Рак молочной железы - один из самых распространенных видов рака у женщин. В 2020 году, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), рак молочной железы займет первое место по числу новых случаев (11,7%) в мире среди всех видов рака у обоих полов, а смертность составит 6,9%. Заболеваемость достигает 24,5% среди женщин, а смертность самая высокая среди всех видов рака - 15% в 2020 году. В период с 2008 по 2020 год количество случаев рака молочной железы у женщин увеличилось с 1,38 миллиона до 2,254 миллиона, что свидетельствует о росте на 38,6% чуть более чем за 12 лет. Количество смертей за эти 12 лет также пропорционально увеличилось с 458 400 случаев в 2008 году до 682 000 случаев в 2020 году, что свидетельствует об увеличении на 32,8% [1,2]. Эти статистические данные обобщены на рисунке 1. Рисунок 1 показывает, что рак молочной железы является наиболее распространенным и опасным онкологическим заболеванием во всем мире, особенно среди женского населения [3]. Постоянно растущее число случаев рака молочной железы во всем мире увеличивает потребность в эффективном лечении рака молочной железы. Bray et al. [4] и Jemal et al. [5] перечислили несколько потенциальных факторов, которые способствовали увеличению числа случаев рака молочной железы во всем мире [4,5]. Наследственность и генетические факторы (семейная история и мутация генов, вызывающих рак молочной железы), связанные с менструацией (возраст менархе и более поздний возраст менопаузы), связанные с репродукцией (нерожавшие, откладывающие рождение первенца, низкий уровень репродукции и низкий уровень грудного вскармливания), потребление экзогенных гормонов (оральные контрацептивы и заместительная гормональная терапия), питание (употребление алкоголя, потребление продуктов с высоким содержанием транс-жиров и курение), антропометрия (ожирение, увеличение веса и распределение жира в организме) и физическое бездействие, такое как отсутствие регулярных физических упражнений или тренировок, являются некоторыми из потенциальных факторов, которые увеличивают шансы заболеть раком молочной железы, что было обобщено в таблице 1 [4-6]. Эти факторы стали причиной увеличения числа случаев заболевания в последнее десятилетие. В связи с постоянством сегодняшнего образа жизни эти факторы сохраняются и с каждым годом становятся все более тревожными.



Figure 1. A statistical figure of the number of new breast cancer cases and mortality rate in the female population for the years 2008 and 2020 referring to GLOBOCAN estimated data for years 2008 and 2020 [2,3].

Table 1. Potential factors that increase the chances of obtaining breast cancer with examples.

Рак молочной железы можно разделить на три основные гистологические части: инвазивная протоковая карцинома, инвазивная лобулярная карцинома и смешанная протоково-лобулярная карцинома [7]. На поверхности раковых клеток присутствуют или чрезмерно выражены рецепторы, такие как рецепторы эстрогена или прогестерона (гормональные рецепторы), рецепторы белка HER2 и трижды-отрицательные (нет молекулярных рецепторов, перечисленных выше). Их наличие в раковых клетках и отсутствие в нормальных клетках играет существенную роль в прогнозе и лечении пациента. Эти рецепторы были идентифицированы и использованы для изучения роста или распространения рака молочной железы. Это позволяет лучше понять потенциал открытия противораковых препаратов или методов лечения для замедления или даже остановки роста рака. Доступные варианты лечения, которым обычно подвергается пациент с подтвержденным раком молочной железы, включают хирургию, лучевую терапию, эндокринную терапию, целевую лекарственную терапию или химиотерапию, которые используются либо по отдельности, либо в комбинации двух-трех методов в зависимости от типа и стадии рака молочной железы [7,8]. Химиотерапия является передовым методом лечения в определенных ситуациях, например, до или после операции по удалению опухоли или на поздних стадиях заболевания; однако они известны своими краткосрочными и долгосрочными рисками [7,9]. Химиотерапевтические схемы, содержащие anthracyclines (напр., doxorubicin), taxanes (напр., paclitaxel), 5-fluorouracil, and cyclophosphamide, обладают высокой токсичностью, поскольку нарушают репликацию ДНК и митоз у пациента, это ограничивает их клиническое применение [7,9]. Наиболее эффективным методом лечения рака молочной железы с гормональными рецепторами является таргетная терапия рецепторов эстрогена. Однако даже с учетом развития этих методов лечения, как отдельных, так и комбинированных, их эффективность все еще не гарантирована [10]. Некоторые современные клинические методы лечения, такие как цитотоксическая химиотерапия и эндокринная терапия, показывают значительные перспективы, но все еще существует высокая вероятность неблагоприятных побочных эффектов для пациентов.

Waks and Winer [7] and Greenlee et al. [11] описали, что большинство доступных методов лечения имеют ряд побочных эффектов, таких как приливы жара, тошнота, нейтропения, астения или даже сенсорная нейропатия [7,11]. Пациенты с диагнозом рака молочной железы уже физически и эмоционально обременены своим заболеванием. Лечение с меньшим количеством неясностей относительно его побочных эффектов и эффективности, несомненно, облегчит трудности пациентов. Поэтому необходимо разработать высокоэффективное и действенное лечение с минимальной токсичностью или отсутствием побочных эффектов. Генотерапия является одним из таких методов лечения, и считается, что она обладает одним из лучших потенциалов для безопасного, успешного и эффективного лечения рака молочной железы.

Генотерапия - это перенос генетического материала в организм пациента с потенциальной возможностью лечения различных заболеваний, таких как моногенные заболевания, инфекционные заболевания, сложные нейродегенеративные расстройства, рак и т.д. [12]. Теоретически, генотерапия направлена на долгосрочное решение проблемы пациента, и одним из примеров потенциального метода является продолжительная генотерапия. Это может быть достигнуто путем замены дефектных генов копиями мутантных или модифицированных генов или с помощью методов РНК-интерференции или редактирования генома для ограничения производства нежелательных генов [13]. Anguela and High упомянули, что одним из первых примененных методов была прямая инъекция "голой" нуклеиновой кислоты, которая позволяет экспрессировать трансгены в мышце [12]. Однако "голая" нуклеиновая кислота сталкивается с трудностями в обеспечении успешной доставки в целевой участок и эффективного ответа. Это связано с тем, что ДНК имеет большой размер, отрицательно заряжена и легко деградирует под действием ферментативных нуклеаз in vivo, что препятствует эффективной доставке. Поэтому средство доставки (вектор) должно защищать и доставлять генный груз в клетку или ткань мишень [14]. Одним из важнейших принципов стратегии генотерапии является использование генного носителя, который может защитить генетический материал, доставить его и высвободить в целевой участок или клетку, поскольку гены довольно хрупки, особенно при внедрении в чужеродную биологическую систему [15].

Один из первых случаев использования вектора был осуществлен в начале 1990-х годов. Клинические исследования генотерапии были начаты в Национальных институтах здоровья США в 1990 году для лечения редкого наследственного иммунодефицита, иммунодефицита-X1 (SCID-X1), где использовалась комплементарная ДНК с дефектным вектором, полученным из ретровируса [16]. Однако инсерционный онкогенез вектора произошел у 5 из 20 пациентов, что привело к лейкемии, и это лечение прекратилось, когда оно вызвало первую смерть. После лечения подросток по имени Джесси Гелсингер умер из-за синдрома системного воспалительного ответа [17]. В другом случае, Aiuti и др. [18] провели многообещающее испытание для ADA-SCID (тяжелый комбинированный иммунодефицит с дефицитом аденозиндеаминазы). При этом заболевании нарушается иммунная функция, что приводит к накоплению токсичных метаболитов, которые вызывают повреждение органов и, в конечном итоге, смерть [18,19]. Хотя в обоих случаях в качестве лечения использовалась вирусная генотерапия, негативное влияние SCID-X1 на пациента не наблюдалось у пациентов с ADA-SCID даже после длительного периода, в течение которого оба метода лечения интегрировали аналогичный ген. С тех пор, по состоянию на 2018 год, было проведено более 2500 клинических исследований для более широкого спектра применения генотерапии [12]. Развитие генотерапии остается медленным из-за многочисленных ограничений. Эти проблемы включают инсерционный мутагенез, малую грузоподъемность, неспособность достичь недоступных опухолей, проблемы иммуногенности цитотоксичности, проблемы стабильности, ферментативную деградацию и главную нерешенную проблему - как эффективно и действенно доставить терапевтический ген в целевой участок [20]. Несмотря на эти сложности, были достигнуты многочисленные успехи в разработке методов и глубоком понимании генной терапии. Согласно выводам Anguela and High [12], шесть методов генотерапии, в основном вирусная терапия и иммунотерапия, уже получили одобрение медицинских учреждений, как показано в таблице 2, но ни один из них, использующий вирусные векторы, не был успешно использован против рака, особенно рака молочной железы.

Table 2. Summary of the latest approved viral gene therapy [12,21].

На рынке имеются одобренные вирусные генотерапии, однако во многих случаях вирусные векторы вызывают серьезные побочные эффекты, в одном из примеров сообщалось о синдроме системного воспалительного ответа, который приводил к отказам многочисленных органов у человека и даже вызывал смерть [15,20]. Поэтому многочисленные усилия были направлены на поиск альтернативных средств или систем доставки. Например, невирусные системы доставки наночастиц, включая фуллерены и наночастицы на основе углерода, металла, керамики, полупроводников, липидов и полимеров, показали наличие определенного потенциала [22]. Исследования невирусных систем доставки неуклонно растут благодаря их характеристикам как более безопасных и легко настраиваемых систем. Одной из таких систем являются липосомы - система наночастиц на основе липидов, где липидные бислои инкапсулируют экзогенный терапевтический груз для преодоления биологических барьеров и окружающей среды. Они легко собираются, производятся в больших масштабах и модифицируются для формирования функционального невирусного вектора. Производство вирусных векторов в больших масштабах и длительное хранение вирусных векторов менее стабильно, что приводит к низким выходам, потере чистоты и короткому сроку хранения. Поэтому, исходя из этого, липосома является более предпочтительным вектором по сравнению с вирусным вектором [23].

Bangham et al. [24] из Babraham Institute, University of Cambridge впервые открыли липосомы в 1960-х годах, когда они создали как одиночные, так и множественные концентрические липидные бислои, инкапсулирующие водный компартмент [24]. Они были способны захватывать липофильные и гидрофильные агенты либо на поверхности липидной мембраны, либо в водном ядре. Размер этих почти сферических липидных везикул может варьироваться от нескольких нанометров до нескольких микрометров. По данным Balazs et al. [25], возможными формами являются сферические мицеллы, цилиндрические мицеллы, гибкие бислойные везикулы, плоские бислои и перевернутые мицеллы [25]. В данном обзоре будут рассмотрены различные типы липосом (катионные, анионные и нейтральные), а также стабильность, клеточное поглощение, эффективность трансфекции, цитотоксичность и недостатки каждого типа липосом.

Обычные методы лечения рака молочной железы часто неселективны в отношении опухолевых клеток, что приводит к значительной токсичности, неэффективности и многочисленным побочным эффектам. Однако, в свою очередь, благодаря высоким модификационным свойствам липосом, функциональные липосомы делают возможным целенаправленное воздействие как форму лечения. Благодаря своей низкой иммуногенности и токсичности по сравнению с вирусными векторами, липосомы являются наиболее часто используемым невирусным вектором. Липосомы также демонстрируют большой потенциал в использовании в качестве наноносителя для целенаправленного лечения опухолевых участков, поскольку их можно легко модифицировать, включив в них либо одну, либо комбинацию стратегий таргетинга, использующих различные лиганды, полимеры или рецепторы, специфически направленные против рака молочной железы [26]. Более того, липосомы могут инкапсулировать не только терапевтические гены, но и цитотоксические препараты. Способность липосом модифицировать поверхность позволяет доставлять более высокие концентрации груза к месту опухоли.

Кроме того, наличие фосфолипидного бислоя защищает инкапсулированный груз от разрушения в организме до достижения опухолевой ткани и минимизирует воздействие груза на здоровые чувствительные ткани [27]. Это минимизирует повреждение нормальных тканей и не требует длительной экспрессии трансгена, особенно при лечении рака молочной железы [28]. Разработка системы направленной генотерапии с использованием липосом в качестве носителей генов при раке молочной железы в последние годы продвигается медленно. Понимание свойств каждого типа липосом может помочь разработать функциональную липосому для генотерапии рака молочной железы.

Каждый подтип рака молочной железы был связан с генными изменениями, которые вызывали аномалии определенных клеток в молочной железе. Таким образом, генотерапия является жизнеспособным вариантом лечения подтипов рака молочной железы с различными генетическими аномалиями [29]. Гены предрасположенности к раку молочной железы с аллелями вариантов высокого риска, такие как гены предрасположенности к раку молочной железы (BRCA1, BRCA2); опухолевый белок p53 (TP53); гомолог фосфатазы и тензина (PTEN); серин/треониновая киназа 1 (STK11); и кадхерин 1 (CDH1) - вот некоторые из генов, которые приводят к относительному риску развития рака молочной железы [30]. Коррекция генов, редактирование генов, суицидальная генотерапия и подавление генов - вот некоторые стратегии, выбранные для лечения рака молочной железы с помощью генотерапии.

Трансфекция означает способность клетки экспрессировать желаемую нуклеиновую кислоту или белок, который вводится в целевую клетку. Нуклеиновая кислота не может быть введена в клетку-хозяина напрямую, поэтому для доставки интересующего гена в клетку-хозяина необходимо транспортное средство. Для трансфекции генjd могут использоваться такие носители, как плазмиды, РНК, мРНК и олигонуклеотиды. Трансфекция невозможна при использовании экзогенного генетического материала, такого как ДНК или РНК, поскольку он разрушается множеством способов, как только попадает в организм человека. Опсонизация (Opsonisation), быстрый клиренс с помощью RES, плохое проникновение в опухоль, поглощение клетками и лизосомальная деградация - вот некоторые препятствия, которые придется преодолеть генетическому материалу, прежде чем он сможет успешно трансфицировать клетку [31]. Поэтому необходим носитель груза, который может инкапсулировать генетические материалы в качестве средства защиты для обеспечения высокой вероятности того, что груз успешно достигнет места предназначения.

Невирусная трансфекция подразделяется на два метода: физическая и химическая трансфекция [32]. Электропорация, сонопорация, магнитофекция, микроинъекция генов и лазерное облучение - все это стандартные методы физической трансфекции для введения генетического материала в клетку-хозяина с помощью различных физических инструментов [33]. Липосомы, фосфат кальция, дендримеры, полимеры, наночастицы и нелипосомальные липиды являются одними из наиболее коммерчески доступных химических реагентов для трансфекции. Эти химические трансфекционные реагенты помогают ввести чужеродные генетические элементы с минимальной химической устойчивостью в клетку-хозяина.

Существует два типа возможных трансфекций для невирусной везикулы с инкапсулированным интересующим геном: стабильная трансфекция и преходящая трансфекция, в зависимости от природы интересующего гена. Генетический материал, введенный в геном клетки для долгосрочной экспрессии, подвергается стабильной трансфекции. Что касается переходной трансфекции, то генетический материал не интегрируется в геном клетки-хозяина и экспрессируется только в течение короткого времени [32,33]. Таким образом, носитель груза должен обладать свойствами, которые позволят высвободить генный груз либо путем деградации, либо путем самораспутывания в стратегических местах с наибольшим процентом трансфекции [15]. Поверхность носителя груза также играет важную роль в обеспечении эффективной трансфекции. Поскольку нуклеиновая кислота заряжена отрицательно, ей необходим положительно заряженный агент в качестве носителя, создающий электростатическое взаимодействие естественным образом в процессе инкапсуляции [15]. Предположим, что носитель груза имеет высокую плотность положительного заряда. В этом случае он может слишком сильно притягиваться к отрицательно заряженной нуклеиновой кислоте, снижать эффективность трансфекции и даже вызывать агрегацию, когда электростатическое отталкивание становится слишком низким, что приводит к накоплению в легких и печени вместо циркуляции в кровеносной системе [31].

Для обеспечения функции целенаправленного воздействия необходимо учитывать длину и тип алифатических цепей в липидах, плотность заряда, гидрофобность, добавление полимеров или биомолекул, а также сродство связывания с белком или рецептором клетки. Это позволяет проводить многочисленные модификации поверхности носителя груза для улучшения желаемых функций и свойств, таких как биоразлагаемость, плотность заряда, растворимость, молекулярная масса, кристалличность, гидрофобность, жесткость и значение pKa - все это необходимо для эффективности защиты и доставки. Кроме того, важную роль играет размер комплекса носителя груза. Он определяет путь клеточного поглощения, указывая на модификацию поверхности, такую как поверхностные амины (лизин), сульфгидрилы (цистеин), и неродные функциональности, такие как альдегиды (образующиеся из сахаров), а также азиды (через метаболическое внедрение) [34], которые необходимо учитывать при разработке системы доставки [35]. Все эти модификации будет сложно осуществить в системе вирусной трансфекции, но это возможно для системы доставки на основе липосом благодаря их надежной способности к модификации.

Липосомы, относящиеся к категории невирусных систем доставки, обычно изготавливаются из фосфолипидов и состоят из гидрофильной головки и двух гидрофобных цепей. Как молекулы с гидрофильными и гидрофобными сегментами, они имеют высокую вероятность образования мембран при диспергировании в водном растворе, где полярные головки будут благоприятствовать водной среде, а их длинные алифатические цепи - взаимодействию друг с другом. Эти взаимодействия создают ван-дер-ваальсовы силы и водородные связи в целом, образуя полые бислойные липидные пузырьки различной формы, такие как сферические, полиэдрические или трубчатые, в зависимости от их природы, концентрации, температуры и геометрической формы [36]. Форма липосомы в значительной степени зависит от типа липида, используемого в ее рецептуре, поскольку различные комбинации липидов приводят к различным конформационным структурам. Липосомы могут иметь различные формы и размеры, быть бислойными или монослойными, и даже многослойными для выполнения определенных функций. Например, липидные капсулы или закрытые бислойные везикулы используются в косметической промышленности и в индустрии доставки лекарств благодаря своей биологически совместимой природе. Они также могут быть сконструированы таким образом, чтобы быть чувствительными к окружающей среде, например, к температуре или pH, для высвобождения своего содержимого в определенном месте [37].

Moosavian и Sahebkar's в своей работе, посвященной исследованию липосом в раковых клетках, также обнаружили, что эластичность липосом (способность липосом протискиваться через крошечные поры на поверхности плазматической мембраны) действительно влияет на их функциональность [38]. Эластичность липосомы может изменять клеточное поглощение и время циркуляции, где она может быть интернализована больше и быстрее, чем менее эластичные наночастицы. Менее эластичные липосомы легче взаимодействуют с клетками и проникают в них через клатрин-опосредованный путь, а более эластичные липосомы полагаются на микропиноцитоз [38]. Key et al. [39] и Anselmo et al. [40] сообщили, что эластичность липосом, влияющая на взаимодействие липосом с клетками, сильно зависит от типа опухолевых клеток, и липосомы с меньшей эластичностью лучше взаимодействуют с иммунными клетками по сравнению с липосомами с большей эластичностью [39,40]. Anselmo et al. [40] вновь доказали, что необходимо идентифицировать различные опухоли и соответственно подбирать липосомы, поскольку эластичность влияет на биораспределение и накопление опухоли [40]. В связи с вариативностью и бесчисленными возможностями настройки их характеристик, таких как стабильность, фармакокинетические свойства и терапевтическая эффективность, исследователи достигли этого путем изменения состава, размера, заряда и других компонентов липосом [41]. В состав большинства препаратов входят цвиттерионные, катионные или анионные липиды, PEG и/или холестерин, которые по-разному влияют на стабильность, фармакокинетику и транспорт [42].

В коммерческих целях липосомы используются в косметической промышленности как усилители проникновения, в пищевой промышленности как солюбилизаторы, как носители в медицинской диагностике, как усилители сигнала в аналитической биохимии, а также как лекарственные носители (лекарств или генов) [43,44]. Многие лекарственные препараты были инкапсулированы в липосомы и изучены на предмет снижения токсичности и увеличения продолжительности терапевтического эффекта. Это позволяет снизить токсичность при введении пациентам только одного препарата. Различные академические и промышленные исследовательские группы разработали липосомальную инкапсуляцию лекарств и генов [45]. Из всех утвержденных систем доставки на основе липосом, используемых для лечения различных заболеваний, Doxil, Lipo-dox и Myocet были единственными утвержденными препаратами для лечения рака молочной железы, как показано в таблице 3. Оба утвержденных препарата на основе липосом используют липосомы для инкапсуляции антрациклиновых препаратов, которые, как известно, обладают высокой токсичностью при непосредственном введении пациентам и не могут превышать дозу 450-500 мг/м² на всю жизнь. Хотя инкапсулирование антрациклина в липосомы позволяет снизить токсичность и может назначаться пациентам с раком молочной железы в дозе до 2200 мг/м² на всю жизнь, пациенты все равно сталкиваются с побочными эффектами, такими как кардиотоксичность и алопеция [46].

Table 3. Одобренные системы доставки на основе липосом используются в качестве лечения рака молочной железы [47].

В последнее время ведутся исследования по оптимизации липосомных систем доставки с более воспроизводимыми методами приготовления и более широким применением новых методов, включая терапию нуклеиновыми кислотами, терапию CRISPR/Cas9 и иммунотерапию, для удовлетворения постоянного спроса на новые методы лечения в клиниках [45]. Липосомы предпочтительнее вирусов в приложениях по доставке генов, таких как генотерапия и генная вакцинация. Это объясняется тем, что они неиммуногенны и гораздо проще в сборке, чем вирусные системы трансфекции [50,51].

Из-за недостатков системы вирусной трансфекции и лечения с помощью липосом, в течение последних нескольких десятилетий исследователи стремились разработать системы доставки генов на основе липосом в качестве лучшей альтернативы. Таким образом, растет число одобренных FDA препаратов на основе липосом и увеличивается количество клинических испытаний, включая широкий спектр применения генотерапии на основе липосом именно для лечения рака. К сожалению, как показано в таблице 4, только в двух клинических испытаниях липосомы использовались в качестве носителя для генотерапии рака молочной железы.

Table 4. Clinical studies of liposome-based breast cancer gene therapy (data obtained from www.clinicaltrials.gov (accessed on 7 July 2022)).

Существует беспредельный потенциал и возможности для разработки липосомных составов, сочетающих различные типы липидов в качестве грузов, захватываемых везикулами, с многочисленными методами лечения и стратегиями с бесконечными возможностями. В данном обзоре мы надеемся, что, изучая и сравнивая различные типы липосом, цитотоксичность, механизмы поглощения и эффективность трансфекции при различных заболеваниях, мы сможем получить лучшее понимание для разработки более безопасного и эффективного лечения, в частности, генотерапии при лечении рака молочной железы. Как уже упоминалось ранее, существует три основных типа липосом: анионные, катионные и нейтрально-заряженные.

Катионные липиды - это амфифильные молекулы с тремя основными частями в молекуле, которые состоят из положительно заряженных полярных головок, линкера и гидрофобных хвостов [35]. В таблице 5 приведены некоторые из наиболее распространенных катионных липидов, используемых для создания катионных липосом. Каждая положительно заряженная полярная головка может содержать одну или несколько положительно заряженных функциональных групп, которые могут образовывать комплексы с анионным грузом. Комплексы могут быть образованы путем соединения молекул с положительным и отрицательным зарядом вместе, образуя электростатические взаимодействия. Таким образом, плотные нуклеиновые кислоты из-за многочисленных отрицательно заряженных фосфатных групп имеет тенденцию спонтанно образовывать конденсированные катионные липоплексы при соединении с положительно заряженными липосомами или липидами [35,51]. Обычно липоплексы формируются с использованием избытка положительно заряженных липидов, таких как приведенные в Таблице 5, в соотношении ДНК/РНК для создания положительно заряженного комплекса, который создаст взаимодействие между поверхностными протеогликанами и катионной липоплексной системой. Затем это будет способствовать связыванию клеток, эндоцитозу и слиянию с анионными эндосомными мембранами, что вызовет высвобождение генетических материалов в цитоплазму [54]. Другие липосомы, по сравнению с катионными липосомами, имеют более низкую эффективность захвата ДНК, меньшую степень клеточной интернализации и эффективность защиты ДНК в цитоплазме во время проникновения в ядро [55]. Катионные липиды с катионными головными группами создают естественный электростатический контакт между липидом и генами, что повышает эффективность инкапсуляции. Более того, электростатическое взаимодействие между катионными липосомами и клеточной мембраной позволяет катионным липосомам проникать внутрь клетки более эффективно, чем другим липосомам [31,56].

Table 5. Types of common cationic lipids used in formulating cationic liposomes.

Их распределение по размерам и полидисперсность могут определять физическую стабильность липосом. Размер липосом может быть определен с помощью различных методов, таких как динамическое рассеяние света, электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия, фракционирование в полевом потоке, анализ отслеживания наночастиц, проточная цитометрия, флуоресцентная микроскопия, хроматография с исключением размера, сканирующее ионное окклюзионное зондирование, центробежное осаждение и дифференциальная сканирующая калориметрия [45]. Известно, что катионные липосомы обладают низкой стабильностью в сыворотке крови, поскольку они притягиваются к белкам плазмы (сывороточный альбумин, комплемент, иммуноглобулины и аполипопротеины), образуя на их поверхности коронарный слой [51]. Сыворотка содержит анионные белки, которые притягивают катионную липосому за счет электростатических взаимодействий при введении в клетку-хозяина [57]. Это приведет к диссоциации и деградации генетических материалов, заключенных в катионных липосомах, тем самым нарушая оптимальную эффективность. Положительно заряженные липосомы также будут естественным образом притягиваться к другим отрицательно заряженным элементам в организме хозяина, что может привести к отклонению липосомы от целевого участка.

Кроме того, катионные липосомы также проявляют низкую активность, особенно потому, что катионные липосомы идентифицируются как чужеродный материал в организме человека. Это приведет к покрытию антителами или проглатыванию фагоцитами вместо достижения целевого участка [31]. Однако, по данным Kapoor M. и Burgess D., это не влияет на эффективность сайленсинга, что объясняется высокой способностью к эндосомальному выходу по сравнению с анионными липосомами [58]. Липосомы, созданные с использованием только катионных липидов, образуют липосомы с высоким положительным зарядом и склонны к образованию менее стабильных мицелл с высокой токсичностью. По этой причине разработчики разрабатывают стратегии снижения положительного заряда. Этого можно достичь, поскольку катионные липосомы могут быть модифицированы путем добавления лигандов, таких как белки [59] или полимеры [60] для экранирования части заряда, добавления вспомогательных липидов в рецептуру для уменьшения катионного липида [55] или создания одноламинарных везикул для получения более мелких частиц. Это лишь некоторые из немногих стратегий, позволяющих преодолеть такие ограничения.

Катионные липосомы, используемые для доставки нуклеиновых кислот, обладают высокой токсичностью по отношению к макрофагам, что снижает секрецию иммуномодуляторов и тем самым истощает макрофаги в организме хозяина [61]. Кроме того, катионные липосомы склонны активировать клеточные пути, такие как про-апоптотический и про-воспалительный каскады, что является существенным недостатком использования липосом для доставки генов и терапии, поскольку это приведет к иммуногенному ответу в организме хозяина [62]. Однако токсичность механизма головной группы все еще не до конца известна, поэтому необходимы дальнейшие исследования, которые помогут разработать липосомы в качестве невирусного носителя. Simoes et al. [55] провели ряд исследований и обнаружили, что липидные связи играют существенную роль в цитотоксичности липосом, при этом липиды со стабильными эфирными связями (например, DOTMA, DMRIE) обладают более высокой цитотоксичностью, чем липиды с лабильными эфирными связями (например, DOTAP) [55]. Катионные липиды с эфирными связями, как правило, обладают более низкой цитотоксичностью, чем липиды с эфирными и амидными связями [35].

Катионные липиды способны нарушать анионную клеточную мембрану, что приводит к неблагоприятной цитотоксичности [45]. Основными факторами, влияющими на неблагоприятную цитотоксичность, являются гидрофильные головные группы и морфология молекул липидов, например, длина гидрофобных цепей. Кроме того, тип химических связей и взаимное расположение углеводородных цепей также могут влиять на токсичность [63,64]. Однако катионные липиды имеют значительное преимущество перед анионными и нейтральными липидами. Положительно заряженная головка легко притягивается к отрицательно заряженным клеточным мембранам, что увеличивает скорость встраивания или поглощения клеткой. Однако частицы, попадающие в клетку путем эндоцитоза, как правило, задерживаются в эндосоме, которая затем сливается с лизосомой. После слияния высвобождаются гидролитические ферменты, которые могут расщеплять различные типы биомолекул. Когда в клетку попадают высокоположительно заряженные частицы, они все равно задерживаются в эндосоме. Тем не менее, из-за высокого положительного заряда они вызовут "эффект протонной губки", что приведет к разрыву эндосомы под действием осмотического давления и высвобождению находящегося внутри груза [65]. Поэтому катионный липид является наиболее эффективным по сравнению с анионными и нейтральными липидами, используемыми в липосомах, именно в отношении клеточного поглощения [66]. Однако высокий положительный заряд также обычно приписывается его недостатку, вызывая значительное повреждение клеток. Несмотря на это, цитотоксичность может быть успешно снижена с помощью различных подходов, модификаций и комбинаций различных стратегий на стадии разработки рецептуры. В некоторых исследованиях было обнаружено, что уменьшение заряда всего состава (снижение дзета-потенциала) снижает уровень цитотоксичности. Это предполагает добавление нейтральных или цвиттерионных липидов в рецептуру катионных липосом для снижения поверхностного заряда катионных липосом приводит к образованию липосом с более низким дзета-потенциалом [15,67].

Липиды, используемые для создания липосом с постоянной положительно заряженной аммониевой головной группой, обладают гораздо более высоким цитотоксическим эффектом по сравнению с липидами с трипептидной (например, три-аргининовой) головной группой [62]. Эндогенные аминокислоты, такие как аргинин [68], способны помочь липидным молекулам продемонстрировать повышенную эффективность трансфекции. Их способность проникать через мембрану может быть схожа с проникающими в клетки пептидами при транслокации клеток. Более того, добавление определенных поликатионов, полимеров или пептидов в состав катионных липосом повышает эффективность трансфекции клеток и снижает цитотоксичность [69,70]. По данным Rezaee et al. [70], катионные полимеры часто включаются в рецептуру носителей генов, поскольку они конденсируются, создавая частицы меньшего размера. Цитотоксичность, вызванная добавлением полимеров в липосомные составы, обычно приводит к плохой биосовместимости и биоразлагаемости системы, хотя существуют и стратегии для преодоления этой проблемы. Другим вариантом может быть использование поликатионов на основе пептидов, которые, как утверждается, повышают эффективность трансфекции в катионной липосомной рецептуре. Присоединение пептидов также снизило цитотоксичность катионных липидов в липосомном составе, но использование высокомолекулярных пептидов увеличит иммуногенность липосомного комплекса [31]. Присоединение полимеров, таких как PEG, к катионным липосомным рецептурам показало, что они не только способны экранировать поверхностную плотность положительного заряда, но и повышают стабильность системы.

Катионные полимеры также могут быть присоединены к нейтральным липосомам и уменьшить размер их частиц и соотношение инкапсуляции носителя (липосомы) и нуклеиновой кислоты (груза) при низкой цитотоксичности. Использование катионных полимеров более низкой концентрации, присоединенных к нейтральным липосомам, для создания липосом с более низким зарядом может компенсировать любой неблагоприятный эффект, вызванный более высокозаряженными катионными липосомами [70]. Многие пептиды, включая проникающие в клетки пептиды, пептиды-мишени, ядерные локализующие пептиды и пептиды, стимулирующие высвобождение эндосом, могут быть соединены с катионным пептидом (как домен конденсации нуклеиновой кислоты) через расщепляемый линкер для создания многофункциональной липосомы на основе пептидов [70]. Rezaee et al. [70] обобщили использование различных полимеров и пептидов, включенных в липосомные составы.

Хотя добавление полимеров или пептидов на поверхность липосом может снизить цитотоксичность, это будет способствовать увеличению размера частиц, что необходимо учитывать. Существует несколько подходов, таких как присоединение биосовместимых полимеров, расщепляемых полимеров, которые расщепляются до своих субъединиц в цитозоле и эндосоме, использование менее катионных полимеров (что приводит к снижению цитотоксичности), которые компенсируются более катионными липосомами, гидрофобные модификации и конъюгация некоторых аддуктов, включающих углеводородные цепи различной длины, и некоторых гидрофобных фармацевтических препаратов, таких как глюкокортикостероиды, которые действуют как сигналы ядерной локализации и иммуномодуляторы, (расщепляемый) PEG и таргетные лиганды [70]. Эффективность различных комбинаций показала увеличение в 2-400 раз по сравнению с липосомами без какой-либо добавки.

Изучение цитотоксичности липосомного состава имеет решающее значение, так как определяет фундаментальное требование к его работе в качестве носителя, который не будет влиять на жизнеспособность клеток. Предположим, что состав отрицательно влияет на жизнеспособность клетки. В таком случае это противоречит его функции как носителя, поскольку он будет мешать обработке груза, который он несет. Как только уровень цитотоксичности попадает в приемлемый диапазон, необходимо исследовать поглощение состава клетками и эффективность трансфекции для дальнейшего обоснования функциональности и эффективности состава как носителя генов или лекарств.

Клеточное поглощение является одним из наиболее важных процессов, регулирующих биологическую активность молекулы при попадании в клетку, и определяется взаимодействием между веществом и плазматической мембраной клетки-мишени. Существует множество путей проникновения молекулы в клетку. Один из таких путей предполагает поглощение молекул клеткой-хозяином путем эндоцитоза в мембранных инвагинациях при поглощении липосом, что затем приводит к отпочкованию и отщеплению, образуя эндоцитарные везикулы [64]. Затем они перемещаются в специализированные компартменты для внутриклеточной сортировки или трафика в зависимости от типа клетки и молекул (например, белков, липидов), вовлеченных в процесс эндоцитоза [71]. Фагоцитоз, кавеола или клатрин-независимый, кавеола-опосредованный, клатрин-опосредованный эндоцитоз или макропиноцитоз - другие возможные пути в зависимости от размера и заряда используемого липосомного комплекса. Если частица имеет положительный заряд и небольшой размер, она сможет проникнуть в клетку путем транслокации. Это становится возможным, когда частица (катионная или анионная) подходит достаточно близко к мембране клетки, чтобы создать крошечное отверстие для поглощения частиц. Катионные агенты используют эту управляемую мембранным потенциалом транслокацию для проникновения в ядро клетки, демонстрируя лучшее клеточное поглощение, чем их незаряженные аналоги [71].

Считается, что мембрана клеточного ядра несет дополнительный отрицательный потенциал, который может быть использован для поглощения груза. По этой причине катионные агенты имеют большую скорость ядерной локализации, чем анионно-заряженные частицы [72]. Липосомные комплексы чаще подвергаются клатрин-опосредованному эндоцитозу, кавеола-опосредованному эндоцитозу и микропиноцитозу, когда речь идет о клеточном поглощении в большинстве клеток, особенно раковых, за исключением фагоцитов [31]. Это связано с их большим размером частиц, что делает невозможным их прямую транслокацию. Согласно данным визуализации живых клеток, катионные липосомы предпочтительнее проникают в клетку через микропиноцитоз [56].

Клатрин-опосредованный эндоцитоз - это способ получения клетками питательных веществ, компонентов плазматической мембраны и ионов из богатой клатрином области плазматической мембраны вблизи поверхности клетки [71]. Клатрин, классифицируемый как белок, имеет трехногую структуру, известную как трискелион, которая собирается с другими белками в клетке для формирования изгиба мембраны, что затем приводит к отпочкованию везикул. Очень часто частицы (менее 250 нм), поступающие через эндосому, подвергаются лизосомной деградации, когда они проходят через этот путь, но положительно заряженные частицы в основном предпочитают клатрин-опосредованный эндоцитоз [71]. Когда положительно заряженные частицы попадают во внеклеточную среду, они достигают клеточной мембраны путем диффузии. Как только они приближаются к клеточной мембране, эти положительно заряженные частицы притягиваются к отрицательно заряженному клатрину. Когда на поверхности клеток к клатрину прикрепляется больше положительных частиц, то это изменяет локальное электрическое поле, и эти частицы проталкиваются дальше в поверхность мембраны, вызывая закрепление. Процесс эндоцитоза, опосредованного клатрином, ускоряется, когда площадь контакта частицы с плазматической мембраной увеличивается [72].

С другой стороны, кавеоло-опосредованный путь эндоцитоза отвечает за клеточную сигнализацию, трансцитоз, регуляцию липидов, жирных кислот, мембранных белков и натяжение мембраны. Частицы (50-400 нм), попадающие в клетку по этому пути, иногда стремятся избежать эндосомного захвата и, впоследствии, лизосомальной деградации. Поскольку частицы попадают в клетку без захвата, это позволяет лучше доставить груз в клетку, успешно избегая лизосомной деградации [73]. Поскольку частицы, попадающие в клетку с помощью кавеолин-зависимых механизмов, могут избежать деградации лизосом, патогены, такие как вирусы, предпочитают проникать в клетки через этот путь.

Макропиноцитоз работает несколько иначе, чем кавеола-опосредованный эндоцитоз и клатрин-опосредованный эндоцитоз, поскольку в нем не участвуют липидные плоты (rafts) или другие белки, предназначенные для эндоцитоза. В клетке происходит перестройка цитоскелета, а при поглощении частиц вне клетки образуется расширение или оборка мембраны, в результате чего образуются крупные везикулы (200-2000 нм), позволяющие внеклеточной жидкости проникнуть внутрь клетки. Этот путь может поглощать более крупные частицы, которые не могут пройти ни через один из ранее упомянутых альтернативных путей [71]. При разработке стратегии создания катионной липосомы необходимо понимать, какой путь предпочтителен для правильной стратегии целевого поглощения, что может быть достигнуто путем создания везикул нужного размера, которые благоприятствуют определенным путям проникновения в клетку.

Катионные липиды с первичными аминами имеют более низкую эффективность трансфекции, чем липиды с вторичными или третичными аминами. По мере увеличения плотности положительного заряда в составе это приводит к плохому отделению ДНК, более высокой скорости агрегации липосомного комплекса и, таким образом, к снижению эффективности трансфекции генов [15]. Можно сказать, что эффективность трансфекции катионной липосомы снижается с увеличением длины, типа и насыщенности алкильной цепи, при этом более короткая алкильная цепь предпочтительнее [55]. Согласно выводам Kumar et al. [74], более длинные алкильные цепи являются более жесткими из-за их более высокой гидрофобности и порядка упаковки, но более короткие алкильные цепи обладают лучшей проницаемостью через мембраны [74]. Было доказано, что катионные липиды с более короткими алкильными цепями имеют лучшую эффективность трансфекции при тестировании in vitro [35]. Создание липосом с оптимальной длиной цепи для достижения наилучшей эффективности трансфекции является сложной задачей. Создание баланса между гидрофобной и гидрофильной длиной цепи, особенно с использованием спейсера, все еще возможно для создания эффективной липосомы. Длина цепи и спейсеры могут способствовать гибкости мембраны бислоя, а большие везикулы легко превращаются в маленькие при добавлении внешней энергии, например, при соникации [75]. Использование спейсера помогает разрыхлить липидный бислой, обеспечивая более доступное высвобождение груза и формирование более мелких частиц. Уникальные спейсеры адаптированы по своей чувствительности к различным средам (pH), поэтому контроль высвобождения может происходить в стратегических местах для увеличения возможности трансфекции. Таким образом, молекулярная структура липидов, образующих липосомы, сильно влияет на их размер.

Исследователи в Norio Iijima, Department of Anatomy and Neurobiology, Nippon Medical School Japan, провели исследование, сравнивая эффективность катионных и анионных липосом [76]. Они обнаружили, что катионные липосомы обладают более быстрой и лучшей эффективностью трансфекции, чем анионные липосомы в культивируемых клетках. Анионные и катионные липосомы имеют различные схемы обработки и внутриклеточную активность, что приводит к изменению эффективности трансфекции. Когда некоторые катионные липосомы вводятся в клетки, их положительный заряд поверхности будет подвергаться электростатическому взаимодействию с отрицательно заряженной клеточной мембраной. Это приводит к нарушению клеточной мембраны, в результате чего липосомы проникают внутрь клетки и быстро высвобождают свой груз непосредственно в цитозоль, что позволяет катионным липосомам обходить систему эндосома-лизосома [76]. Поэтому катионные липосомы будут более предпочтительным методом трансфекции клеток, чем анионные липосомы.

Хотя катионные липосомы кажутся идеальной системой доставки благодаря различным факторам, многое еще предстоит понять, чтобы эта система стала безопасным и эффективным методом лечения рака молочной железы. Ограничивающим фактором использования катионных липосом в генной терапии является их нестабильность при хранении и неактивность в присутствии сывороток [25,50,77]. Кроме того, цитотоксичность катионных липосом - еще один фактор, над которым необходимо работать и преодолевать. Цитотоксичность, в частности, вызовет неконтролируемую массовую гибель клеток хозяина в многочисленных областях, подверженных воздействию системы. Например, будут поражены легочные клетки и клеточные стенки артерий, и нормальное функционирование биологической среды прекратится. Затем при введении липосом in vitro возникнет легочная токсичность, вызванная производством реактивных кислородных промежуточных продуктов, особенно в клетках легких [78].

Кроме того, образование агрегатов при введении в организм хозяина и взаимодействии с циркулирующей кровью является еще одним фактором, вызывающим цитотоксичность. Токсичность фагоцитарных макрофагов также является одной из причин цитотоксичности стратегии доставки [50,79]. По сравнению с нейтральными и отрицательно заряженными липосомами, катионные липосомы легче поглощаются фагоцитирующими клетками. Это приводит к образованию реактивных форм кислорода (супероксидных и гидроксильных радикалов, оксида азота, синглетного кислорода, диоксида азота и пероксинитрита), которые повреждают органеллы и способствуют повышению внутриклеточного уровня ионов натрия, что приводит к цитотоксичности и апоптозу клеток [61].

Хотя эффект цитотоксичности катионных липосом неоспорим, состав липосом может быть изменен для его преодоления. Например, добавление в состав полимеров или сополимеров, таких как полиэтиленимин (PEI), хитозан, поли-L-лизин (PLL), спермидин или PEG, может экранировать положительно заряженный липид, тем самым уменьшая эффективный заряд липосомы [69]. Также было доказано, что добавление холестерина в рецептуру уменьшает заряд липосомы за счет меньшего количества катионных липидов в рецептуре [80]. Уменьшая заряд, можно преодолеть цитотоксичность катионных липосом.

Системы доставки лекарств используются для повышения характеристик и высвобождения противораковых препаратов [26,81], но основная проблема заключается в появлении устойчивых к лекарствам опухолей. Поэтому была изучена стратегия сочетания лекарственной и генной терапии. Bulbake et al. [82] использовали катионную липосомную формулу, сочетающую DOTAP и холестерин в качестве носителя как химиотерапевтических препаратов, так и генов в качестве своего рода комбинированного лечения клеток рака молочной железы (MCF-7 и MDA-MB-231). Согласно их выводам, сочетание лекарственного препарата (паклитаксела) с терапевтическим геном siRNA (si-Plk1) выглядит жизнеспособным методом для создания нового лечения рака молочной железы. Это объясняется тем, что данный метод превосходит одиночную терапию паклитакселом или siPlk1 на 35-60% [82]. В другом исследовании противораковый препарат (доцетаксел) был объединен с геном подавления (shRNA) для преодоления лекарственной устойчивости. Катионные липосомные составы, включающие DOPE, DOTAP, PC и холестериновые липиды, были оценены на клеточных линиях рака молочной железы MCF-7 и MDA-MB-231 и в тестах in vitro [83]. Исследования in vitro показали, что комбинированный вектор действительно вызывал больший апоптоз клеток, чем метод с одним вектором. In vivo исследования показали, что комбинированная терапия уменьшила размер опухоли на 26% и 43%, по сравнению с липосомой с доцетакселом и липосомой с shRNA.

Поскольку пептиды могут присоединяться к рецепторным белкам в клетках или на их поверхности, они могут быть интегрированы в липосомные составы и использоваться для нацеливания или направления липосом на конкретные целевые рецепторы или клетки. Система доставки, сочетающая липосомы DOPE и DOTAP с хорошо определенным синтетическим многофункциональным пептидом DEN-K(GALA)-TAT-K(STR), была создана и оптимизирована с целью создания эффективной платформы доставки генов в клетки рака молочной железы (MCF-7). С этой целью в систему доставки генов на основе пептидов был добавлен специфический для рака молочной железы клеточный таргетный пептид (CTP), способствующий специфической для клеток интернализации. Была изучена его эффективность в сочетании с липосомой. По сравнению с пептидным или липосомным составом по отдельности, такой подход к формированию привел к синергетическому усилению экспрессии и глушения генов. Эффективность системы была подтверждена успешной доставкой siRNA В-клеточной лимфомы-2 (BCL-2) в клетки MCF-7, что привело к почти полному подавлению белка BCL-2 и ингибированию миграции клеток MCF-7 в тесте заживления ран [84].

Липиды с отрицательным зарядом от анионных головных групп фосфолипидов образуют анионные липосомы. В первые годы анионные липосомы не нашли широкого применения в генотерапии из-за их отрицательно заряженных свойств, которые отталкивают фосфатную основу грузов нуклеиновых кислот, также заряженных отрицательно. Это вызывает отталкивающие электростатические силы между ними и делает невозможной инкапсуляцию генетического материала внутри везикулы [25,27]. Фосфатидная кислота, фосфатидилглицерин и фосфатидилсерин, естественно содержащиеся в клеточных мембранах, являются отрицательно заряженными липидами, используемыми для синтеза анионных липосом. Некоторые из широко используемых анионных липидов для создания липосом приведены в Таблице 6. Использование анионных липосом в генотерапии впервые началось, когда Akhtar et al. [85] создали модель, изучающую нерецепторно-опосредованный транспорт ДНК или плазмиды с клеточной поверхности в тело клетки. Они также использовали анионные липосомы для переноса олигонуклеотидов в нейроны гиппокампа, индуцируя экспрессию трансгенов, что было безуспешно при использовании катионных липосом [85,86]. В другом исследовании анионные липоплексы (анионные липосомы в сочетании с ионами кальция, Ca²⁺, инкапсулирующие siRNA) использовались для подавления генов в культуре клеток рака молочной железы, утверждая, что они были первыми, кто открыл практическое использование анионных липосом без использования катионных липидов или полимеров для подавления генов. В результате эффективность этой оптимизированной комбинации была сравнима с катионными липоплексами (Lipofectamine 2000) [58]. Giulimondi et al. [51] создали липоплексы, объединив анионные липосомы с катионами (например, Ca2+, Mg2+, Fe2+ и т.д.) в качестве системы доставки генов с помощью подхода, аналогичного подходу Kapoor и Burgess [51,58]. Это было достигнуто благодаря тому, что двухвалентные катионы могли преодолеть взаимное электростатическое отталкивание анионной липосомы с фосфатом остова ДНК.

Table 6. Types of common anionic lipids used in formulating anionic liposomes.

Forssen и Tokes использовали анионные липосомы для инкапсуляции доксорубицина, противоопухолевого препарата, что невозможно при использовании нейтральных или катионных липосомных систем. Инкапсуляция катионного препарата в анионные липосомы позволила снизить кардиотоксичность при положительной противоопухолевой активности. Благодаря результатам, полученным Forssen e Tokes, анионные липосомы стали широко использоваться для доставки лекарств [87]. Это открытие привело к разработке Doxil, препарата гидрохлорида доксорубицина, инкапсулированного в липосому с покрытием из полиэтенгликоля (PEG) (HSPC/CHOL/DSPE-mPEG) для внутривенного введения. Это один из препаратов, одобренных Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), в котором используются анионные липосомы для лечения рака яичников и молочной железы. Помимо присоединения PEG к липосоме, Wang et al. [88] использовали phosphatidyl ethanolamine (PE) для создания анионной липосомной системы с положительно заряженным полимером полиэтиленимином (PEI), обладающим меньшей цитотоксичностью по сравнению с катионными липидами [88]. Этот состав был использован для инкапсуляции гена p21-siRNA-322, что стало возможным благодаря наличию положительно заряженного PEI и гиалуронана (HA), прикрепленного к поверхности липосомы. Chen et al. [89] обнаружили ген p21-saRNA-322, который может активировать ген p21 в клетке, чтобы остановить пролиферацию раковых клеток [89].

Анионные липосомные системы более стабильны в суспензии и плазме крови [31,84,85], поскольку они вызывают меньше агрегаций, чем нейтральные и положительно заряженные липосомы. Анионные липиды, такие как 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-рак-(1-глицерол) (DPPG), имеют высокую температуру фазового перехода, это увеличивает жесткость мембраны частиц, тем самым позволяя ей препятствовать проникновению сывороточных белков и липопротеинов в сыворотку. Однако Bozzuto et al. [90] сообщили о другом результате, согласно которому отрицательно заряженные липосомы менее стабильны при введении в кровоток, чем катионные и нейтральные липосомы [90]. Это объясняется электростатическими свойствами между отрицательным зарядом липосом и циркулирующими в крови белками. Это явление приводит к быстрому поглощению ретикулоэндотелиальной системой и эффекту цитотоксичности, что приводит к симптомам псевдоаллергии, таким как вазоконстрикция, легочная гипертензия, одышка, снижение количества тромбоцитов и лейкоцитов. Поэтому до сих пор ни один метод лечения не использовал анионную липосому в качестве носителя для лечения, предполагающего внутривенное введение.

Хотя присоединение полимеров к составу с помощью анионных липидов сможет предотвратить электростатическое взаимодействие в плазме или сыворотке, стабильность остается проблемой. Добавление полимерного компонента в рецептуру изменяет дзета-потенциал, размер, эффективность трансфекции, цитотоксичность, стабильность и поглощение частиц, что делает рецептуру сложной со многими параметрами, которые необходимо учитывать. Были предприняты попытки включить катионный полимер PEI в рецептуру анионных липосом. Однако получение правильного соотношения или баланса оказалось сложной задачей, так как слишком большое количество полимера в рецептуре изменит эффективность трансфекции из-за низкого уплотнения нуклеиновой кислоты внутри носителя и приведет к снижению стабильности. При использовании более высокомолекулярного полимера или увеличении соотношения N/P селективность и эффективность носителя для переноса генов снижается [91]. Хотя этот тип состава показывает многообещающие результаты in vitro, он не совсем успешен при введении in vitro из-за низкой стабильности при хранении или воздействии соли и сыворотки в биологической системе или среде [92,93]. Подводя итог, можно сказать, что анионные липосомы более стабильны в биологической среде, чем катионные липосомы. Однако для того, чтобы анионные липосомы стали подходящим носителем в генотерапии, необходимо внести изменения в их рецептуру, чтобы преодолеть электростатическое отталкивание отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты.

Цитотоксичность всегда была недостатком катионных липосом, и по этой причине многие исследовали анионные липосомы. Анионные липиды демонстрируют меньшую цитотоксичность по сравнению с катионными липосомами, в основном благодаря тому, что анионные липиды по своему составу схожи с естественными клеточными мембранами. Они обладают высокой иммунотолерантностью с высоким клеточным поглощением. Они также обладают потенциалом высокой эффективности трансфекции благодаря тому, что избегают эндосомного пути с прямым слиянием с клеточной мембраной и высвобождением своего груза в цитозоль. Несмотря на все эти положительные качества, использование анионных липидов в промышленных масштабах почти невозможно, поскольку оно очень сложно (в значительной степени полагаясь на тесты иммунолокализации, которые часто терпят неудачу из-за нарушения целостности мембраны), а стоимость его производства очень высока [93].

Kurosaki et al. [94], Hattori et al. [60] и Chen et al. [95] провели исследование, в котором они вводили в катионные липосомы отрицательно заряженные полимеры и продемонстрировали меньшую цитотоксичность. В этой конкретной стратегии в катионные липосомы инкапсулировали нуклеиновую кислоту. Уровень токсичности был значительно снижен благодаря экранирующему эффекту отрицательно заряженного полимера [60,94,95]. Исследователи также пытались присоединить положительно заряженные полимеры, такие как PEI, к анионным липосомам. С помощью этого метода они могут сделать поверхностный заряд носителя положительно заряженным. Однако встраивание PEI в анионные липосомы является сложной задачей, поскольку различные молекулярные веса PEI приводят к различным результатам цитотоксичности носителя. Согласно данным Ewe и др. [92] и Jerzykiewicz и др. [93], некоторые низкомолекулярные линейные PEI обладают значительной эффективностью и минимальной цитотоксичностью для успешного включения в липосомную формулу по сравнению с высокомолекулярными PEI [92,93].

Также был опробован другой подход, включающий разбавление заряда. Аналогичный подход применяется и к катионным липосомам. Однако, согласно данным Nchinda et al. [96], простое разбавление поверхностного заряда липосомной формулы нейтральным липидом не всегда снижает цитотоксичность, были случаи, когда это увеличивало цитотоксичность [96]. Более того, количество холестерина, используемое для формирования липосом с необходимыми свойствами, должно быть тщательно изучено [97]. Поскольку максимизация действия холестерина в липосомной формуле уже является сложной задачей, соотношение является решающим компонентом, который будет влиять на эффективность инкапсуляции липосом и трансфекцию.

Кроме того, при составлении липосомной формулы необходимо учитывать модификацию поверхности для длительной циркуляции, стабильность в циркуляции, цитотоксичность, поглощение клетками и эффективную доставку груза к цели [98]. Простое изменение комбинации липидов в рецептуре само по себе может вызвать осложнения; присоединение полимеров к рецептуре будет еще более сложным и трудным. Свойства липосомных комплексов с дополнительными вложениями на их поверхности должны быть оценены экспериментально для получения стабильных липосомальных систем, которые могут циркулировать в крови в течение более длительного периода времени, чтобы убедиться, что формула достаточно стабильна для работы лечебной системы. Следует избегать чрезмерной модификации поверхности липосомальной системы с помощью прикрепления, и она должна иметь возможность свободно взаимодействовать с клетками-мишенями [98]. По этим причинам многие предпочитают составлять липосомные составы с катионными липидами менее сложно. При правильном планировании, модификации и продуманной стратегии анионные липосомы все еще могут быть эффективны в качестве системы доставки генов, хотя для этого необходимо проделать еще много работы.

Анионные липосомы инициируют лучшую скорость эндоцитоза посредством макропиноцитоза, чем катионные и нейтральные липосомы [56,99]. Анионные липосомы не вступают в электростатическое взаимодействие, а создают электрическое отталкивание с клеточными мембранами. Отрицательно заряженные липосомы имеют меньше шансов подвергнуться фагоцитозу макрофагами из-за их сходства с клеточной мембраной хозяина, что приводит к более медленной кинетике удаления из организма хозяина и, следовательно, к лучшему удержанию в биологической системе [100]. Согласно выводам Kapoor M. и Burgess D., аналогичный путь поглощения катионных липосом может быть достигнут путем присоединения катионных ионов к их поверхности. Их результаты доказали, что анионные липосомы с катионами Ca²⁺ могут проникать в раковые клетки через клатрин и кавеола-независимые пути, аналогичные катионным липосомам [58]. После этой модификации липосомы не только ведут себя как катионные липосомы, но также было доказано, что они менее цитотоксичны, чем их аналоги с оптимальным составом. Кроме того, избыточная концентрация ионов кальция приводит к серьезной цитотоксичности; таким образом, необходимо достичь баланса для обеспечения безопасной и оптимальной работы липосом. Однако в последнее время растет интерес к разработке анионных липосом в качестве носителей для трансдермальной доставки лекарств благодаря их улучшенным свойствам проникновения через кожу. Гистологические исследования показали, что анионные липосомы диффундируют в дерму и нижнюю часть волосяных фолликулов через роговой слой и фолликулы более эффективно, чем катионные липосомы. Следовательно, быстрое проникновение отрицательно заряженных липосом будет способствовать увеличению проницаемости груза через кожу [90,101]. Анионные липосомы продемонстрировали значительное внутриклеточное поглощение при внутрикожном проникновении, но были не столь эффективны, как катионные липосомы. Анионные липосомы не вызывали значительного раздражения кожи, как это делают катионные липосомы, и обладают потенциалом эффективности и безопасности. В результате, анионные липосомные составы идеально подходят для использования в качестве системы доставки лекарств, а не носителя генов, так как анионные липосомы обладают превосходной проникающей способностью при меньшей токсичности, которой не обладают катионные липосомы. Кроме того, анионные липосомы с катионными ионами могут повысить эффективность инкапсуляции; тем не менее, для разработки жизнеспособного невирусного носителя генов с эффективным клеточным поглощением требуются дополнительные исследования.

Эффективность трансфекции анионных липоплексов была сравнима с катионными липосомами, но их токсичность была значительно ниже. Анионные липосомы показали способность высвобождать груз в своих полых везикулах быстрее, чем нейтральные липосомы [102]. Более того, анионные липосомы также продемонстрировали потенциал для использования в качестве системы доставки, особенно при доставке лекарств во внесосудистые участки, что недостижимо при использовании катионных липосом [38]. Тем не менее, создание анионных липосом в качестве носителя генов все еще возможно. Модификация может быть выполнена для преодоления отталкивающей силы одинаково заряженной поверхности между клеточной мембраной, потенциальным терапевтическим геном и анионными липосомами. Некоторые опробованные стратегии предполагают присоединение катионов к поверхности анионных липосом для имитации поверхности катионных липосом. Сообщалось, что среди всех испытанных двухвалентных катионов Ca²⁺ имеет самую высокую эффективность трансфекции благодаря более высокому сродству связывания нуклеиновых кислот [103,104]. Концентрация Ca²⁺ имеет решающее значение для создания эффективной системы доставки генов с низкой токсичностью. Если его использовать в избытке, то образуется липоплекс с размером частиц более 500 нм, что превышает идеальный размер частиц для трансфекции 200 нм, который способствует клатрин-опосредованному поглощению. Ca²⁺ может облегчить трансфекцию нуклеиновых кислот, но приведет к выпадению осадка, что приведет к неблагоприятной скорости трансфекции [50]. Кроме того, этот комплекс (Ca²⁺ и нуклеиновая кислота) показывает неравномерную трансфекцию из-за высокого содержания ионов кальция внутри клетки, вызывая взаимодействие с липидами клеточной мембраны, что приводит к перераспределению липидов и способствует токсичности.

Клеточная трансфекция катионных и анионных липосом была тщательно сравнена для выявления более благоприятной системы. Было установлено, что анионные и катионные липосомы проникают в клетку по совершенно разным и отличным путям. Отрицательно заряженные липосомы, как правило, поглощаются клеткой (эндоцитоз), а не вливаются в клетку, как это происходит с большинством крошечных катионных наночастиц. Хотя катионные липосомы и анионные липосомы большего размера попадают в клетку через эндоцитоз, их последующие пути сильно отличаются. Катионные липосомы могут инициировать эффект протонной губки, которая будет эффективно избегать эндосомно-лизосомного отделения, но анионные липосомы, с другой стороны, предпочитают эндосомно-лизосомный путь. Захваченные анионные липосомы будут немедленно перенесены в эндосомно-лизосомную систему с большей тенденцией к перевариванию, и не попадут непосредственно в цитозоль, как их положительно заряженный аналог. Этот эндосомно-лизосомный путь позволит ферментам лизосом переварить липосомный слой и высвободить груз, перенесенный в клетку. Поэтому, благодаря этому механизму, можно сказать, что анионные липосомы больше подходят для систем доставки лекарств в качестве носителя лизосомно-устойчивых реагентов и лизосомно-нацеленных препаратов. В связи с этим система трансфекции нуклеиновых кислот с использованием анионных липосом в качестве носителя не подходит без предварительных модификаций или корректировок [76], так как ферменты лизосом будут переваривать нуклеиновые кислоты.

Чувствительность к pH является основным недостатком анионных составов для переноса генов по сравнению с их катионными аналогами [88]. Кроме того, при синтезе анионных липосом требуются высокие концентрации липидов для повышения успешности формирования анионного липоплекса путем пассивной инкапсуляции нуклеиновой кислоты. Инкапсуляция нуклеиновых кислот возможна только тогда, когда поверхность нуклеиновой кислоты присоединена к катионным компонентам, таким как катионные полимеры или ионы (Ca²⁺). Дополнительные полимеры или ионы, присоединенные к грузу, увеличат его размер, что потребует большего количества липидных молекул для полной инкапсуляции нуклеиновой кислоты внутри носителя. Кроме того, анионные липосомы имеют низкую эффективность инкапсуляции, поскольку не способны конденсировать нуклеиновую кислоту, чего не происходит с их положительно заряженным аналогом. Это происходит в основном из-за отталкивающего электростатического взаимодействия между двумя анионными веществами [25,43,90]. В результате образуется большое количество пустых липосом, и чтобы преодолеть это, необходимо проводить повторяющиеся протоколы, такие как циклы замораживания-оттаивания и соникация. Эти процедуры, как правило, приводят к повреждению и деградации нуклеиновых кислот [105]. Конечно, присоединение катионных полимеров или ионов может преодолеть электростатическое отталкивание между анионными липосомами и нуклеиновой кислотой, но просто создать стабильную липосому с низкой цитотоксичностью, высокой эффективностью трансфекции и клеточным поглощением уже является сложной задачей без дополнительных присоединений или модификаций.

Была обнаружена еще одна стратегия, позволяющая использовать анионные липосомы в качестве невирусного вектора для инкапсуляции потенциальных терапевтических генов, преодолевая электростатическое отталкивание между анионной липосомой и отрицательно заряженной нуклеиновой кислотой. Липосомы с асимметричным распределением зарядов могут иметь разные чистые заряды липидов на своих внешних и внутренних листках [90]. Липосомы состоят из цвиттерионных липидов и холестерина в сочетании с катионными или анионными липидами. Этот метод позволяет инкапсулировать анионно-грузоподобную нуклеиновую кислоту с помощью анионного липида без электростатического отталкивания, поскольку внутренний листок состоит из нейтральных липидов. Независимо от идентичности липидов внешнего листка, липиды внутреннего листка могут быть выбраны для усиления липосомной загрузки заряженного груза. Это указывает на возможность независимой модификации липидов внешнего листка для улучшения биодоступности липидных везикул, биораспределения, эффективности захвата и медленной утечки, что наделяет модификацию липосомных рецептур безграничными возможностями.

Нейтральные липосомы обычно формируются с использованием нейтральных или цвиттерионных (могут быть отрицательно или положительно заряженными или оставаться нейтральными по заряду при физиологическом pH и, таким образом, будут изменяться в зависимости от окружающей среды) липидов, таких как фосфатидилхолин, холестерин и EPC нейтральные. В то же время DSPE (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин), DPPC (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин) и DOPE (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин) являются цвиттерионными [51]. В таблице 7 приведены широко используемые нейтральные липиды, применяемые для создания липосом. Bangham et al. [24] сформулировали первые нейтральные липосомы, используя комбинацию лецитина и холестерина. Однако нейтральные липосомы физически менее стабильны, поскольку их агрегационные свойства ниже коллоидной стабильности. Это связано с отсутствием заряда, который препятствует созданию стабильной агрегации с отрицательно заряженной нуклеиновой кислотой. Это отсутствует в заряженных липосомах, где заряженная поверхность вызывает электростатическое отталкивание, которое препятствует агрегации частиц [24,59,90]. Более того, естественное электростатическое притяжение между положительно (катионный липид) и отрицательно заряженными частицами (нуклеиновая кислота), образующими комплексы, более эффективно, чем нейтральные липиды. Однако их поверхностный заряд проще модифицировать для модуляции диффузии различных катионных и анионных веществ. Например, в их структуру можно вводить белки, а их состав можно изменять для воспроизведения особенностей широкого спектра природных мембран. Более того, предполагалось, что если липосомы смогут содержать белки, ферменты, лекарства или нуклеиновые кислоты, то будет сделан существенный шаг к полному воспроизведению in vitro мембран живых систем [59].

Table 7.

Типы распространенных нейтральных липидов, используемых при создании нейтральных липосом для доставки лекарств и генов.

Нейтральные липосомы демонстрируют более длительное время циркуляции при меньшей цитотоксичности, чем катионные липосомы, поскольку они не взаимодействуют с отрицательно заряженными белками в сыворотке и крови. Кроме того, было показано, что нейтральные липосомы в первую очередь присутствуют в опухолях и местах воспаления, поскольку к нейтральным липосомам легче применять активные стратегии нацеливания, чем к катионным липосомам, так как существуют неспецифические электростатические взаимодействия. Кроме того, нейтральные липосомы не вступают в значительное взаимодействие с клетками, что приводит к высвобождению нецелевого груза из липосом, поскольку взаимодействие между клетками и липосомами может происходить только при наличии электростатических взаимодействий со стороны заряженной поверхности [90].

Успешная инкапсуляция нейтральными липосомами может быть осуществлена с помощью нейтральных липидов, добавленных с этанолом и хлоридом кальция в водную смесь с нуклеиновой кислотой для образования липоплекса. DOPE является одним из широко используемых цвиттерионных липидов, применяемых при создании липосом, но существует риск агрегации из-за низкой коллоидной стабильности. Согласно выводам Krasnici et al., 2003, нейтральные липосомы могут инкапсулировать антрациклиновые препараты, такие как доксорубицин (DOX), эпирубицин (EPI), даунорубицин (DAU) и идарубицин (IDA), которые имеют катионный заряд [106]. Они создают комплексы с лучшей стабильностью и уменьшают утечку груза во время циркуляции до достижения целевого участка. Это позволяет доставлять их в опухолевые очаги без проявления побочных эффектов на организм хозяина. Поскольку катионные препараты и нуклеиновые кислоты заряжены положительно, разумно предположить, что один и тот же липосомный состав может быть использован в качестве носителя генов без существенной модификации рецептуры.

Нейтральные липосомы также имеют замедленную очистку in vitro по сравнению с катионными липосомами [55]. В отличие от анионных и катионных липосом, после введения нейтральных липосом в организм хозяина они быстро очищается. Анионные липосомы идентифицируются как инородные частицы, которые в конечном итоге оказываются в ретикулоэндотелиальной системе [90]. Что касается катионных липосом, то они притягиваются к белкам плазмы, образуя на своей поверхности коронарный слой, а затем покрываются антителами, которые затем поглощаются фагоцитами [107]. Исходя из этих результатов, можно сказать, что создание функциональных липосом с использованием только одного типа липидов невозможно, учитывая имеющиеся ограничения. Однако комбинация различных типов липидов может изменить характеристики и, таким образом, сделать носитель более функциональным. Поэтому нейтральные липиды обычно используются в качестве вспомогательных липидов в анионных или катионных липосомах или нейтральных везикулах с заряженными ионами для создания полнофункциональной системы доставки.

Нейтрально заряженные липосомы имеют более низкую коллоидную стабильность по сравнению с заряженными липосомами. Это в значительной степени объясняется отсутствием электростатических отталкивающих сил, которые предотвращают агрегацию [55]. Чтобы компенсировать отсутствие заряда, в нейтральные липосомы вводили положительно заряженные ионы или молекулы, чтобы придать им характерный заряд на поверхности для улучшения функциональности. Хитозан, положительно заряженная молекула, является одним из таких вариантов, используемых для покрытия нейтральных липосом, изготовленных из холестерина или фосфатидилхолина, для повышения их стабильности. Channarong et al. [108] сформулировали это, доставляя вакцину из нуклеиновой кислоты для таргетинга в Peyer's patch [108]. Обычно улучшенная стабильность достигалась при использовании холестерина в рецептуре липосом. Это объяснялось улучшенной жесткостью, позволяющей более плотно собрать фосфолипиды. Это предотвращает агрегацию и тесно упакованные структуры от проникновения или привлечения сывороточных белков и улучшает время циркуляции крови [109].

Исследователи также пытались уменьшить многовалентность положительно заряженных липидов путем добавления холестерина в синтез липосом в качестве вспомогательного липида. В результате они образуют более стабильные комплексы и лучше работают при введении in vitro. Добавление холестерина в синтез катионных липосом позволило увеличить концентрацию исходных катионных липидов, тем самым увеличив количество инкапсулируемой нуклеиновой кислоты в рецептуре без изменения стабильности липосом и грузовых комплексов [55]. Без холестерина в рецептуре заряженные частицы будут агрегировать из-за низкого электростатического отталкивания и образовывать преципитаты, способствуя увеличению размера частиц. Кроме того, было обнаружено, что добавление холестерина в рецептуру липосом может снизить проницаемость и повысить их стабильность. Это происходит потому, что холестерин может упаковывать более плотные фосфолипиды, тем самым предотвращая дестабилизацию липосом [108]. Поэтому нейтральные липиды в основном используются в качестве вспомогательных липидов и стабилизаторов в рецептурах липосом, а не как основной компонент при разработке невирусного носителя для генной терапии.

Многие утверждают, что нейтральные липосомы нетоксичны или обладают очень низкой токсичностью, так как нейтральные липиды могут быть найдены естественным образом в клетках [61]. Нейтральные липиды в основном получены из клеточной мембраны, что делает их нетоксичными и стабильными в кровообращении, поскольку они не взаимодействуют с белками, присутствующими в сыворотке и крови, как это делают другие заряженные носители [90]. Pisani et al. [59] сравнили катионные и нейтральные липосомы на предмет их стабильности в сыворотке крови и цитотоксичности. Они обнаружили, что нейтральные липосомы показывают лучшую стабильность по сравнению с катионными липидами из-за отсутствия заряда, который имеет тенденцию взаимодействовать с солью и другими частицами в сыворотке и крови, что впоследствии приведет к цитотоксичности [59].

Нейтральные липосомы могут быть использованы в качестве везикул-носителей, при этом поверхность везикул может быть модифицирована для инкапсуляции и трансфекции нуклеиновой кислоты. Это отличный кандидат, поскольку он демонстрирует отличную стабильность, практически не токсичен и не подвергается быстрому удалению. Более того, он не будет обнаружен как инородная частица и пройдет через опсонизацию. Нейтральные липиды также могут улучшить формулу катионных или анионных липосом, выступая в качестве вспомогательных липидов для более оптимальной работы по трансфекции клетки и снижения цитотоксичности. Вспомогательные липиды, такие как 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) и холестерин, были использованы в рецептурах для повышения эффективности трансфекции в заряженных липосомах. В основном это связано с тем, что нейтральные липиды позволяют носителю легко сплавляться и дестабилизировать бислойные мембраны, облегчая выход груза из эндосом внутри клетки и помогая клеточному поглощению путем проникновения через клеточную мембрану [59].

Нейтральные липиды, такие как холестерин, также действуют как линкеры для присоединения других компонентов, таких как полимеры и белки. Цвиттерионные липиды, такие как DSPE и DOPE, обычно используются для присоединения полимеров и белков с ковалентным связыванием к поверхности липосом. Большинство выбирает стратегию ковалентного связывания вместо нековалентного связывания, так как связь, образующаяся при ковалентном связывании, более стабильна и воспроизводима по сравнению с методом нековалентного связывания [110].

Липосомные составы с нейтральными липидами лучше усваиваются клетками, чем составы без них. Возьмем, к примеру, холестерин; он может проходить через специфический метаболический путь для поглощения в клетке с участием специфических рецепторов, инициирующих деление липосом. Согласно результатам, полученным Kang et al. [56] с помощью визуализации живых клеток, нейтральные липосомы попадают в клетку через кавеоло-опосредованный эндоцитоз, что делает возможным высокое клеточное поглощение, поскольку этот путь позволит нейтральным липосомам эффективно избежать деградации лизосом в клетке [56]. По этому пути цитозольная кавеолярная везикула формируется путем отрыва кавеолы от мембраны, что опосредуется ГТФазой динамином. Эта везикула формируется внутри клетки (кавеосома) и не содержит ферментативного деградирующего коктейля, который присутствует в лизосоме, и транспортируется в эндоплазматический ретикулум. В отличие от клатрин-опосредованного эндоцитоза, где частицы в конечном итоге будут деградированы лизосомой, считая ее единственным путем. Кавеола-опосредованный эндоцитоз имеет альтернативный путь, запускаемый лигандами, такими как фолиевая кислота, альбумин и холестерин на частицах, что позволяет им избежать деградации лизосом. Многие патогены используют этот путь, чтобы избежать деградации лизосомными ферментами [111].

Цвиттерионные липиды, такие как DOPE, DPPC и DSPC, имеют другую стратегию, когда они могут пройти через эндосомы, чтобы предотвратить деградацию груза и обеспечить успешную доставку груза в цитозоль. Поскольку цвиттерионные липиды чувствительны к рН, при более низком рН (в цитозоле клетки) цвиттерионные липиды претерпевают изменения, превращаясь из ламеллярных структур в перевернутые мицеллы, что вызывает объединение липосомной и эндосомной мембран, таким образом, дестабилизируя эндосомы и приводя к высвобождению груза [111]. Однако эта стратегия будет сложной при введении липосомной рецептуры с цвиттерионными липидами in vitro из-за стабильности липосом в присутствии сыворотки. Исходя из этого, нейтральные липосомы и заряженные липосомы имеют совершенно разные пути клеточного поглощения. Кроме того, нейтральные липосомы или цвиттерионные липосомы менее склонны к связыванию белков, что может снизить скорость клеточного поглощения по сравнению с другими заряженными липосомами [112].

Катионные носители имеют серьезные недостатки, влияющие на эффективность трансфекции, такие как цитотоксичность по отношению к клеткам, уменьшение размеров клеток, ингибирование протеинкиназы С и ограниченная стабильность их комплексов с плазмидной ДНК в сыворотке. Эти причины обуславливают нынешнее ограничение на широкое коммерческое использование катионных липосом. Таким образом, в настоящее время активно исследуется и рассматривается другая альтернатива, менее токсичная для клетки, в виде нейтральных липосом. Трансфекция может происходить только тогда, когда нуклеиновая кислота попадает в ядро или диссоциация происходит в ядре [31]. Поэтому распаковка липосом с комплексами нуклеиновых кислот имеет решающее значение для высвобождения нуклеиновой кислоты, и высвобождение должно происходить как можно ближе к ядру. Если высвобождение происходит далеко от ядра, нуклеиновой кислоте будет сложно попасть в ядро, и высока вероятность ее деградации.

Трансфекция клеток оказалась сложной техникой, состоящей из множества этапов, что замедляет разработку эффективных и безопасных терапевтических приложений. Чистые нейтральные липосомы, такие как диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), имеют очень низкую эффективность трансфекции при доставке нуклеиновой кислоты (зеленый фонарь), даже при добавлении катионных ионов, таких как Mg²⁺ и Ca²⁺ Когда в рецептуре использовалась комбинация двух различных нейтральных липидов, DOPC и 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-гексаноиламинов, эффективность трансфекции повысилась в шесть раз [59,113]. Сравнение двух различных цвиттерионных липидов, включенных в катионные липосомы, показало, что один из них более эффективен в улучшении трансфекции, чем другой. При комбинировании четырех типов липидов (DOTAP/DOPC/DOPE/DC-Chol) эффективность трансфекции была выше, чем при использовании DOTAP/DOPC и DOPE/DC-Chol по отдельности [114]. Этот результат показывает возможность использования нейтральных липосом в качестве носителей генов при наличии соответствующих условий и правильной стратегии их составления.

Холестерин естественным образом присутствует и распределен в мембранах эукариотических клеток и плазматических мембранах. Группа исследователей из Чикагского университета обнаружила, что увеличение концентрации холестерина в культуре клеток фибробластов человека вызывает перемещение дополнительного холестерина во внутриклеточные компартменты клетки [115]. С тех пор холестерин используется в качестве основного и вспомогательного липида при создании липосом для доставки генов, поскольку он демонстрирует лучшие преимущества по сравнению с другими нейтральными липидами. Сообщалось, что добавление холестерина в катионные липосомы может повысить эффективность липосом по сравнению с составами без него. Липосомные составы с холестерином демонстрируют более эффективный выход из эндосомы, что впоследствии приводит к повышению эффективности трансфекции [31,73]. Эффективность липосомной формулы покажет различную эффективность трансфекции в различных типах клеточных линий, различных типах груза и месте, которое необходимо трансфецировать.

Нейтральная липосомная формула не может работать оптимально без модификаций или дополнений. Для создания функциональной ген-терапевтической системы на основе липосом в качестве одной из форм ген-терапевтического лечения рака молочной железы использовались различные подходы и модификации. Гиалуроновая кислота (ГК) была включена в липосомную формулу, чтобы увеличить нацеленность воздействия на клетки рака молочной железы, поскольку ГК связывается с CD44, который избыточно экспрессируется в опухолевых клетках [89,116]. Hayward et al. [116] провели инновационную работу, в ходе которой они ввели ген miR-125a-5p в HER2-положительные метастатические клетки рака молочной железы (21MT-1) с помощью нейтрально заряженной липидной системы, состоящей из L-α-фосфатидилхолина (PC), пальмитоил-sn-глицеро-3-фопшоэтаноламина (DPPE) и холестерина (CHOL), покрытых гиалуроновой кислотой. Эта липосомная формула была использована для инкапсуляции гена miR-125a-5p. Он существенно ингибировал экспрессию HER2, клеточную пролиферацию и миграцию в клеточной линии 21MT-1 через сигнальные пути PI3K/AKT и MAPK [116]. Это исследование сходно с методом целенаправленного воздействия липосомной рецептуры Chen et al. [89], которые используют НА в качестве целенаправленно действующего лиганда в своей липосомной рецептуре, что обсуждалось ранее [89].

Аптамеры потенциально связываются с широким спектром молекулярных мишеней с высокой аффинностью и специфичностью, поэтому конъюгирование аптамеров с липосомами улучшает активное нацеливание. В данной работе была исследована липосомальная система доставки siRNA с грузом из комплекса siRNA:протамин и оболочкой, предназначенной для активного нацеливания на CD44-экспрессирующие клетки с использованием анти-CD44 аптамера (Apt1) в качестве направляющего лиганда. siRNA была инкапсулирована в липосому, состоящую из DPPC, холестерина и DSPE-PEG с аптамерами Apt1, содержащими 2'-F-пиримидины. Этот новый некатионный метод был протестирован in vitro и in vitro для глушения репортерного гена люциферазы (luc2) в модели трижды-отрицательного рака молочной железы. Препарат ингибировал luc2 in vitro с помощью функционализированных аптамерами липосом, нагруженных siRNA, и пролонгировал ингибирование in vitro [117].

В другом исследовании использовались антитела против чрезмерно экспрессированного гепарин-связывающего эпидермального фактора роста в клеточной линии MDA-MB-231 и опухоли рака молочной железы TNBC. Эти таргетные антитела были конъюгированы с анионными липосомами, содержащими димиристоилфосфоглицерин (DMPG), дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль (DSPE-PEG) 5000 и конъюгированные с малеимидом DSPE-PEG5000 (DSPE-PEG-mal), DOPE и холестерин, инкапсулирующие терапевтическую siRNA, чтобы вызвать глушение генов. Результаты показали, что этот состав имел длительную циркуляцию в крови со способностью накапливаться в опухоли и ингибировал выработку белка PLK1 и рост опухоли [118]. Liu et al. [119] исследовали молекулярно-направленную и основанную на синтетической летальности терапию siRNA для лечения TNBC, в которой в качестве носителя siRNA использовался катионный липид с наночастицами поли(этиленгликоль)-b-поли(D,L-лактид). Доставка siRNA, нацеленной на циклин-зависимую киназу 1 (CDK1), вызвала снижение жизнеспособности клеток вследствие их апоптоза через RNAi-опосредованное ингибирование экспрессии CDK1. Это наблюдалось только в клетках TNBC с избыточной экспрессией c-Myc (SUM149 и BT549), но не в нормальных эпителиальных клетках молочной железы (MCF 10A), это указывает на то, что синтетическая летальность с участием c-Myc и CDK1 была специфична только для клеток TNBC. В испытаниях in vitro лечение подавляет рост опухоли у мышей, несущих ксенотрансплантаты SUM149 и BT549, не вызывая при этом системной токсичности или активации врожденного иммунного ответа, что предполагает терапевтический потенциал для c-Myc избыточно экспрессируемого в трижды-отрицательном раке молочной железы [119].

Липосомы все чаще используются для введения лекарств с 1994 года, когда FDA одобрило первую нано-систему доставки лекарств на основе PEGилированных липосом, Доксил® [81,120]. Хотя инкапсулирование лекарств в липосомы снижает токсичность и позволяет увеличить терапевтическое введение лекарств пациентам с раком молочной железы, общая эффективность не является существенной, поскольку пациенты по-прежнему испытывают побочные эффекты, такие как кардиотоксичность и алопеция. Как носитель, липосомы отвечают всем критериям подходящего средства доставки, включая биоразлагаемость, биосовместимость и стабильность. При введении пациенту липосомы могут защитить груз от деградации и снизить неспецифическую токсичность, а также они просты в производстве и разработке для целевой доставки [26]. Хотя липосомы достаточно хорошо зарекомендовали себя в качестве средства доставки лекарств, ни одна липосомная формула, используемая в качестве носителя генов, не была узаконена в качестве формы лечения рака молочной железы. В таблице 8 приведены липосомные составы, оцененные для различных форм стратегии генотерапии рака молочной железы, которые были опубликованы. Эти успешные составы для различных типов рака молочной железы позволят лучше понять, как создать оптимальную липосомную формулу. Это позволит сузить круг возможных составов, которые будут стабильны в сыворотке крови, обладать минимальной цитотоксичностью, высоким клеточным поглощением и высокой эффективностью трансфекции. В данном обзоре рассматриваются несколько подходов и стратегий для создания эффективных липосомальных носителей генов для лечения рака молочной железы.

Table 8. Successful liposome formulations tested on breast cancer cell lines with gene cargo and their type of study reported in publications.

Эти исследования показывают, что катионные липосомы предпочтительнее анионных и нейтральных липосом в качестве их липосомной основы. Их легче собрать вместе с небольшими модификациями для создания функционального невирусного носителя генов. Нейтральные липосомы также показали свой потенциал благодаря способности к модификации путем использования различных вложений, таких как полимеры, аптамеры, пептиды, антитела и чрезмерно выраженные рецептор-связывающие лиганды, такие как гиалуроновая кислота. Представленные комбинированные стратегии доказали, что липосомные составы являются адаптируемыми и могут быть легко модифицированы в желаемое средство для лечения рака молочной железы. Однако составление правильной комбинации липидов в липосомной формуле является довольно утомительной задачей, а модификация поверхности и присоединение дополнительных компонентов делают создание функционального невирусного носителя генов еще более сложной задачей. Еще больше невирусных носителей генов на основе липосом в настоящее время находятся на стадии разработки и в будущем могут перейти к доклинической разработке для лечения рака. Для точного клинического и коммерческого перехода требуется более широкое использование таргетных лигандов, специфичных для избыточно экспрессированных рецепторов в метастатических участках, комбинация методов лечения на примере лекарственной терапии и генотерапии с последующей оптимизацией системы лечения, чтобы сделать их адаптируемыми in vivo к сложным задачам. Несмотря на трудности, липосомы обладают потенциалом для преодоления существующих клинических препятствий и формирования будущего сценария лечения, уменьшая страдания, связанные с традиционной химиотерапией и хирургическим вмешательством. Несмотря на многочисленные одобренные и продолжающиеся клинические испытания, все еще требуются значительные усилия для преодоления физиологических барьеров, препятствующих использованию липосомных систем доставки генов в качестве метода лечения рака молочной железы. Стратегии лечения генной терапии на основе липосом, несомненно, станут опорой для будущих прорывов и прогресса в персонализированной медицине, прокладывая путь для расширения сотрудничества с экспертами в области клинической онкологии, фармакокинетики, токсикологии, иммунологии и нанотехнологий и открывая двери для других лучших альтернативных методов лечения рака и даже других генетически связанных заболеваний.

Как правило, катионные липосомы, обладающие положительно заряженными свойствами, создают электростатическое взаимодействие с нуклеиновой кислотой и клеточными мембранами, которые в природе являются анионными или отрицательно заряженными. Проблемы цитотоксичности и стабильности положительно заряженных липосом могут быть преодолены путем модификации их поверхностной мембраны или комбинации липидов. Их внутриклеточная активность, включающая высвобождение груза в цитозоль вместо его транспортировки в эндосому, делает катионные липосомы потенциальным средством переноса генов для стратегии направленной генотерапии с высокой эффективностью трансфекции. Поэтому липосомы рассматриваются как возможная стратегия невирусных наночастиц, используемых в генотерапии и как средство переноса лекарств в системах доставки лекарств. Потенциал липосом в указанных методах лечения обусловлен их гибкостью в модификации для получения наиболее оптимальной функциональной системы с желаемыми свойствами в качестве транспортного средства в этих методах лечения, либо путем использования липосом в их базовой липосомной формуле, либо путем добавления других веществ, таких как полимеры, пептиды, белки, полинуклеотиды, поликатионы, лиганды или рецепторы, которые также могут быть использованы для преодоления цитотоксичности и повышения эффективности трансфекции липосом.

Было показано, что анионные липосомы обладают меньшей цитотоксичностью и высокой стабильностью в биологической среде, чем катионные липосомы. Тем не менее, трансфекция голых анионных липосом в клетку невозможна из-за силы отталкивания их отрицательно заряженной поверхности с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами и клеточными мембранами. Таким образом, необходимы модификации, особенно на поверхности анионных липосом. Модификация может быть осуществлена путем присоединения катионных молекул к поверхности анионных липосом, но за это приходится платить. Присоединение катионных молекул к поверхности анионных липосом повышает токсичность катионов. Таким образом, необходимо установить пороговую концентрацию катионов и не превышать ее, чтобы предотвратить неблагоприятные последствия, которые может вызвать катионная токсичность, например, агрегацию. Учитывая все эти параметры, формулирование хорошего транспортного средства для анионных липосом может быть более утомительным и трудно контролируемым.

Кроме того, анионные липосомы имеют другой путь межклеточного поглощения по сравнению с катионными липосомами. В большинстве случаев анионные липосомы попадают в эндосомально-лизосомную систему, в результате чего груз усваивается в клетках. Поэтому анионные липосомы более пригодны и менее сложны для создания систем доставки лекарств, учитывая, что в системах доставки генов их не так много. Однако их успех в стратегиях доставки генов все еще под вопросом.

Нейтральные липосомы являются наименее цитотоксичными системами, поскольку их структура схожа с составом клеточной мембраны и в них отсутствует какой-либо особый компонент, запускающий цитотоксические механизмы. Однако нейтральные липосомы затрудняют нацеливание, поэтому для достижения такой функции необходимы лиганды или присоединение липидных модификаций. Поэтому, как и анионные липосомы, нейтральные липосомы чаще всего используются для доставки лекарств и не находят широкого применения в генотерапии, поскольку отсутствует поверхностный заряд, способствующий инкапсуляции отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты. Однако в последние годы были предприняты усилия по использованию нейтральных липосом в качестве носителей генов с помощью различных стратегий и подходов, особенно для генотерапии. В большинстве случаев модификация нейтральных липосом осуществляется путем присоединения катионов (Ca²⁺, Mg²⁺) и положительно заряженных полимеров к поверхности липосомы для компенсации отсутствия заряда, улучшения эффективности инкапсуляции и поглощения клетками, но без цитотоксичности, которая обычно обусловлена высоко положительным зарядом катионных липосом. Присоединение полимеров к липосомам препятствует расщеплению липосом, нейтрализуя заряд поверхности липосомы, что защищает ее от присоединения белков в сыворотках и защищает заряд заряженной липидной формулы. Нейтральные липиды жизненно необходимы в качестве вспомогательных компонентов в рецептурах катионных и анионных липосом, выступая в роли вспомогательных липидов для рецептуры. Включение нейтральных липидов в составы заряженных липосом уменьшает заряд всей липосомы, что приводит к снижению цитотоксичности, лучшему поглощению клетками и эффективности трансфекции. Ссылаясь на резюме обзора, представленного в таблице 9, можно сказать, что липид, наиболее подходящий для использования в качестве носителя для генотерапии, конкретно для лечения рака молочной железы, является катионным, нейтральным липидом, за которым следует анионный липид. Существует еще много пробелов в информации о формулировании наиболее оптимальной липосомы в качестве носителя генов, и многие открытия считаются важными, но еще не сделаны.

Table 9. Резюме преимуществ и недостатков катионных, анионных и нейтральных липосом, используемых в качестве невирусного носителя генов, в частности, для генной терапии.

На основании сравнения катионных, анионных и нейтральных липосом можно сделать вывод, что разработка потенциальной системы генjтерапии рака молочной железы принесет наибольшую пользу, если в качестве основы системы доставки использовать катионные липосомы, поскольку они обладают большей способностью инкапсулировать нуклеиновую кислоту, демонстрируют большой потенциал благодаря положительному заряду поверхности, влияющему на внутриклеточную активность, и гибкость в модификации для разработки более благоприятного лечения на основе генотерапии. Необходимо провести дополнительные исследования, чтобы определить, какие комбинации липидов могут дать наилучшую формулу для генной терапии, стабильную, с низкой цитотоксичностью, высоким клеточным поглощением и высокой эффективностью трансфекции. Более того, разработка оптимальной липосомной рецептурной основы с оптимальной функциональностью облегчит изучение полимеров, аптамеров, пептидов, антител и присоединение лигандов для создания терапевтической системы.