представляем сконструированные TALEDs, которые минимизируют нежелательное редактирование РНК, и с помощью которых нам удалось получить мышей, отредактированных по мтДНК, с патогенными мутациями.

Редакторы оснований аденина и цитозина, позволяющие осуществлять целевые замены оснований в мтДНК, широко используются в научных исследованиях и медицине,^14-17,48-53 но их применение ограничено вне-целевым редактированием в митохондриальном геноме и побочным редактированием в целевом сайте. В дополнение к этим ограничениям, здесь мы показали, что адениновые редактирующие TALEDs, но не цитозиновые редактирующие DdCBEs могут вызывать десятки тысяч нежелательных редактирований РНК вне мишени в клетках человека. Несмотря на то, что большинство этих нецелевых правок РНК исчезали через несколько дней после трансфекции, TALEDs снижали жизнеспособность клеток и вызывали остановку развития эмбрионов мыши. Чтобы преодолеть эти недостатки TALEDs, мы сконструировали и протестировали в общей сложности 209 вариантов TALEDs, в которых каждый из 11 аминокислотных остатков вблизи субстрат-связывающего кармана в белке TadA был заменен на другие 19 аминокислотных остатков. В результате нам удалось разработать варианты TALEDs с тонкой настройкой деаминазной активности, избежав более 99% внецелевых правок РНК и сведя к минимуму вне-целевые и побочные правки. Интересно, что наши разработанные TALEDs индуцировали целевые правки A-to-G менее эффективно на 1 или 2 день после трансфекции, но более эффективно на 4 день и позже, чем оригинальные варианты sTALEDs и sTALEDs-V106W (рис. S8). Фактически, большинство целевых правок, индуцированных sTALEDs или sTALEDs-V106W, исчезали к 8-му дню после трансфекции, тогда как правки, индуцированные нашими вариантами sTALEDs, сохранялись более стабильно в течение долгого времени. Этот результат позволяет предположить, что sTALEDs и sTALEDs-V106W были цитотоксичны из-за активности РНК вне мишени и что наши разработанные варианты sTALEDs были переносимы, поскольку они уменьшали редактирование РНК вне мишени. В соответствии с этим результатом в культивируемых человеческих клетках, мышиные эмбрионы, инъецированные TALEDs, не смогли разделиться и сформировать бластоцисты. К счастью, мы смогли использовать sTALEDs-V28R для получения мышей, отредактированных по мтДНК, с патогенными мутациями, связанными с синдромом Leigh.

Мы также обнаружили, что вариации V28R и R111S в TadA8e могут быть введены в CRISPR РНК-направляемые ABE, чтобы избежать редактирования РНК вне цели и уменьшить количество побочных редактирований. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, являются ли эти вариации лучше или синергичнее нескольких других вариаций TadA8e, которые, как было показано, позволяют точно настроить активность РНК-направляемых ABE. Мы отмечаем, что некоторые из ранее известных вариаций, включая V106W,⁴¹ V106G,⁴⁰ и N108Q,^35,44, были включены в нашу первоначальную библиотеку из 209 вариантов TALEDs. Варианты sTALEDs с V106G или N108Q, однако, оказались малоэффективными и были исключены из последующих экспериментов. Различные мутации V28, кроме V28R, также были включены в ABE8e.^44,54,55 Возможно, что эти варианты совместимы с CRISPR РНК-направляемыми ABE, нацеленными на ядерную ДНК, но не с TALEDs, нацеленными на мтДНК.

ABEs успешно использовались для редактирования оснований в животных моделях без явной цитотоксичности.^44,56-60 Мы предположили, что MTS-индуцированная митохондриальная транслокация TALEDs менее эффективна или намного медленнее, чем ядерная транслокация ABEs, вызванная сигналом ядерной локализации (NLS). Действительно, мы обнаружили, что ABE8e, содержащие MTS (полученный из COX8a или SOD2), а не NLS, вызывали редактирование РНК вне мишени гораздо чаще в шести репрезентативных сайтах, чем оригинальные ABE8e, содержащие NLS (рис. S14A). Кроме того, анализ пролиферации клеток показал, что эти варианты были более цитотоксичны, чем оригинальный ABE8e (рис. S14B). В ответном эксперименте варианты sTALEDs, в которых MTS был заменен на NLS, продемонстрировали значительно меньшее редактирование РНК вне мишени (Рисунок S14C). Эти результаты свидетельствуют о том, что TadA8e, слитый с MTS, но не с NLS, является проблемным.

TALEDs вызывали гетероплазматическое редактирование, а не гомоплазматическое, то есть 100% редактированиz мтДНК как в культивируемых клетках млекопитающих, так и в эмбрионах мыши на стадии одной клетки. Гетероплазматическое редактирование может быть достаточным для фенотипических эффектов в некоторых случаях. В противном случае гомоплазматическое редактирование может быть достигнуто путем стабильной трансфекции или длительной экспрессии TALEDs. Так, мы смогли получить гомоплазматическое редактирование в пластидной ДНК целых растений с помощью стабильной трансфекции TALEDs через агробактерии⁴⁸ и в мтДНК клеток млекопитающих²⁵ с помощью адено-ассоциированного вируса, экспрессирующего мономерные DdCBEs. Предстоит проверить, подходят ли наши варианты TALEDs с пониженной активностью РНК вне мишени для долгосрочной экспрессии.

Здесь мы показали, что варианты TALEDs с тонко настроенной активностью адениндезаминазы могут минимизировать нежелательные "не-целевые" правки РНК в транскриптоме и побочные правки в сайте-мишени мтДНК. Однако мы отметили, что эффективность целевого редактирования снижалась этими вариантами TALEDs в одних сайтах-мишенях, но не в других. С другой стороны, мы выявили несколько вариантов TadA8e с повышенной активностью редактирования по мишени (рис. 2). Будет интересно определить, можно ли сочетать эти варианты с V28R или R111S, чтобы повысить эффективность редактирования по мишени и избежать эффектов РНК вне-мишени одновременно.