Для регенерации кости и хряща крайне важно стимулировать пролиферацию или дифференцировку остеобластов и хондробластов. При устранении обычных дефектов кости или хряща в клинике предпочтение отдается фиксации и шовному восстановлению. В то время как большие костные дефекты всегда требуют пересадки аутологичной или аллогенной кости, что имеет многочисленные побочные эффекты, такие как хроническая боль, повреждение нервов, инфекция, высокий риск передачи заболевания и иммунное отторжение [1]. Кроме того, имплантация ортопедических материалов является еще одной важной стратегией лечения в современной клинике. Однако часто сообщается о долгосрочных проблемах биосовместимости некоторых широко используемых не рассасывающихся биоматериалов, таких как полиэфиркетон (PEEK) и полиметилметакрилат (PMMA), которые могут вызвать некоторые неизбежные недостатки, такие как остеолиз, необходимость вторичной операции и увеличение риска послеоперационных осложнений (Таблица 1) [2].

Table 1. Comparison of mainstream bone and cartilage repair methods.

Редактирование генов считается монументальной технологией в науке о жизни. Первые методы основывались на сайт-специфической идентификации локусов ДНК на основе нуклеаз, включая нуклеазы с цинковыми пальчиками (ZFNs) и нуклеазы с эффектором, похожим на активатор транскрипции (TALENs) [3]. Однако трудности в конструировании и синтезе белков ограничивали широкое применение этих нуклеаз [4,5]. В 1980-х годах был найден защитный механизм некоторых прокариот против вируса, основанный на последовательности, названной Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), для идентификации экзогенной патогенной ДНК [6]. CRISPR управляется РНК и является эпохальным в современном применении редактирования генов благодаря специфичности и кодируемости последовательностей РНК [7]. Ген в локусе CRISPR, расположенный поблизости, был назван CRISPR-ассоциированным (Cas). После многолетних исследований зрелая система CRISPR была упрощена и состояла из двух частей: одиночной направляющей РНК (sgRNA) и нуклеазы в виде CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9). С тех пор технология CRISPR/Cas9 оказала огромное влияние на сферу науки о жизни, а исследования были отмечены Нобелевской премией по химии в 2020 году.

В области восстановления костей и хрящей система CRISPR/Cas9 как технология редактирования генома третьего поколения может преодолеть многие недостатки традиционных стратегий. Она может обеспечить мощную способность регулировать последовательность генома и экспрессию генов, что может изменить или исправить функцию генов и дефекты на длительный срок для достижения терапевтического эффекта на генетическом уровне. Обычно восстановление костей и хрящей регулируется несколькими факторами роста, такими как трансформирующий фактор роста (TGF-β), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) [8], [8]a), [8]b), [9], [9]a), [9]b). Кроме того, некоторые связанные с остеогенезом белки, такие как щелочная фосфатаза (ALP), костный морфогенетический белок (BMP) и остеокальцин (OCN), также участвуют в синтезе и минерализации костного матрикса, а также в росте и дифференцировке остеобластов [10], [10]a), [10]b), [11]. Генотерапия для восстановления костных и хрящевых дефектов обычно включает введение в организм фрагментов целевых генов, чтобы продукты относительной экспрессии устойчиво экспрессировались в последующем восстановлении с целью стимулирования остеогенеза.

В отличие от прямого регулирования факторов, связанных с остеогенезом, система CRISPR/Cas9 может перепрограммировать плюрипотентные стволовые клетки и вызвать их дифференцировку в кость или хрящ [12]. Используя многофункциональные свойства дифференцировки мезенхимных стволовых клеток костного мозга (BMSCs), BMSCs широко используются для лечения и восстановления костей и мягких тканей и являются жизнеспособным подходом к регенерации костной ткани [13]. По сравнению с традиционной генотерапией, система CRISPR/Cas9 позволяет точно вставлять, нокаутировать и редактировать целевые гены. Она может не только обойти системные побочные эффекты традиционной хирургии и обычных лекарств, но и вызвать сразу большое количество фенотипических белков, чтобы завершить лечение целенаправленно, обеспечивая новый перспективный путь для восстановления костей и хрящей (рис. 1).



Fig. 1. Schematic diagram of CRISPR/Cas9 genome editing for bone and cartilage repair.

В последние годы стремительные достижения в области молекулярной биологии и геномики значительно расширяют возможности методов редактирования генов в лечении заболеваний костей и хрящей. Здесь система CRISPR/Cas9, как самый мощный инструмент геномной инженерии, выигрывает за счет программируемой РНК, которая может быстро генерировать специфические последовательности и легко выполнять прикладные задачи [14]. В данном обзоре мы представили всестороннее обсуждение молекулярных механизмов и технических принципов работы системы CRISPR/Cas9, а также подробно описали классификацию и ход исследований векторов доставки. Мы осветили применение и проблемы системы CRISPR/Cas9 для стимулирования остеогенеза и хондрогенеза.

Как правило, CRISPR состоит из лидера (промотора), повторов и геномно-целевых последовательностей (спейсеров) [15]. Когда экзогенный ген внедряется в прокариотический организм, оригинальный спейсер в его геноме распознается белками Cas через последовательность protospacer adjacent motif (PAM), расположенного ниже по течению от оригинального спейсера, и затем разрезается (рис. 2A). Белки Cas вставляют обрезанный оригинальный спейсер в середину лидера и повтора, образуя новый спейсер [16]. А-Т-богатый лидер содержит промотор, который используется для инициации транскрипции последовательностей повтора и спейсера. Транскрибированная длинноцепочечная РНК называется транскриптом-предшественником CRISPR РНК (pre-crRNA), который затем перерабатывается в зрелую CRISPR РНК (crRNA) с помощью соответствующих ферментов [17]. Cas белки могут образовывать новые комплексы Cas белков вместе с crRNA и транс-активирующей crRNA (tracrRNA). Одиночная направляющая РНК (sgRNA), образующаяся в результате слияния crRNA и tracrRNA, комплементарно сопрягается с экзогенным геном и направляет белок Cas на вырезание (shear) фрагмента экзогенного гена [18].



Fig. 2. A) Schematic diagram of the CRISPR/Cas9 system. Starting with the Cas1-Cas2 complex, the target sequence is recognized by PAM and later integrated into the host sequence during the adaptation phase. During the crRNA maturation phase, the transcribed long-stranded RNA is called precursor transcript CRISPR RNA (pre-crRNA), which is then processed into mature CRISPR RNA (crRNA) by related enzymes. In the final interference phase, crRNA induces Cas protein to shear the exogenous gene fragment. Reproduced with permission [151]. Copyright 2020, The Authors. B) Cas9 can cleave exogenous DNA into double DSB DNA. There are two repair methods: the first is NHEJ and the other is HDR.

Распознавание целевой ДНК системой CRISPR/Cas9 отличается от традиционных методов редактирования генов, управляемых белками, тем, что в ней используются малые молекулы последовательностей РНК, что не только позволяет избежать громоздкой белковой инженерии, связанной с распознаванием ДНК, но и значительно повышает ее применимость для высокопроизводительных геномных манипуляций или скрининга [19]. Как упоминалось ранее, Cas9 должен собраться вместе с crRNA и tracrRNA, чтобы сформировать новый комплекс для распознавания и расщепления целевой ДНК. sgRNA комплекса Cas9 соответствует целевой ДНК мишени по принципу сопряжения оснований Уотсона-Крика, локализуясь в определенном месте [20]. Последовательность PAM, которая находится рядом с этим специфическим участком, представляет собой короткую последовательность, связанную со специфическим белком Cas и необходимую для комплементарного соединения [21]. Различные Cas белки часто соответствуют различным коротким последовательностям, например, Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9) соответствует 5'-NGG-3' [22]. Относительно простая последовательность PAM имеет большую вероятность появления в геноме и более благоприятна для широкого использования Cas9. Последовательность из золотистого стафилококка - 5'-NNGRRT-3', а более длинная последовательность PAM повышает специфичность распознавания и одновременно помогает предотвратить вне-целевые эффекты [23]. После связывания с целевым геном комплементарная одноцепочечная (комплементарно спаренная с crRNA) и некомплементарная одноцепочечная нити целевого гена распознаются и разрезаются структурными доменами HNH и RuvC Cas9 соответственно, производя двухцепочечный разрыв (DSB) на плоском конце целевого гена [24].

Существуют три различные системы Cas, использующие разные механизмы. Тип I и тип III требуют большого белкового комплекса, состоящего из различных Cas белков, для разрезания целевого гена, в то время как тип II требует только одного Cas белка, такого как Cas9 [25]. Cas9 в системе CRISPR типа II может разрезать экзогенную ДНК в двойные DSB. Существует два типа методов репарации при разрезании двойной нити ДНК (рис. 2B). Первый - негомологичное соединение концов (NHEJ), которое срочно соединяет разорванные концы двойные нити ДНК, подобно спонтанной репарации "SOS" (сигнал "спасите наши души") в живых организмах. Однако этот метод восстановления является стохастическим и сопровождается мутациям вставки или делеции, которые могут повредить целевой ген [26]. Другой - гомологически-направленная репарация (HDR), которая представляет собой небольшой фрагмент ДНК (шаблон) с одинаковой последовательностью на обоих концах, причем эта шаблонная последовательность может быть гомологически рекомбинирована с разрезанным геном, что завершает точную рекомбинацию гена [27]. Наиболее часто используемой синтетической системой CRISPR является система CRISPR типа II, в которой используется один разрез белка Cas9. Ее удобство и скорость придают ей потенциал, который нельзя недооценивать в медицинской и научной областях.

CRISPR/Cas9 изменяет текущее статус-кво с использованием одного традиционного метода лечения при заболеваниях костной и хрящевой ткани. Как мощный инструмент редактирования генов, системы CRISPR/Cas9 необходимо доставить в мишени костной ткани, такие как синовиальная мембрана полости сустава или хрящевая ткань, что позволяет обеспечить долгосрочную стабильную экспрессию определенного гена для обеспечения конечной терапевтической цели. Многие распространенные физические методы доставки ограничены в применении in vivo, несмотря на высокую эффективность доставки. На сегодняшний день все большее внимание привлекают невирусные векторы на основе нанотехнологий или обычные вирусные векторы. В данном случае следует сосредоточиться на векторах доставки/переноса системы CRISPR/Cas9 (рис. 3). Для того чтобы оценить потенциал применения обычных методов доставки, особенно важно рассмотреть преимущества и недостатки различных методов в комплексе (табл. 2).



Fig. 3. Classification of CRISPR/Cas9 delivery methods.

Table 2. Methods of CRISPR/Cas9 transfer.

Физические методы доставки включают электропорацию, магнитофекцию, микрофлюидику, ультразвук и микроинъекцию [28-32].

Ранее электропорация широко использовалась в качестве невирусного метода доставки для трансфекции клеток. Электропорацию также называют электротрансфекцией. Электротрансфекция временно увеличивает проницаемость клеточной мембраны путем приложения к клетке электрического поля высокой интенсивности, что позволяет проникнуть в клетку экзогенным генам или лекарственным препаратам [33]. А высокая интенсивность электрического поля может уменьшить осложнения, связанные с таргетингом и иммуногенностью [34]. Кроме того, электропорация обладает идеальным свойством трансфекции неделящихся клеток, таких как нервы, хрящи или кости. Это дает исключительные преимущества в области восстановления тканевой инженерии [35-37]. Несмотря на многочисленные преимущества, электропорация все же имеет некоторые ограничения. Клетки часто погибают или имеют повышенную токсичность из-за высокого напряжения, а снижение жизнеспособности клеток является одним из основных недостатков электропорации [38]. Если проводится трансфекционная терапия in vivo, требуются различные устройства-передатчики с высокой стоимостью и различной степенью повреждения тканей в результате инвазивных операций [39]. Tröder et al. использовали модифицированный метод электропорации для воздействия на оплодотворенные яйцеклетки мышей C57BL/6 с целью получения CRISPR/cas9-опосредованных специфических мутантных мышей [40]. Специфическая мутация не только была успешно введена без нарушение эмбрионального развития, но и при этом значительно повысилась частота рождения живых эмбрионов. Miao et al.. целенаправленно воздействовали на специфический для половых клеток ген nanos2, предварительно собрав РНК sgRNA и Cas9 и электрофоретировав оплодотворенные яйцеклетки мышей, крупного рогатого скота и свиней, это позволило стабильно получать мутантных потомков [41]. Xu et al. сообщили о технике трубчатой электропорации, а экспериментальные результаты показали, что новая техника может обеспечить эффективное редактирование генома в клетках млекопитающих, особенно в стволовых клетках человека, которые трудно трансфицировать. Это может стать новой стратегией доставки CRISPR/Cas9 [42] (рис. 4A).



Fig. 4. A) Gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. (i) Devices for tube electroporation. (ii) Transfection of human iPSC with Cas9/gRNA RNP-targeted APP gene, without ssODN template. (iii) Different types of cells were transfected with pCMV-GFP plasmid, and transfection efficiency was detected by fluorescence microscopy and flow cytometry after 48 h. From left to right are the cell bright field plots, fluorescence plots and flow cytometry dot plots, where red is the transfected cells and black is the mock-transfected control cells, respectively. Reproduced with permission [42]. Copyright 2018, The Authors. B) Magnetic induction is the process of delivering nucleic acids under the influence of a magnetic field acting on a nucleic acid carrier associated with a magnetic nanoparticle. (i) Schematic diagram of the magnetically guided nanoparticles targeting method. (ii) Applied magnetic field in mice experiments. (iii) Magnetic regimes of magnetite and maghemite as a function of their size. Reproduced with permission [43]. Copyright 2015, The Authors. C) Microfluidic transfection device. (i) Plasmids encoding sgRNA and Cas9 proteins are mixed with cells and flow through the chip. (ii) Flow chart of delivery mechanism. (iii) Scanning electron microscope (SEM) images of the device structure. (iv) Diagrammatic representation of cellular stress gradient formation across the cell membrane. D) Characterization of microfluidic chip. i) Delivery of FITC-labeled ssDNA to HEK293T cells via two different chips. ii) Delivery efficiency. iii) Cell viability. iv) Western blotting for PC-3 cells after 48 h of delivery with three different siRNA oligonucleotides targeting Akt1.l v) Cell Counting. vi) Transfer efficiency of different cell lines. Reproduced with permission [49]. Copyright 2015, The Authors.

Технология магнитофекции использует поверхностную активность магнитных наночастиц, таких как оксид железа, для соединения с целевыми генами с образованием нагруженных генами магнитных микросфер [43] (рис. 4B). Хотя метод магнитофекции не повышает напрямую эффективность трансфекции, мощная способность магнитного притяжения позволяет увеличить количество и скорость проникновения молекул нуклеиновых кислот в клетку, максимально используя нуклеиновые кислоты [44]. В отличие от электропорации, метод магнитоинфекции не требует нарушения клеточной мембраны и использует механизм эндоцитоза для завершения поглощения, что позволяет эффективно избегать состояния низкой активности клеток после трансфекции [45]. Mykhaylyk et al. успешно сконструировали магниточувствительные комплексы siRNA, которые осуществляли внутриклеточную транслокацию и эффективно подавляли целевой ген [46]. Hryhorowicz et al. использовали покрытые полиэтиленимином магнитные наночастицы оксида железа для создания магнитных комплексов плазмидной ДНК (PEI-Mag2) для облегчения трансфекции плазмиды CRISPR/Cas9 в эмбриональных фибробластах свиньи (PFFs). Эффективность трансфекции может быть повышена при использовании PEI-Mag2, что может быть связано с его магнитными свойствами, которые ускоряют осаждение нуклеиновых кислот на поверхности клеток [47].

Метод микрофлюидической деформации мембраны использует способность клеточной мембраны к деформации, которая быстро деформируется под механическим воздействием для создания временных пор, через которые молекулы нуклеиновой кислоты или белка попадают в цитоплазму [48]. Интегрированное свойство микрофлюидики позволяет проводить селективный скрининг нетрансфицированных клеток или повторную трансфекцию с помощью микрочипов для повышения активности редактирования генов. Han et al. впервые применили микрофлюидическую деформацию мембраны для доставки CRISPR/Cas9 и успешно осуществили РНК-направленное редактирование генов [49] (рис. 4C и D). Эта быстрая и высокопроизводительная платформа может обеспечить перспективную стратегию для CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генов и анализа генов. Деформация микрофлюидной мембраны не зависит от экзогенного материала, эндоцитоза или химической модификации целевой молекулы. Трансфекция может быть воспроизводимо выполнена только с помощью микрофлюидных чипов [50]. Из-за ограничений микрофлюидного чипа его невозможно доставить in vivo, что ограничивает потенциал его клинического применения.

Липидные бислои способны непосредственно преобразовывать акустическую энергию в механическое напряжение и деформацию на субклеточном и клеточном уровнях [51]. Высокоэнергетический ультразвук создает локальный сдвиг во внеклеточной жидкости, вызывая образование пор в клеточной мембране и увеличивая проницаемость для ДНК или РНК [52]. Ультразвуковые методы могут быть безопасно использованы in vivo благодаря своей неинвазивной природе и в настоящее время применяются в клинических случаях [53]. Однако низкий контроль приводит к низкой эффективности трансфекции, низкому проценту успеха и высоким требованиям к оборудованию [54]. Ryu et al. создали микропузырьковые нано-липосомы в качестве носителей нуклеопротеинового комплекса Cas9/sgRNA и успешно перенесли белковый комплекс в клетки дермальных сосочков волосяных фолликулов у лысых животных мужского пола при ультразвуковой активации. Исследование подтвердило ингибирующий эффект CRISPR/Cas9 на SRD5A2 in vivo и in vitro, что окончательно восстановило рост волос [55]. Для доставки плазмид CRISPR Dong et al. разработали двойную микрокаплю, реагирующую на ультразвук и магнит, которая может эффективно доставлять плазмиды в раковые клетки, что может стать потенциальной стратегией для клинического применения ультразвуковых методов для лечения рака [56].

Микроинъекция - это простой и прямой метод невирусной трансфекции, который позволяет вводить ДНК или РНК в цитозоль, используя только пипетки микронного размера. Его эффективность трансфекции, как правило, высока, поскольку объем и место инъекции можно точно контролировать [57]. Однако из-за того, что она требует огромного количества оптических приборов, а результаты зависят от квалификации специалиста, микроинъекция используется только в специфических условиях [58]. Ai et al. успешно завершили нокаут генов хлопкового червя с помощью системы CRISPR/Cas9 методом микроинъекции, что повысило эффективность редактирования генов [59]. Li et al. исследовали влияние времени микроинъекции на способность системы CRISPR/Cas9 к эмбриональному развитию и показали, что время микроинъекции в разной степени влияет на эмбриональное развитие и скорость редактирования генов у оплодотворенных in vitro эмбрионов свиньи. Правильная оптимизация концентрации sgRNA или Cas9 и точное определение времени инъекции помогут лучше выполнить редактирование генов [60] (рис. 5A-C).



Fig. 5. A) Schematic of the embryo injection strategy to determine the optimal timing of CRISPR/Cas9 microinjection. In vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT)-derived embryos were microinjected with sgRNA and Cas9 mRNA. B) The priming RNA was designed to target exon 5 of the interleukin 2 receptor gamma (IL2RG) locus in the porcine genome (Sscrofa11.1). Nucleotides in blue text indicate designed gRNAs, and letters in red text indicate PAM sequences (NGG). C) The expression of Cas9 protein was assessed by immunofluorescence staining 6 h after microinjection. Reproduced with permission [60]. Copyright 2021, The Authors. D) Different approaches to in vivo and in vitro gene therapy. E) Current frequency of use of different viral vectors. F) Third generation lentiviral vector constructed from four plasmids. G) Schematic diagram of the wild-type adenovirus type 5 (Ad5) genome and genetic modifications of common Ad5-based vectors. Reproduced with permission [69]. Copyright 2021, The Authors.

Вирусные векторы - это векторы выбора для редактирования генов и генотерапии. Они широко используются не только in vitro, но и в клинических условиях. Однако безопасность векторов часто вызывает беспокойство из-за специфичности вирусов. Чтобы избежать рекомбинации лентивирусных векторов in vivo, их геном сначала расщепляется на множество различных структур. Во-вторых, удаляются промоторные или энхансерные последовательности в их терминальных повторах, чтобы избежать активации родственных генов. В качестве альтернативы гликопротеин оборачивается вокруг поверхности вирусного вектора и модифицируется, чтобы ограничить круг хозяев [61]. Все эти меры безопасности позволяют генерировать инактивированные векторы для безопасной передачи.

Лентивирусные векторы - это ретровирусные векторы на основе ВИЧ-1 [62]. Проникновение лентивирусных векторов в клетки-мишени опосредовано взаимодействием между гликопротеинами, иммобилизованными на внешней мембране, и рецепторами на поверхности клеток-мишеней. Лентивирусные векторы обладают большой емкостью в 9 кб, что достаточно для упаковки различных компонентов CRISPR [63]. Как интегративный вектор, лентивирусные векторы также могут переносить несколько геномных фракций, что может быть ключевым элементом в лечении некоторых заболеваний. Кроме того, лентивирусные векторы могут трансфицировать клетки в стационарной фазе, тогда как обычные ретровирусные векторы могут трансфицировать только клетки в стадии деления. Это расширяет сферу применения и косвенно усиливает эффект генотерапии [64]. Лентивирусы, как носители CRISPR/Cas9, не только обладают способностью к генному редактированию, но и в полной мере используют преимущества, которыми обладают сами лентивирусные векторы [65]. Лентивирусные векторы могут эффективно интегрировать экзогенные гены в хромосомы клеток-мишеней, тем самым обеспечивая устойчивую экспрессию целевых генов. Лентивирусные векторы предпочтительны для клеток, которые труднее трансфицировать, таких как первичные клетки или стволовые клетки. Он может значительно повысить эффективность трансдукции целевых генов и добиться длительной и стабильной экспрессии целевых генов удобно и быстро. Joung et al. выбрали лентивирус в качестве вектора для CRISPR/Cas9, учитывая способность к вставке и тип клеток. И редактирование генов было успешно завершено, доказав, что лентивирусные векторы являются мощным инструментом для трансдукции генов [66].

Аденовирусные векторы - это двухцепочечные ДНК-вирусы, которые проникают в клетки-мишени через рецептор-опосредованный эндоцитоз и могут трансдуцировать различные типы клеток без ограничений по фазе деления. Кроме того, аденовирусные векторы не интегрируются в геном клетки-хозяина, оставаясь вне хромосомы и вызывая только мгновенную экспрессию с высоким профилем безопасности [67]. Аденовирусные векторы имеют много уникальных преимуществ перед другими вирусными векторами. Во-первых, большинство клеток человека могут экспрессировать аденовирусные рецепторы, что делает аденовирусные векторы обладающими широким спектром применения и высокой эффективностью трансдукции. Во-вторых, модифицированные аденовирусные векторы могут легко избегать внутренней защиты иммунной системы организма. Аденовирусные векторы также становятся наиболее часто используемыми векторами в клинических испытаниях во всем мире [68]. Аденовирусные векторы не только используются для разработки вакцин и лечения опухолей, но и обладают потенциалом для редактирования генов [69] (рис. 5D-G). Tsukamoto et al. применили аденовирусный вектор, нагруженный геном AsCpf1, к первичной культуре гуманизированных мышиных гепатоцитов и показали, что система CRISPR/AsCpf1, опосредованная аденовирусным вектором, является полезным инструментом для редактирования генома гепатоцитов человека [70].

Развитие наноносителей как альтернативы традиционным методам физической трансфекции и вирусным методам доставки происходит очень быстро. Невирусные векторы более безопасны и легче поддаются массовому производству, чем вирусные векторы. Как дендримеры, так и липосомы обладают исключительными преимуществами в плане таргетинга, высокой инкапсуляции и низкой иммуногенности. Все больше и больше наноносителей выходят на сцену для генотерапии костей или хрящей.

Дендримеры - это макромолекулы с дендритной структурой, состоящие из олигомеров, многократно и линейно связанных дендритными единицами. Благодаря контролируемости мономера, физико-химические свойства дендримеров могут быть точно контролируемы, а также может быть осуществлено персонализированное приготовление. Между тем, дендримеры содержат внутри полости, образуя плотную трехмерную структуру сферы, которая может быть идеально использована для инкапсуляции генов. Кроме того, на его поверхности открыто множество функциональных групп, которые могут быть модифицированы для достижения лучшей оптимизации производительности благодаря сферической структуре [71] (рис. 6A и B). Farbiak et al. разработали липидную наночастицу на основе дендримеров для осуществления CRISPR/Cas9-опосредованного HDR, избегая при этом механизма NHEJ, склонного к ошибкам. Команда инкапсулировала Cas9 мРНК, sgРНК и донорскую ssDNA (одноцепочечную ДНК) в наночастицы с низкой цитотоксичностью и отсутствием заряда при нейтральном pH. При соответствующем соотношении наночастицы способны завершить HDR. Это может быть связано с одновременной доставкой трех нуклеиновых кислот [72]. Liu et al. сообщили о дендримере, содержащем борную кислоту, который может доставлять белок Cas9 с высокой эффективностью. Кроме того, он может быть использован для доставки белков с различными изоэлектрическими точками или размерами без химической модификации, преодолевая проблему сложности формирования стабильных комплексов с белками [73].



Fig. 6. A) Schematic diagram of HDR gene editing mediated by dendrimers lipid nanoparticles. B) Nanoparticles successfully complete HDR in HEK293 cells containing Y66H mutant GFP. (i) Fluorescence disappears when NHEJ is performed and can return to normal levels when HDR is performed. (ii) Trends in HDR, NHEJ, total efficiency and unedited cell groups were observed in three different ratios of Cas9 mRNA: sgRNA. Reproduced with permission [71]. Copyright 2021, Wiley. C) Schematic diagram of liposome synthesis using microfluidic system. Reproduced with permission [76]. Copyright 2022, The Authors. D) Characterization of liposome-CRISPR complexes. (i) Composition of complexes. (ii) Chemical formula of liposome. (iii) In vivo imaging of mice after intramuscular injection. (iv-v) Fluorescence signal analysis of different nanoparticles after injection. (vi) Gene therapy for duchenne muscular dystrophy (DMD). Reproduced with permission [77]. Copyright 2021, The Authors.

Липосомы - это бислойные везикулы, которые имитируют клеточные мембраны и подают надежды в области доставки благодаря своей эффективной способности доставки и хорошей биосовместимости [74]. Катионные липиды являются ключевым компонентом липосом и играют важную роль в инкапсуляции нуклеиновых кислот и клеточной доставке. Пре-липосомы в качестве векторов доставки siRNA с трудом инкапсулируют большие молекулы белка Cas9 и sgRNA. Чтобы преодолеть это препятствие, Rosenblum et al. разработали липосомную систему для редактирования генов CRISPR/Cas9 [75]. Результаты показали, что система успешно доставляет мРНК Cas9 и sgRNA в опухолевые клетки и приводит к апоптозу опухолевых клеток и улучшению выживаемости. Han et al. приготовили серию липосом, содержащих мРНК Cas9 и модифицированную sgRNA, используя микрофлюидическую технологию. Окончательно модифицированная sgRNA достигла 85% степени инкапсуляции, и это липосомное редактирование генов стало новым безопасным терапевтическим методом [76] (рис. 6C). В отличие от вирусных векторов для доставки in vivo, Kenjo et al. сообщили о липосоме, которую можно многократно вводить в ткань скелетных мышц [77] (рис. 6D). Она была введена в гастрокнемиальную мышцу мышей и поддерживала стабильные уровни in vivo в течение почти 100 дней. Его низкая иммуногенность и повторяемость введения являются важными характеристиками для будущего использования липосомальных носителей для восстановления костей или хрящей.

Мицеллы - это упорядоченные агрегаты молекул, которые начинают формироваться в большом количестве после того, как концентрация surfactant достигает определенного значения в водном растворе [78]. Для загрузки нуклеиновых кислот мицеллы полагаются в основном на гидрофобные и электростатические взаимодействия [79]. Abbasi et al. исследовали полиморфные мицеллы (PMs), приготовленные из полиэтиленгликоля (PEG)-поли(катионные блок-кополимеры) для доставки компонентов CRISPR/Cas9. Было обнаружено, что совместная загрузка мРНК Cas9 и sgRNA в 1 п.м. значительно повышает стабильность sgRNA по сравнению с загрузкой только sgRNA. Команда сообщила об успешной совместной инкапсуляции Cas9 мРНК и sgRNA в PM и успешном завершении редактирования генов [80]. Были разработаны само-собирающиеся мицеллы, состоящие из четвертичного аммониевого поли(пропиленоксида) (PPO-NMe3) и амфифильного Pluronic F127. Lao et al. оптимизировали характеристики мицеллы для воздействия на онкоген HPV18-E7. При оценке способности к подавлению генов мицеллы продемонстрировали сильные защиту и способность к доставке [[81], [81]a)].

На сегодняшний день, хотя существует множество методов доставки генов, ни один из них не является совершенным. Мы должны рассмотреть сферу применимости, преимущества и недостатки различных векторов или методов доставки и разумно оценить их потенциал для внедрения в клиническое применение. Некоторые элементы, которые могут определить эффективность или биобезопасность переноса генов, такие как несущая способность [81b], иммуногенность [81c] и экономическая стоимость [81c], являются ключевыми условиями, которые мы должны всесторонне изучить.

Основой восстановления костной ткани является образование костного струпа остеобластами и остеокластами в ответ на различные цитокины. Метод редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 демонстрирует большой потенциал для применения в клинической практике для восстановления костей [82]. В настоящее время переломы длинных костей самовосстанавливаются при сильной внутренней фиксации, но заживление часто не столь оптимистично из-за многих факторов, таких как остеопороз или пожилой возраст. При сегментарных дефектах с длиной дефекта более чем в два раза превышающей диаметр диафиза, часто не происходит заживление сломанного конца [83]. Традиционные аутологичные костные трансплантаты, аллогенные костные трансплантаты и материальные имплантаты в большей или меньшей степени подвержены побочным реакциям, таким как боль, инфекция или иммунное отторжение. В настоящее время очень привлекательной стала концепция введения одного или нескольких остеогенных генов с незаживающей раной пациенту с расчетом на изменение модели заживления организма путем редактирования генов (табл. 3). Существуют две основные стратегии редактирования генов для лечения костных дефектов. Во-первых, вектор с генами наносится непосредственно на место дефекта, или он может быть объединен с каркасом перед имплантацией. Во-вторых, подходящие ткани, такие как костная или мышечная ткань, собираются in vivo, редактируются и модифицируются in vitro, а затем пересаживаются in vivo [84]. В любой из этих стратегий конечной целью является стимулирование остеогенеза и заживления с использованием редактирования генов для завершения лечения заболеваний, связанных с дефектами костей.

Table 3. CRISPR/Cas9 for bone repair.

Восстановление и реконструкция кости состоит из резорбции старой кости остеокластами и образования новой кости остеобластами [85]. При недостатке остеокластов концы перелома атрофируются с обеих сторон, костномозговая полость закрывается или происходит склероз концов кости, что часто приводит к незаживающим последствиям. ELMO1 способствует усилению активности остеокластов и повышает активность резорбции кости. Arandjelovic et al. удалили ген ELMO1 в макрофагах Hoxb8 с помощью CRISPR/Cas9 и sgRNA. После этого у трансфецированных макрофагов развились функциональные дефекты [86] (рис. 7A и B). Для дальнейшего изучения того, может ли ELMO1 контролировать другие сигнальные маркеры в остеобластах, группа продолжила целенаправленно воздействовать на белки, которые могут играть определенную роль, такие как athepsin G (Ctsg) и миелопероксидаза (Mpo). Результаты показали, что после нокаута мРНК этого белка с помощью CRISPR/Cas9 макрофаги снизили функцию деградации, это указывает на то, что ELMO1 является ключевой частью функциональной сети, регулирующей деградацию кости в остеокластах. Однако целенаправленное воздействие на резорбтивную активность остеокластов часто приносит больше пользы, чем их количество. Рациональный выбор целевых генов мишеней может помочь найти новые прорывы в восстановлении костной ткани.



Fig. 7. A) Elmo1-deficient mice exhibit reduced bone erosion in two models of arthritis. (i) Schematic diagram of collagen-induced arthritis (CIA) induction in Elmo-/- DBA/1J mice. (ii) RT-PCR analysis of the expression of the indicated genes. (iii) MicroCT images of the ankle joint in mice. (iv) Quantification of bone erosion in the heel bone region of mice. (v) Schematic representation of K/BxN serum transfer-mediated induction of arthritis in Elmo?/? C57BL/6 mice. (vi) On day 10 after K/BxN serum injection, the expression of the indicated genes. (vii) On day 10 after K/BxN serum injection, H & E staining of histological sections of mouse ankle. B) ELMO1 is a signaling hub that regulates osteoclast function. (i) Genes are sorted from left to right according to the magnitude of change. (ii) TRAP staining was performed 7 days after differentiation of different Hoxb8 cells into osteoblasts. Hoxb8 osteoblasts tested for resorptive function on OsteoAssay plates. (iii) (iv) Osteoclast surface and total ELMO1 protein interaction group. Reproduced with permission [86]. Copyright 2021, The Authors. C) BMP2 binds to surface receptors, activates downstream signaling and promotes osteogenesis, leading to upregulation of Nog, antagonism of BMP2 and inhibition of osteogenesis (left). Baculovirus (BV) provides CRISPRi to inhibit Nog and reduce the antagonistic effect of Nog on BMP2, thereby promoting osteogenesis (right). D) Concepts of BV design. E) Alizarin red staining after CRISPRi-mediated Nog inhibition. F) qRT-PCR analysis of OSX and OCN. Reproduced with permission [89]. Copyright 2021, Elsevier.

BMP2 известен как регулятор формирования костной и хрящевой ткани и является мощным остеоиндуктивным фактором роста, однако его клиническое применение ограничено из-за его высокой стоимости вследствие высокой дозы, необходимой для его эффективности [87]. Высокая экспрессия BMP2 повышает экспрессию остеогенных генов и индуцирует дифференцировку стволовых клеток в остеобласты. Однако в ответ на стимуляцию BMP2 клетки-предшественники костной ткани экспрессируют белок Noggin, который противодействует биологической активности BMP2 [88]. Noggin может связывать BMP2 и препятствовать его стыковке с поверхностными рецепторами стволовых клеток, тем самым подавляя остеогенную дифференцировку стволовых клеток. Поэтому ингибирование экспрессии Noggin может уменьшить антагонистический эффект Noggin на BMP2 и косвенно способствовать остеогенезу. Hsu et al. соединили Cas9 с транскрипционными репрессорами, такими как VPR, чтобы создать dCas9-VPR, который связывается со специфическими sgRNA, и провели редактирование генов in vitro, используя бакуловирус в качестве вектора, нацеленного на Noggin. Результаты показали, что ген Noggin был нокаутирован, а BMP2 избыточно экспрессирован, что могло эффективно способствовать остеогенной дифференцировке жировых стволовых клеток и заживлению костей [89] (рис. 7C-F).

BMP9 индуцирует дифференцировку стволовых клеток в остеобласты путем активации Smad-зависимых сигнальных путей и имеет более высокий остеогенный потенциал по сравнению с BMP2 [90,91]. Чтобы оценить роль BMP9 в содействии восстановлению костных дефектов in vitro и in vivo, MSCs были генетически отредактированы для избыточной экспрессии BMP9 с помощью системы CRISPR/Cas9 [92]. Остеогенные маркеры, такие как Runx2, Sp7, ALP и Oc, были увеличены в разной степени. Эксперименты in vivo показали ускоренное образование новой кости и увеличение плотности костной ткани у крыс, которым вводили отредактированные генами стволовые клетки. Это первая демонстрация того, что CRISPR-отредактированные MSCs, избыточно экспрессирующие BMP9, могут успешно способствовать формированию кости, предоставляя новый вариант применения генотерапии в области костных дефектов.

До сих пор заживление больших сегментарных костных дефектов остается сложной задачей. Truong et al. попытались улучшить ситуацию, стимулируя образование хряща путем имплантации стволовых клеток [93]. Группа создала систему активации/репрессии CRISPR на основе Cas9, sgRNA (CRISPRai) и проверила, что Cas9 синергично действует с sgRNAa (активатор) для индукции активатора mCherry и с sgRNAi (ингибитор) для активации репрессора d2EGFP. Мезенхимальные стволовые клетки крыс, введенные с помощью бакуловируса, одновременно анализировались на блокирующий эффект Sox9 и PPAR-γ. Sox9 и PPAR-γ действуют как основные транскрипционные факторы для формирования хряща и жировой ткани соответственно, а PPAR-γ ингибирует действие Sox9 [94]. Поэтому активация Sox9 при ингибировании PPAR-γ способствует заживлению костей. Система CRISPRai была сконструирована с использованием большого потенциала бакуловирусного вектора. Впервые было продемонстрировано, что система CRISPRai может быть объединена для стимуляции регенерации тканей для двунаправленного регулирования и обеспечивает более гибкий подход.

Способность BMSCs к остеогенной дифференцировке необходимо жестко регулировать. Слишком малое образование кости может не завершить восстановление, но слишком большое образование кости может привести к эктопической оссификации или остеосклерозу. MSX1 балансирует уровень деградации белков во время нормального остеогенеза. В данном исследовании Kaushal et al. использовали систему CRISPR/Cas9 для поиска деубиквитинирующих ферментов (DUBs), регулирующих белок MSX1, и выявили карбоксил-терминальную гидролазу убиквитина 11 (USP11) в качестве регулятора MSX1 [95]. Избыточная экспрессия USP11 усиливает экспрессию остеогенных факторов в BMSCs. Кроме того, она влияет на кальцификацию и активность ALP, если USP11 отсутствует. Группа отобрала 50 sgRNAs генов семейства USP и проверила выбранный USP11. Нет функциональных отчетов о взаимодействии USP11 с MSX1 в BMSCs, а группа продемонстрировала новую роль USP11 в процессе остеогенной дифференциации.

Сигнальный путь Wnt является центральным регулятором развития и восстановления костной ткани. Путь Wnt является привлекательной терапевтической мишенью, играющей важную роль в остеогенной дифференцировке BMSCs [96]. Wnt16 - это лиганд, который влияет на пролиферацию, дифференцировку и миграцию стволовых клеток через путь Wnt [97]. McGowan et al. создали стабильные Wnt16-/- мутантные линии рыбок данио с помощью технологии CRISPR/Cas9 для изучения их влияния на костную ткань, используя минеральную плотность ткани (TMD) в качестве оценки [98] (рис. 8A). Впоследствии в хвостовом плавнике рыбок данио Wnt16-/- были индуцированы костные дефекты. По сравнению с рыбками данио дикого типа, мутанты Wnt16 демонстрируют задержку минерализации костной ткани во время восстановления кости. Набор остеобластов также значительно задерживался у мутантов Wnt16 после возникновения дефекта кости. Это исследование эффективно демонстрирует, что Wnt16 может регулировать активность Wnt через Runx2a для содействия дифференцировке остеобластов и отложению костного матрикса. Соответствующее лечение, направленное на Wnt16, может предотвратить переломы и способствовать восстановлению кости.



Fig. 8. A) Delayed osteoblast recruitment and bone mineralization. (i) Marking of old and new bone. (ii) Reduced callus formation in the Wnt mutant group 2-7 days after injury. (iii) Alizarin red (gray) labeling of old bone and callus labeled by calcein. White asterisks are fracture centers. (iv) Calcified bone (alizarin red) and osteoblasts (osx:GFP). Reproduced with permission [98]. Copyright 2021, The Authors. B) Location map of Satb2 protein and Cas9 cleavage site. C) Satb2 gene mutation reduces osteoblast proliferation rate. D) Satb2-mediated models of molecular and cellular outcome variation. Reproduced with permission [100]. Copyright 2019, Elsevier.

Функция некоторых остеогенных транскрипционных факторов может быть усилена specific AT-rich sequence binding protein 2 (Satb2), связывающим АТ-богатые последовательности. Удаление Satb2 может привести к неполной экспрессии остеогенных генов или плохому развитию скелета [99]. Для дальнейшего изучения молекулярного механизма остеогенной функции, опосредованной Satb2, Dowrey et al. использовали систему CRISPR/Cas9, чтобы вызвать мутации в гене Satb2 в клетках MC3T3-E1 [100] (рис. 8B-D). Когда экспрессия Satb2 снижается, скорость роста остеобластов замедляется. Кроме того, мутации Satb2 приводят к ядерным аномалиям. А процесс роста остеобластов, в котором участвует Satb2, может помочь продемонстрировать генетические предпосылки для восстановления костных дефектов.

Хрящ не имеет нервов и кровеносных сосудов и поэтому не обладает способностью к самовосстановлению. В настоящее время восстановление дефектов хряща остается сложной задачей. Традиционные методы включают микропереломы, хрящевые трансплантаты или имплантаты, но эти методы не полностью восстанавливают естественную хрящевую ткань. Современные исследования изучают потенциал MSCs в восстановлении хряща, и CRISPR/Cas9 является отличным инструментом для этой цели. Как предпочтительный инструмент для редактирования генов, способы содействия регенерации хряща являются важным направлением его развития (табл. 4).

Table 4. CRISPR/Cas9 for cartilage repair.

Сообщалось, что LncRNA DANCR индуцирует дифференцировку синовиальных стволовых клеток человека и синовиальных МСК в хрящ [101]. Nguyen et al. упаковали dCas9-VPR и соответствующую gRNA в бакуловирус для трансфекции генов и сравнили четыре dCas9-VPR, полученные из различных бактерий, показав, что SadCas9-VPR, полученный из Staphylococcus aureus, успешно индуцирует активацию DANCR в стволовых клетках жировой ткани крысы [ 2] (рис. 9A-C). Активация DANCR значительно способствует дифференцировке жировых стволовых клеток в хондроциты и усиливает формирование хряща in vitro. Активация DANCR с помощью CRISPR/Cas9 может значительно повысить экспрессию Smad3 и улучшить устранение костных дефектов, что, как ожидается, станет новой терапевтической мишенью для восстановления хряща в будущем.



Fig. 9. A) CRISPRa activates DANCR to promote skull formation. B) Evaluation of different dCas9-VPR direct homologs on DANCR activation. C) Stimulatory effect of DANCR activation on rASC cartilage formation. (i-iii) Expression of chondrogenic markers (Sox9, Col2a1, Acan) at 7 dpt measured by qRT-PCR. (iv) Effects of DANCR activation at 1 and 14 dpt on cell morphology during differentiation of chondrogenic cells. (v) Alcian blue staining at 14 dpt. Reproduced with permission [102]. Copyright 2021, Elsevier. D) Cas9 editing strategy for human chondrocytes. E) Immunofluorescence of COL2A1, comparing unedited and edited spheres. Scale bars = 100 µm. N, unedited; E, MMP13 edited. F) Western blotting for COL2A1. Reproduced with permission [103]. Copyright 2021, Elsevier.

Seidl et al. восстановили популяцию суставных хондроцитов человека с помощью стратегии редактирования генов, опосредованной CRISPR/Cas9, которая стабильно снижала экспрессию MMP13 в хряще [103] (рис. 9D-F). Снижение общей секреции MMP13 с помощью CRISPR/Cas9 косвенно уменьшает деградацию внеклеточного матрикса. Сначала была создана 3D модель ткани для имитации естественной среды клеток и тканей. Затем был определен уровень коллагена типа 2 (Col2), чтобы определить, успешно ли подавлена секреция и активность MMP13. Такие ткани, как хрящ, лишенные васкуляризации и обладающие низкой само-пролиферативной активностью, являются хорошими кандидатами для редактирования генов и хорошо защищены от миграции других случайных изменений в хрящевую ткань. Этот подход значительно повысит эффективность текущего восстановления хряща с помощью клеток. Как и предыдущие подходы, терапия стволовыми клетками играет центральную роль в клинической регенеративной терапии. Будь то экзогенная имплантация стволовых клеток или повторная индукция дифференцировки с помощью факторов роста и т.д., целью является точный контроль экспрессии белка и усиление активности клеток-мишеней. Чтобы решить проблему неконтролируемой среды in vivo, Farhang et al. использовали систему активации генов dCas-VPR CRISPR для активации aggrecan (ACAN) и Col2 [104]. С помощью анализа RNA-seq было установлено, что регуляция Col опосредует более широкую экспрессию генов хряща. Кроме того, двойная избыточная экспрессия ACAN и Col2 приводила к отложению sGAG и Col2. Как основной компонент ECM, коллаген не только обеспечивает механическую поддержку, но и контролирует рост и дифференцировку клеток [105]. В заключение следует отметить, что система dCas-VPR CRISPR служит методом повышения регуляции эндогенных белков ECM, которые могут хорошо регулировать и фенотип клеток.

Метатропная дисплазия, вызванная мутациями в гене TRPV4 (transient receptor potential vanilloid 4), является одной из форм врожденной дисплазии скелета. Nonaka et al. восстановили мутации в одно основание в TRPV4 с помощью CRSIPR/Cas9. Результаты показали, что в присутствии агонистов, специфичных для TRPV4, мутантная группа демонстрировала довольно ускоренную дифференцировку хряща на ранних стадиях и повышенную экспрессию мРНК Sox9 [106]. Вкратце, мутация в TRPV4 - это функциональная мутация, которая может привести к повышению уровня внутриклеточных ионов кальция. В настоящее время большинство клинических операций по восстановлению хрящевой ткани включает в себя регуляцию гена или коррекцию мутации. Данное исследование предлагает новое направление воздействия на мутации в гене для лечения повреждений хряща.

Остеоартрит - это дегенеративное заболевание хряща, часто возникающее в результате нарушения целостности хряща или поражения субхондральной костной пластинки [107]. Предыдущие исследования выявили высокий уровень экспрессии трансмембранного белка коннексина43 (Cx43) в остеоартрозном хряще [108]. Varela-Eirrn et al. обнаружили, что Cx43 поддерживает присутствие различных незрелых клеток в хряще путем увеличения экспрессии Twist-1 и MMPs [109] (рис. 10A). Кроме того, Cx43 также повышает уровень p16INK4a и NF-κB, вызывая старение и апоптоз в таких клетках, как хондроциты. В данном исследовании исследователи использовали CRSIPR/Cas9 для снижения экспрессии Cx43 и успешно замедлили дегенерацию хряща. Cx43 является специфическим механизмом для хондроцитов в направлении старения. Контроль пластичности и апоптоза хондроцитов посредством направленного воздействия на Cx43 является новым подходом к лечению заболеваний хряща. Это также может быть потенциальным кандидатом для содействия восстановлению хряща в регенеративной медицине.



Fig. 10. A) Down-regulation of Cx43 in osteoarthritis promotes cartilage repair. Reproduced with permission [109]. Copyright 2018, The Authors. B) Differentiation of RVR cell lines carrying the COL2A1-GFP reporter gene into chondroprogenitor cells. C) Higher population of triple positive cells. D) Chondrogenic progenitor cells were identified by RNA sequencing to contain at least 9 populations. There are 3 major groups: neurogenic cells (blue dashed circles), chondrogenic cells (green dashed circles) and mesenchymal (brown dashed circles). E) Characteristic genes of chondrogenic cells. F) Cells expressing these desired markers were sorted from wild-type chondroprogenitor cells. Reproduced with permission [117]. Copyright 2020, The Authors.

Liu et al. разработали терапевтический протокол с использованием модифицированных мезенхимных стволовых клеток (MSCs) в качестве имплантатов для восстановления хряща [110]. MSCs не только структурно способствуют восстановлению хряща, но и обладают мощной иммуномодулирующей активностью. Они могут взаимодействовать с макрофагами для координации восстановления тканей при ревматоидном артрите [111]. Исследовательская группа выбрала MSCs, полученные из синовиальной оболочки человека, для дальнейшего улучшения хондрогенной способности MSCs путем модификации целевого гена с помощью CRISPR/Cas9. MSCs, модифицированные целевым геном, станут новым терапевтическим средством для лечения хронических заболеваний, связанных с повреждением хряща, таких как ревматоидный артрит.

Хотя плюрипотентные стволовые клетки в настоящее время имеют множество вариантов хондрогенной дифференцировки, неполная дифференцировка и клеточная гетерогенность остаются основными препятствиями для формирования хряща [112,113]. Сообщалось, что MSCs, экспрессирующие CD105, CD166 и CD146, обладают более высоким хондрогенным потенциалом [114-116]. Dicks et al. использовали CRISPR-Cas9-редактированные COL2A1-GFP нокаутированные плюрипотентные стволовые клетки человека [117] (рис. 10B-F). Целью было выявление маркеров клеточной поверхности истинных популяций предшественников хондрогенных клеток. Затем для анализа различных субпопуляций было использовано секвенирование РНК одноклеточных клеток. Результаты показали, что CD146+/CD166+/PDGFRβ+/CD45- субпопуляция клеток хондрогенных предшественников обладала более мощной хондрогенной способностью. А очистка путем идентификации поверхностных маркеров значительно улучшит хондрогенную эффективность.

Создание нескольких моделей костных заболеваний поможет в дальнейшем изучить новые модели роли CRISPR/Cas9 в восстановлении костей. Обычные механизмы восстановления костной ткани, такие как гомеостаз остеокластов и остеобластов, минерализация матрикса и пластичность рубца, представлены в распространенных моделях костных заболеваний. Osteogenesis imperfecta (OI) - это аутосомно-доминантное заболевание, которое часто вызывает хрупких косткей переломы и рецидивирующие переломы [118]. OI - редкое генетическое заболевание, и различные методы лечения не привели к удовлетворительным результатам [119]. С развитием стратегии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) методы редактирования генов постепенно применяются для изучения OI. CRISPR/Cas9 может корректировать гены пациента, исправлять генетические мутации и исправлять патофизиологические изменения комплексно во всех процессах.

Основным патогенным фактором OI является нарушение синтеза коллагена I типа. Мутации в COL1A1 и COL1A2 являются прямой причиной нарушения синтеза α-цепи коллагена I типа [120]. Являясь важным компонентом костного матрикса, коллаген вызывает нарушение минерализации костей и остеопороз. Jung et al. выделили iPSCs от пациентов с мутацией COL1A1, но индуцированная остеогенная дифференцировка привела к более низким, чем ожидалось, уровням коллагена I типа [121]. Наблюдалось повышение потенциала дифференцировки остеобластов и улучшение уровня коллагена после коррекции мутантного гена COL1A1 с помощью CRISPR/Cas9.

Раух и др. успешно создали модель мышиного OI V типа с использованием CRISPR/Cas9 [122]. OI типа V в основном вызывается мутацией MALEP-BRIL в хромосомном гене IFITM5. Результаты моделирования показали сниженную минерализацию черепа, искривленные и укороченные длинные кости и повышенную хрупкость ребер. Гистологические результаты также показали отсутствие формирования первичных центров окостенения и меньшее количество кортикальной кости. Экспрессия соответствующих остеогенных маркеров и ангиогенных факторов была снижена путем контроля генетического уровня модели. Низкий уровень экспрессии MALEP-BRIL может влиять на индуцированную дифференцировку остеобластов.