Все эукариотические клетки выделяют огромное количество внеклеточных везикул (EVs) - связанных с мембранами наночастиц, имеющих приблизительно сферическую форму и диаметр от 50 до 500 нм.¹ EVs разнообразны, они делятся не только по размеру, но и по клеткам происхождения, способу выделения, молекулярному составу и функциям. Классические подтипы EV, такие как "эктосомы" (происхождение из плазматической мембраны) и "экзосомы" (эндосомальное происхождение), могут быть важны на уровне клеточной биологии, однако они отличаются невероятным разнообразием и трудно различимы после выхода из клетки.² Считается, что EVs участвуют в межклеточной коммуникации, доставляя нуклеиновые кислоты, белки, малые молекулы и липиды между клетками,³ но можно предположить и другие способы взаимодействия.

Примечательно, что после переноса в EVs эти молекулы сохраняют свою функцию в клетках-реципиентах, что позволяет предположить, что EVs, содержащие активные белки, РНК, протеины или ДНК, могут изменять биологию клеток, удаленных от клеток-производителей EVs. Эти характеристики наделяют EVs беспрецедентным потенциалом с точки зрения безопасности и биосовместимости, поэтому они стали предметом обширных экспериментов и привлекли интерес как государственного, так и частного секторов.⁴ На сегодняшний день несколько терапевтических биомолекул были неоднократно загружены в EVs и доставлены в клетки-мишени и экспериментально подтверждено на моделях in vitro, так и in vivo.

РНК-терапевтические препараты имеют явные преимущества перед цинковыми пальчиками или CRISPR-терапевтическими препаратами, поскольку РНК функционируют в эндогенных клеточных путях в переходном режиме, программируются и, следовательно, относительно легко создаются для лечения конкретных заболеваний, а также, как правило, не являются иммуногенными, как это, к сожалению, происходит со многими новыми технологиями рекомбинантных белков. Были открыты и исследованы различные биотипы РНК с биологическими функциями и терапевтическим потенциалом, такие как малые интерферирующие РНК (siRNAs), что привело к созданию новых классов терапевтических препаратов.⁵ РНК могут быть использованы для кратковременного преходящего и более длительного эпигенетического сайленсинга, который зависит от мишени, например, нацеливание на промоторы генов может вызывать остановку транскрипции генов.⁶ Примечательно, что вакцины на основе мРНК в настоящее время также эффективно используются для борьбы с пандемией COVID-19.⁷ Однако, хотя терапевтические РНК могут быть быстро изменены и произведены, они должны достичь своей цели, чтобы быть эффективными. Например, липидные наночастицы (ЛНП) используются в вакцине COVID-19 компании Pfizer-BioNTech и для лечения полинейропатии, направленной на печень, но эти методы могут быть цитотоксичными, нестабильными в циркуляции и непригодными для доставки в другие ткани⁸. Кроме того, клеточная и субклеточная доставка препаратов на основе РНК также представляет собой серьезную проблему: менее 1% полезной нагрузки достигает цитозоля клетки.⁹ Потенциально упаковка этих РНК в EVs, которые естественным образом переносят РНК, может стать более безопасным и физиологически направленным подходом. В связи с этим было предпринято несколько попыток интегрировать РНК в EVs и оптимизировать эффективность упаковки и высвобождения.

Несмотря на то, что EVs становятся перспективной системой доставки, эффективная загрузка терапевтического груза в EVs оказывается сложной задачей. Загрузка EVs может происходить естественным образом в процессе биогенеза или после выделения EVs с помощью физических или химических методов. Для загрузки нуклеиновых кислот в EVs использовалась электропорация, однако она ухудшает внутренние свойства мембраны EV и приводит к большим потерям EVs.¹⁰ Поэтому наиболее распространенным методом загрузки мРНК в EVs является трансфекция клеток-продуцентов EVs плазмидами, кодирующими терапевтическую мРНК. Возникающая при этом высокая концентрация цитоплазматической мРНК достаточна для упаковки мРНК в EVs, возможно, потому, что EV, как было установлено, функционально экспортируют клеточные компоненты, находящиеся в большом избытке.¹¹ Villamizar et al. трансфицировали мезенхимные стволовые клетки MSC) плазмидой, кодирующей транскрипционный фактор с цинковым пальцем, нацеленный на промотор гена CFTR для лечения муковисцидоза (так называемый CFZF). Высокая экспрессия CFZF, обусловленная CMV-промотором плазмиды, была достаточной для обнаружения мРНК и белка CFZF в выделенных EVs.¹² Для увеличения производительности загрузки РНК Kojima et al. загрузили мРНК каталазы в EVs с помощью системы загрузки EXOtic,¹³ состоящей из плазмидной конструкции, кодирующей CD63, общего трансмембранного белка, и архейного рибосомного белка L7Ae, который избирательно связывается с C/D box структурой РНК. Далее они ввели C/D-box в 3' UTR гена каталазы. При трансфекции клеток-продуцентов этими конструкциями мРНК каталазы эффективно упаковывалась в EVs и переносилась в клетку-мишень in vitro.¹³ Для увеличения высвобождения EVs в системе EXOtic также использовалась трицистронная плазмида, кодирующая три гена, участвующих в биогенезе экзосом (STEAP3, SDC4, L-аспартат-оксидазы). При введении в мышиные модели болезни Паркинсона эти EVs преодолевали гематоэнцефалический барьер и снижали уровень реактивных форм кислорода в клетках-мишенях мозга. Также был включен конститутивно активный мутант белка gap-перехода Connexin 43 (Cx43). Этот белок отвечает за формирование структур optktds[ соединений после слияния двух коннексонных полу-каналов, что позволяет осуществлять межклеточное взаимодействие и перенос материалов.¹⁴ Он также является наиболее экспрессируемым Cx-белком и естественным образом присутствует в EVs в виде гексамеров, организованных в полу-канальные структуры.^14,15 Этот белок был включен в конструкцию EV и, как выяснилось, увеличивает эффективность высвобождения EV-груза в клетки-реципиенты при контакте.^12,16 Действительно, для переноса мРНК nluc-C/D box в L7Ae, сконструированный на основе CD63, требуется совместная трансфекция трицистронной плазмиды-бустера, Cx43 и модуля нацеливания на мозг, сконструированного на основе LAMP2b.

Другой метод загрузки РНК в EVs заключается в создании частиц РНК, покрытых липидами, и их интеграции в очищенные EVs путем разделения, вызванного перемешиванием.^17,18 Как и ожидалось, этот процесс приводит к небольшому увеличению размера EVs и уменьшению их количества, но он эффективен и точен (более 90%).¹⁹ Однако очистка и необходимость предварительного покрытия РНК липидами влечет за собой затраты и временны'е ограничения. Поэтому, хотя этот процесс можно использовать в исследовательских целях, его масштабирование для клинического или коммерческого применения может оказаться затруднительным.

Известно, что микроРНК (миРНК) загружаются в EVs и функционально модулируют экспрессию генов в других типах клеток-реципиентов.²⁰ Это может происходить за счет прямого взаимодействия с Argonaut 2 (AGO2), который, как было установлено, упаковывается в EVs.²¹ В качестве альтернативы, определенные белки, такие как YBX1, были связаны с загрузкой определенных миРНК в EVs,²² в то время как другие исследователи предполагают, что может не существовать определенного мотива или пути, участвующего в наборе миРНК в EVs.²³ В то же время другие исследователи обнаружили, что, по-видимому, не существует специфической системы упаковки миРНК для загрузки их в EVs.²⁴ Благодаря относительно большому набору генов-мишеней, миРНК могут существенно изменять фенотип или экспрессию генов в клетке, а значит, могут быть ценным грузом, способствующим развитию, а также вызывать или лечить заболевания. Simeoli et al. одними из первых описали эндогенный путь EV-опосредованного переноса миРНК от нейронов к макрофагам в присутствии капсаицина.²⁰ Инкубация с капсаицином или травма нерва вызывает увеличение экспрессии миРНК-21 и белка MFG-E8, ответственного за поглощение макрофагами молочной жировой глобулы-EGF-фактора 8. Авторы показали, что EVs, полученные из нейронов, обработанных капсаицином, поглощались макрофагами быстрее, чем необработанные контрольные, и способствовали развитию воспалительных фенотипов и репрессии генов-мишеней miR-21 в макрофагах. Активированные макрофаги с большей вероятностью перемещались к местам повреждения, где располагались нейроны, выделяющие EVs, что свидетельствует о существовании и важности межклеточной коммуникации, опосредованной миРНК.²⁰ Переносимые EVs миРНК также были связаны с раком, способствуя метастазированию, лекарственной устойчивости, пролиферации и воспалению.²⁵

Как показывает существование путей передачи миРНК в EV, миРНК, по-видимому, преимущественно загружаются в EVs по сравнению с другими типами РНК, что позволяет предположить наличие эндогенной системы загрузки внутри клеток. AGO2 - РНК-связывающий белок, связывающий миРНК и, возможно, ответственен за загрузку миРНК в EVs.²⁶ Благодаря своему широкому регуляторному потенциалу и естественному присутствию в EVs, миРНК и AGO2-связывающие shRNAs представляются отличными кандидатами для EV-терапевтики.

Другим классом регуляторных РНК, обнаруженных в EVs, являются circRNAs.²⁷ Циркулярные РНК - это класс одноцепочечных кольцевых не-кодирующих РНК, образующихся в результате обратного сплайсинга экзонов в мРНК.^28,29 В некоторых генах наблюдалась экспрессия в несколько раз большего количества циркулярных РНК по сравнению с белок-кодирующей мРНК, что свидетельствует о важной функциональной роли, включающей регуляцию транскрипции путем поглощения миРНК, взаимодействие с белками, конкуренцию при сплайсинге пре-мРНК и, реже, о роли шаблонов для трансляции белков.³⁰ Отсутствие 5' и 3' концов защищает циркулярную РНК от деградации экзонуклеазами, что в конечном итоге обусловливает более длительный срок жизни этих транскриптов в цитоплазме по сравнению с другими РНК.³¹ Это подтверждается и отрицательной связью между пролиферацией клеток и концентрацией циркулярной РНК, предположительно потому, что циркулярные РНК после пролиферации могут разбавляться дочерними клетками. Недавно было обнаружено, что функциональные циркулярные РНК загружаются в клетки-реципиенты и переносятся в них с помощью EVs. Соотношение между циркулярной РНК и линейной РНК в EVs выше, чем в клетках-продуцентах, это указывает на эндогенный механизм сортировки.³² Некоторые циркулярные РНК высоко экспрессируются в раковых клетках, и доказано, что EV-упакованные циркулярные РНК частично ответственны за распространение различных видов рака; поэтому экзосомные циркулярные РНК рассматриваются в первую очередь как биомаркеры для скрининга рака на ранних стадиях.^32,33 Однако благодаря своей повышенной стабильности циркулярные РНК могут быть упакованы в EVs и перенесены в клетки-мишени, где они могут поддерживать трансляцию белка дольше, чем обычные мРНК.³⁴ Примечательно, что циркулярные РНК могут быть сконструированы с внутренним сайтом входа в рибосому (IRES) для экспрессии интересующих белков.³⁴ Поскольку циркулярные РНК сохраняются дольше, чем линейные РНК, это может быть одним из подходов к созданию повышенной долгосрочной экспрессии белка. Такое применение было бы особенно полезно при создании вакцин для увеличения времени воздействия антигенов на иммунную систему или, в целом, для получения наибольшего количества белка из терапевтической дозы. Несмотря на то, что природные циркулярные РНК, обладающие открытой рамкой считывания (ORF), присутствуют в меньшинстве клеток и пока не доказана их способность к трансляции, предпринимались попытки сконструировать циркулярные РНК с кодирующей способностью.³⁵ Wesselhoeft et al. добились надежной экспрессии люциферазы, EGFP, эритропоэтина и CRISPR-ассоциированной эндонуклеазы 9 (Cas9) при трансфекции самосплайсирующейся интрон-индуцированной циркулярной РНК в клетки HEK293.³⁴ Qu et al. создали циркулярную РНК, кодирующую спайковый белок коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), и провели эксперименты in vivo на мышах для проверки иммунизационной способности циркулярных РНК-вакцин, инкапсулированных в LNPs..³⁶ У мышей, получавших эти частицы, вырабатывались антитела и Т-клеточные реакции, аналогичные тем, что были у аналогов, получавших линейную мРНК.³⁶ В целом эти результаты свидетельствуют о том, что циркулярные РНК образуют больше белков, чем линейные мРНК, и поэтому могут повысить общую эффективность мРНК-терапии и оказаться полезными в вакцинных подходах, а также при лечении рака, инфекционных и генетических заболеваний. В идеале такие терапевтические циркулярные РНК могут быть сконструированы таким образом, чтобы кодировать терапевтические белки и специально загружаться в EVs для длительной экспрессии белков в клетках-мишенях.

В то время как система EXOtic позволяет упаковывать в EVs мРНК, кодирующие белки, другие ученые разработали способ загрузки в EVs несвязанных терапевтических белков. CRY2 - растительный белок, изменяющий конформацию при воздействии синего света, а CIBN - усеченная версия CIB1, белка, имеющего сродство к CRY2 в возбужденной форме.³⁷ CIB1 был присоединен к цитозольному хвосту EV-маркера CD9, а CRY2 - к репортерным белкам, таким как mCherry и GFP.³⁸ Эта система, названная EXPLOR, показала, что груз-CRY2 загружается в EV путем обратимого связывания с CIB1 при облучении клеток-продуцентов синим светом. Однако в отсутствие синего света комплекс "груз-CRY2" находился в свободном доступе в выделенных EVs. Используя этот подход, Choi et al. успешно загрузили в EVs рекомбиназу Cre и супрессор пути ядерного фактора κB (NF-κB) srI?B.³⁹

Основываясь на этой модели, Osteikoetxea et al. проверили возможность загрузки белка Cas9 в EVs и сравнили его с тремя другими аналогичными системами загрузки, основанными на гетеродимеризации при воздействии активирующего стимула.⁴⁰ Это PHIB и PIF6, взаимодействующие при облучении светом 630 нм и небольшой молекулой phycocyanobilin, сконструированные белки VVD с наномагнитами, взаимодействующие в присутствии синего света, и, наконец, FKBP и FRB, взаимодействующие в присутствии небольшой молекулы рапамицина. Группа продемонстрировала, что загрузка CRY2-CIB1 приводит к самой высокой концентрации Cas9 во фракциях EV, достигающей более 20 молекул Cas9 на EV.⁴⁰ Примечательным наблюдением этого исследования стали данные, свидетельствующие о том, что инженерия MysPalm для доставки белкового груза оказывается более выгодной по сравнению с инженерией к маркерам тетраспанина, таким как CD9. Две возможные причины этого наблюдения: (1) конъюгированный домен может быть неправильно сложен в эндоплазматическом ретикулуме (ER) при связывании с мембранным белком, или (2) он может мешать позиционированию CD9 в его естественном месте в мембране EV. В пользу этого предположения говорит тот факт, что конъюгированные Cas9 были лишь на 30%-50% активнее Cas9 дикого типа (WT), что указывает на то, что такие системы загрузки снижают эффективность редактирования генов.⁴⁰ Это важно, поскольку эффективность будущих терапевтических EV будет зависеть от количества активных терапевтических белков, доставляемых в клетки-мишени.

Другой инновационный метод загрузки белков в EVs заключается в модификации грузовых белков меткой WW, которая распознается Ndfip1, L-домен-содержащей убиквитин-лигазой, которая убиквитинирует грузовой белок, приводя его в EVs в процессе биогенеза.⁴¹ В отличие от системы CRY2, метка WW, присоединенная к Cre, так же эффективно выполняла свою функцию, как и WT-белок. WW-Cre функционировал после доставки в клетки-реципиенты, а загрузка WW-Cre в EV происходила Ndfip1-зависимым образом.⁴¹ Этот метод использует эндогенную систему почкования и загрузки белка в клетку, которая может быть расширена для загрузки терапевтических белков в EVs (рис. 1). Эта система имеет ряд преимуществ по сравнению с методом загрузки CRY2-CIB1. Во-первых, домен WW значительно меньше белка CRY2, составляя всего ~40 остатков по сравнению с 593 остатками человеческого CRY2. Можно утверждать, что более крупные конъюгированные белки представляют собой более высокий риск вмешательства в функцию грузового белка, что ограничивает терапевтический эффект. Так было в исследовании Osteikoetxea et al., где CRY2-Cas9 обладал лишь 50%-ным потенциалом редактирования по сравнению с WT Cas9, тогда как WW-Cre был столь же эффективен в рекомбинации ДНК, как и его WT-версия.⁴⁰ Во-вторых, поскольку система WW использует путь, уже присутствующий в клетках, она требует минимальных манипуляций с клетками-продуцентами, которые необходимо трансфицировать WW-белком для эффективной загрузки EVs. Поскольку клетки-продуценты уже нуждаются в трансфекции терапевтического белка, система WW увеличивает загрузку белка без дополнительных модификаций клеток, хотя избыточная экспрессия Ndfip1 положительно коррелирует с убиквитинированием WW-Cre. Наконец, домен WW естественным образом встречается в других белках человека и поэтому, предположительно, представляет меньший риск иммунологической реакции по сравнению с растительным CRY2-CIB1. Обе системы выгодно отличаются от других систем загрузки белка, поскольку белок находится в EVs в свободном состоянии и доставляется непосредственно в цитоплазму клеток-мишеней.

Figure 1Endogenous and engineered EV pathways Show full caption

Несмотря на то, что в нескольких текущих клинических испытаниях участвуют EVs, до сих пор ни один EV-терапевтический препарат не вышел на рынок.⁴² Отчасти это объясняется неадекватностью процессов производства и очистки EVs в больших масштабах⁴³ , а также тем, что большая часть современной литературы посвящена разработке новых EVs и доказательству их потенциала с помощью исследований in vitro и на животных, при этом мало внимания уделяется тому, что требуется для трансляции EV-терапевтических препаратов.

EVs могут быть сконструированы для переноса терапевтических молекул, таких как белки или РНК, и в настоящее время проводится множество исследований по оптимизации их терапевтического потенциала путем увеличения производства и высвобождения EVs из клеток-продуцентов, повышения эффективности загрузки груза, увеличения тканевого тропизма и ускорения высвобождения груза в клетки-мишени (рис. 1). Биогенез EVs начинается с образования ранней эндосомы путем отпочкования внутрь клеточной мембраны с последующим отпочкованием внутрь эндосомной мембраны с образованием интралюминальных везикул (ILVs) (рис. 1). Затем ILVs либо деградируют путем слияния с лизосомой, либо секретируются через эндосомный сортировочный комплексный транспорт (ESCRT) - зависимый или независимый от ESCRT путь.^44,45 Биогенез EVs контролируется несколькими белками ESCRT и белками, участвующими в формировании и отпочковании везикул; таким образом, подавление или повышение экспрессии этих белков может увеличить количество EVs, высвобождаемых клетками-продуцентами. Это может быть актуально для повышения эффективности производства EVs из клеток-продуцентов и снижения затрат на производство терапевтических EVs. Colombo et al. проанализировали, может ли замалчивание (сайленсинг) нескольких белков, связанных с биогенезом EVs, привести к увеличению количества EVs. Исследователи разработали shRNA, направленные на CHMP4C, VPS4B, ALIX и VTA1 - четыре гена ESCRT, участвующих в биогенезе EVs, и обнаружили, что сочетание shRNA VPS4B и CHMP4C, shRNA ALIX и VTA1 увеличивает количество высвобождаемых EVs более чем на 50%.⁴⁶

В большинстве экспериментальных публикаций, посвященных EVs, сообщается о выделении EVs из супернатанта клеток путем ультрацентрифугирования при 100 000 g и фильтрации через фильтры 0,22 µм. Эти выделенные EVs затем используются для различных исследований, в том числе и для оценки in vivo. Однако такой подход достаточно обременителен, позволяет получить гетерологичные популяции EVs и может оказаться сложным для клинического применения. Кроме того, относительно короткий срок жизни EVs (менее 48 ч in vivo)¹¹ указывает на необходимость многократного введения EVs в качестве терапевтической стратегии. Альтернативным подходом может быть создание клеток непосредственно in vivo для производства EVs с определенной терапевтической полезной нагрузкой. Можно представить себе использование скрытых лентивирусных векторных систем⁴⁷ или аденовирусов для in vivo трансдукции клеток и превращения их в терапевтические фабрики по производству EVs. В качестве альтернативы можно использовать трансдукцию иммунных клеток ex vivo, превращая их в фабрики по производству EVs, подобно тому, как это делается в настоящее время с химерными антигенными (CAR) Т-клеточными терапевтическими препаратами.⁴⁸ Хотя безопасность будет вызывать беспокойство, такой подход может обойти проблему производства и вариации партий, которая является проблемой для современных систем in vitro EVs. Дополнительные уровни безопасности инженерных клеток in vivo в качестве фабрик EVs могут быть обеспечены за счет использования тканеспецифичных промоторов,^49-51 выбора терапевтических РНК, специфичных для конкретного заболевания, или нацеливания на длинные не-кодирующие РНК, участвующие в регуляции определенных генов, которые нацелены только на гены заболевания, но не на гены хозяина⁵². Безопасность также может быть обеспечена использованием гена-самоубийцы, такого как cetuximab (Erbitux), который способен распознавать и вызывать гибель клеток, экспрессирующих усеченный EGFR, и регулярно используется в клинических исследованиях CAR-терапии для лечения рака.⁵³ Наконец, возможно, терапия нового поколения, такая как использование гибридного интегрирующего подхода LNPs или подхода LNP/аденовирус, может оказаться полезной для преобразования клеток печени in vivo, например, в терапевтические EV-фабрики. Как бы то ни было, очевиден один факт: EVs становятся уникальным средством доставки, достаточно сильно отличающимся от LNPs и векторных систем, что, несомненно, изменит нынешнюю траекторию развития генной и клеточной терапии и предвещает светлое будущее в лечении различных заболеваний. Вопрос, однако, заключается не в том, будет ли это сделано, а в том, когда.