Гемофилия A и B - это Х-сцепленные генетические заболевания кроветворения, обусловленные дефектом гена, кодирующего фактор свертывания крови VIII (FVIII) или IX (FIX) соответственно. Уровень остаточной активности фактора свертывания крови определяет тяжесть кровотечения, которое можно разделить на три фенотипа: легкое (5-40%), умеренное (от 1% до ~5%) и тяжелое (менее 1%).

В настоящее время для поддержания активности фактора свертывания крови на уровне выше 1% требуется регулярная профилактика очищенным белком FVIII или FIX, что позволяет предотвратить кровотечение и сохранить здоровье суставов пациентов. К настоящему времени применение факторов свертывания с увеличенным периодом полужизни путем соединения с альбумином, IgG-Fc-областью или другими доменами (Fc-vWF-XTEN), а также гуманизированного биспецифического антитела к фактору IXa и фактору X позволило снизить частоту вливаний.^1-4

Хотя эти методы лечения улучшили качество жизни пациентов, они не являются лечебными, и серьезные кровотечения сохраняются. Кроме того, примерно у 20-30% пациентов с тяжелой формой гемофилии А и у 3% пациентов с гемофилией В образуются нейтрализующие антитела (nAbs) против очищенного фактора свертывания крови, что делает лечение неэффективным.⁵ Поскольку гемофилия связана с дефектом одного гена, она всегда считалась идеально подходящим заболеванием для генотерапии. Более того, тяжелый фенотип может быть преобразован в умеренный даже при незначительном повышении концентрации FVIII или FIX в плазме крови, что значительно улучшает качество жизни пациентов.

Более двух десятилетий назад генотерапия продемонстрировала свой потенциал для лечения и длительной коррекции гемофилии на до-клинических моделях животных.^6-9 Эти достижения позволили гемофилии стать одним из основных катализаторов развития генотерапии. За последние 30 лет были проведены многочисленные исследования стратегий генотерапии, направленных на увеличение продукции FVIII и FIX.

Исследовались различные векторные технологии, включая как интегрирующие векторы, такие как ретровирусные и лентивирусные, так и не-интегрирующие векторы, в частности рекомбинантные адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы. Интегрирующие векторы используются как для направленной генотерапии печени in vivo, так и ex vivo. Одними из наиболее привлекательных клеток-мишеней для генотерапии ex vivo являются hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs), позволяющие экспрессировать факторы свертывания крови в дифференцированных потомках, таких как миелоидные клетки или тромбоциты.

На основании обнадеживающих до-клинических исследований на моделях мышей и собак эти исследования в настоящее время переходят в фазу I/II клинических испытаний у пациентов с тяжелой формой гемофилии А.^10-12 Ожидается, что благодаря стабильной геномной интеграции терапевтических трансгенов в добросовестные HSPC будет происходить длительная экспрессия факторов свертывания крови. Однако одной из проблем этой стратегии является необходимость проведения миелоаблативного кондиционирования для создания "пространства" в костномозговой нише и, следовательно, облегчения приживления сконструированных HSPC.

Кроме того, существуют определенные опасения относительно потенциального онкогенного риска, связанного со случайной интеграцией интегрирующих векторов, таких как ретровирусные или лентивирусные векторы.^13-17 В частности, хорошо известно, что трансдукция HSPCs ретровирусными γ-векторами может привести к развитию лейкемии вследствие активации онкогенов вирусными промоторами и энхансерными элементами.^13,14

Однако этот генотоксический риск может быть снижен путем модификации конструкции вектора за счет использования более слабых внутренних промоторных/энхансерных элементов для запуска интересующего трансгена и/или использования самоинактивирующихся векторов, в которых инактивирован длинный терминальный повтор вируса.^15,16

Наибольшего прогресса удалось достичь благодаря использованию векторов AAV, на основе которых недавно были созданы первые продукты генотерапии, одобренные регулирующими органами. Эти AAV-векторы предназначены для инкапсуляции трансгена FVIII или FIX ниже по течению от специфического для печени промотора. Трансгены, как правило, оптимизированы по кодонам для обеспечения максимальной трансляции. Поскольку AAV широко распространены в окружающей среде, значительная часть человеческой популяции подверглась их воздействию, что привело к серо-распространенности nAbs против различных серотипов AAV, которая оценивается в 30-60%.

Кроме того, у людей, уже получивших инъекцию вектора AAV, также вырабатываются nAbs, причем их уровень обычно в разы выше, чем в ответ на воздействие окружающей среды.^18-20 Такая распространенность nAbs против AAV может ограничить трансдукцию вектора и сделать лечение неэффективным. В небольшом исследовании, включавшем первых пациентов с тяжелой формой гемофилии В, которым проводилось системное лечение вектором AAV2-hFIX, были обнаружены длительно сохраняющаяся (±15 лет) невосприимчивость к нескольким серотипам AAV.²¹

Особенно сложно будет эффективно преодолеть относительно высокие и устойчивые уровни AAV nAbs, которые развиваются после системного введения AAV вектора. В настоящее время разрабатываются новые стратегии, направленные на устранение или обход этих пред-существующих nAbs²².

На сегодняшний день завершены или проводятся многочисленные клинические испытания генотерапии гемофилии А и В на основе AAV. Большинство клинических испытаний ограничено AAV-серонегативными пациентами с умеренной и тяжелой формой гемофилии А или В в возрасте 18 лет и старше, у которых еще не сформировались nAbs (ингибиторы) против FVIII или FIX. Кроме того, дополнительными критериями, которые могут ограничить участие в исследованиях, являются наличие активного гепатита, хронической инфекции гепатита С, общее состояние печени, а в некоторых исследованиях - ВИЧ-инфекция, даже если она хорошо контролируется.

В рамках данного обзора мы не будем подробно обсуждать все исследования генотерапии гемофилии, проведенные за последние два десятилетия, которые подробно рассмотрены в других источниках.^23-26 Вместо этого мы сосредоточимся на последних клинических исследованиях III фазы, которые привели к одобрению первых разрешенных препаратов генотерапии гемофилии А и В, основанных на более ранних клинических исследованиях у пациентов с тяжелой формой гемофилии.^21,27-29 Кроме того, мы также обсудим некоторые перспективы использования генного редактирования для лечения взрослых и педиатрических пациентов с гемофилией.

Ген F8 имеет кодирующую последовательность длиной 7 кб и кодирует FVIII, который имеет три домена А, один домен В и два домена С. Из-за малой упаковочной способности векторов AAV (±4,7 кб) во всех клинических испытаниях гемофилии А использовался кодон-оптимизированный вариант FVIII с делецией B-домена (BDD-FVIII).^23-34 При делеции B-домена, составляющего около 44% комплементарной ДНК (кДНК) F8, сохраняется коагуляционная активность и фактически увеличивается экспрессию FVIII на уровне мРНК.^35,36

В-домен содержит 19 сайтов N-связанного гликозилирования. При частичном удалении В-домена с сохранением нескольких сайтов N-связанного гликозилирования FVIII демонстрирует повышенную эффективность секреции за счет улучшения транспорта из эндоплазматического ретикулума (ER) в аппарат Гольджи.³⁵

Хотя большинство стратегий генотерапии гемофилии А направлено на гепатоциты, FVIII естественным образом секретируется эндотелиальными клетками синусоидов печени (LSECs).^37-39 Это согласуется с данными трансгенных мышей, показавших, что целенаправленное разрушение гена F8 в эндотелиальных клетках приводит к тяжелому проявлению гемофилии А, тогда как модель нокаута F8 в гепатоцитах демонстрирует нормальный фенотип.³⁸

Тем не менее, в очищенных LSECs и гепатоцитах, а также в таких тканях, как селезенка, лимфатические узлы и почки, были обнаружены сопоставимые концентрации мРНК FVIII^40,41 , что позволяет предположить, что продукция FVIII в гепатоцитах нарушена на пост-транскрипционном уровне по сравнению с LSECs. Функциональная секреция FVIII зависит от lectin, mannose-binding protein 1 (LMAN1), известного также как промежуточный компартмент ER/Golgi-53.

Известно, что LMAN1 образует специфический грузовой рецепторный комплекс с multiple coagulation factor deficiency protein 2 для переноса специфических белков из ER в аппарат Гольджи.⁴² Высокая экспрессия FVIII в гепатоцитах активирует стрессовый ответ ER,^43,44 что объясняет нарушение секреции FVIII, несмотря на наличие мРНК FVIII.

При высокой экспрессии FVIII ингибируется метаболизм глюкозы, что приводит к удержанию FVIII в ER, где он образует амилоидоподобные фибриллы.⁴⁵ Кроме того, эта агрегация инициируется коротким аминокислотным мотивом (aggron) в домене А1 FVIII. Однако было установлено, что взаимодействие с белками-шаперонами ER, кальнексином/кальретикулином и иммуноглобулин-связывающим белком (BiP) предотвращает агрегацию и, в случае BiP, может обратить ее вспять.⁴⁵

Одним из крупнейших на сегодняшний день клинических испытаний III фазы генотерапии гемофилии А является исследование valoctocogene roxaparvovec. (BMN 270) компании BioMarin. Он состоит из вектора AAV5, экспрессирующего специфический для гепатоцитов промотор перед кодирующей последовательностью BDD-FVIII человека.^46,47 В это исследование III фазы с открытым планом были включены 134 взрослых пациента мужского пола с тяжелой формой гемофилии А ((FVIII levels ≤1 IU/dL).

Эти пациенты ранее регулярно получали профилактику экзогенным FVIII и не имели в анамнезе анти-FVIII или анти-AAV5 антител.⁴⁸ Все участники получили однократное вливание валоктокогена роксапарвовека (6 х 10¹³ векторных геномов на килограмм [vg/kg]) и находились под наблюдением в течение 2 или более лет после воздействия. Активность FVIII измерялась в разные моменты времени с помощью хромогенного анализа свертывания (CCA) и одностадийного анализа свертывания (OCA).⁴⁸

Среди 132 участников средняя хромогенная активность FVIII увеличилась от исходного уровня (1 IU/dL) до 104-й недели в среднем на 22,3 ± 29,7 IU/dL. Среднее снижение годовой частоты кровотечений (ABR) на 77,0% и снижение годовой частоты использования FVIII на 98,2% по сравнению с исходным уровнем было отмечено у 132 участников через 1 и 2 года наблюдения, что свидетельствует о превосходстве валокордина роксапарвовека над профилактическим использованием экзогенного FVIII.⁴⁸

Тем не менее, у 17 из 132 участников наблюдалась 40% потеря экспрессии и продолжающееся снижение активности FVIII в период от 1 до 2 лет после инфузии, что отражает результаты 6-летнего наблюдения в исследовании фазы I/II BMN 270 с семью участниками.²³ Повышение уровней alanine aminotransferase (ALT) и aspartate aminotransferase (AST) также наблюдалось у 88,8% и 35,1% всех участников, соответственно, в период от 1 до 2 лет после инфузии, что указывает на возможные проблемы с безопасностью печени.⁴⁸

Однако участники получали иммунодепрессанты для снижения уровня ALT и AST. В августе 2022 г. Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) и в июне 2023 г. Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) был одобрен Valoctocogene roxaparvovec (торговая марка Roctavian®).

Эффективность и безопасность giroctocogene fitelparvovec (PF-07055480, ранее назывался SB-525), рекомбинантного вектора AAV2/6, экспрессирующего BDD-FVIII, в настоящее время изучается в рамках продолжающегося клинического исследования III фазы (исследование AFFINE) после получения обновленных данных о 3-летнем наблюдении за результатами исследования I/II фазы Alta. Giroctocogene fitelparvovec содержит многофакторные модификации печеночно-специфического промотора, трансгена FVIII, сигнала полиаденилирования и основы вектора⁴⁹.

В исследовании Alta I/II фазы 11 взрослым мужчинам с тяжелой формой гемофилии А вводили Giroctocogene fitelparvovec в четырех возрастающих дозах: 9 x 10¹¹ (n = 2), 2 x10¹² (n = 2), 1 x 10¹³ (n = 2) и 3 x 10¹³ vg/kg (n = 5) в течение 3-х лет.²⁸ Средняя активность FVIII у пациентов, которым вводилась высокая доза препарата, увеличивалась до 24-й недели после введения и достигала 70,1% по данным CCA и 104,8% по данным OCA.

Однако эта активность постепенно снижалась с 1-го года после введения до 12,5% (CCA) и 22,9% (OCA) на 3-й год после введения препарата³³ , что полностью совпадает с данными III фазы по участникам, получавшим c valoctocogene roxaparvovec.⁴⁸ В этой когорте пациентов, получивших высокую дозу препарата, ABR снизился до 0 - через 1 год после введения и до 0,9 в течение всего 3-летнего наблюдения.²⁸

Однако у двух участников произошло в общей сложности 12 кровотечений. Повышение уровня ALT и AST наблюдалось у 60% и 40%, соответственно, пациентов, получивших 3 x 10¹³ vg/kg, получавших кортикостероиды (диапазон: 7-135 дней). Из этой когорты у одного пациента через 6 ч после инфузии вектора возникли серьезные побочные эффекты в виде гипотонии и лихорадки, которые полностью прошли на следующий день. Дальнейшее изучение безопасности и эффективности giroctocogene fitelparvovec в настоящее время проводится в более крупном когортном клиническом исследовании III фазы.

Однако при изучении долгосрочной экспрессии и активности FVIII остаются некоторые противоречия. Очевидное медленное снижение экспрессии FVIII у некоторых пациентов противоречит 10-летней стабильной экспрессии FVIII, наблюдаемой в леченных собачьих моделях тяжелой гемофилии А.^50,51 Снижение активности FVIII, наблюдавшееся в обоих клинических исследованиях с either valoctocogene roxaparvovec или giroctocogene fitelparvovec, было отмечено и у некоторых участников, получавших SPK-8011, также называемый Spark200.³¹

Интересно, что у некоторых участников исследования СПК-8011 уровень экспрессии FVIII оставался относительно стабильным в течение 3 лет после введения препарата31. Примечательно, что участники исследования SPK-8011 получали в 15-120 раз меньшие дозы вектора (0,5-2 x 10¹² vg/kg) по сравнению с пациентами, получавшими валоктокоген роксапарвовек и гироктокоген фителпарвовек в высоких дозах (6 x 10¹³ и 3 x 10¹³ vg/kg, соответственно), что позволяет предположить, что высокие дозы вектора, а значит и высокие концентрации FVIII, могут быть неблагоприятными и приводить к постепенному снижению экспрессии FVIII со временем.

Повышение уровня ALT и AST - распространенный побочный эффект, связанный с лечением, наблюдаемый у большинства участников всех клинических исследований. Это повышение часто является результатом цитотоксического иммунного ответа на капсид AAV, когда CD8+ Т-клетки распознают капсидные пептиды AAV, представленные в трансдуцированных гепатоцитах по главному гистосовместимому комплексу I⁵².

Если бы большинство трансдуцированных гепатоцитов распознавалось CD8+ Т-клетками и, таким образом, уничтожалось, то можно было бы ожидать снижения экспрессии FVIII. Это часто наблюдается в клинических исследованиях, где такому снижению предшествует повышение уровня трансаминаз. Хотя часто иммуномодуляция с помощью глюкокортикоидов поддается лечению, она не всегда успешно подавляет AAV-опосредованные иммунные реакции, как это было показано в последнем исследовании III фазы с валоктокогеном роксапарвовек, где уровень аминотрансфераз сохранялся от нескольких месяцев до 2 лет после введения у 29% участников, что также могло объяснить необнаруживаемую активность FVIII через 2 года после введения у 18 из 132 участников (13,6%).^48,53

За последние несколько лет в нескольких клинических исследованиях генотерапии гемофилии А было отмечено расхождение между активностью FVIII в плазме крови, измеренной с помощью CCA и OCA. CCA измеряет только образование активированного фактора X (FXa), отражая функциональность активированного FVIII (FVIIIa). В отличие от этого, OCA, определяемая по времени, необходимому для образования плазменного сгустка, оценивает как преобразование про-ко-фактора фактора VIII в его активное ко-факторное состояние, обозначаемое как FVIIIa, так и его последующую функциональность в образовании кровяного сгустка.

Активность, измеренная с помощью OCA, как правило, в 1,3-2,0 раза выше по сравнению с CCA.⁵⁴ Такое расхождение между активностью, измеренной с помощью двух различных анализов, необходимо иметь в виду при анализе и сравнении результатов различных клинических исследований. Несмотря на клинический прогресс и недавнее условное одобрение valoctocogene roxaparvovec EMA и FDA, остаются нерешенными основные вопросы, касающиеся стабильности экспрессии FVIII и значительной вариабельности между пациентами.

По сравнению с геном F8, ген F9 имеет меньшую кодирующую последовательность размером ~1,6 кб, которая легко помещается в вектор AAV. FIX естественным образом экспрессируется в гепатоцитах, что делает их идеальной мишенью для генотерапии. Первые клинические испытания проводились с использованием FIX человека дикого типа или оптимизированного по кодонам, что в большинстве случаев приводило к стабильной экспрессии FIX.^26,55-57 Однако активность FIX составляла от 2% до 5% от нормы, что приводило к минимальной фенотипической коррекции, а в некоторых случаях не позволяло предотвратить спонтанные и травматические кровотечения. Кроме того, высокие дозы вектора приводили к воспалению печени и гепатоксичности.

Поэтому важно было снизить дозу вектора, чтобы избежать возможного воспаления печени и при этом получить высокую терапевтическую эффективность. Значительным прорывом стало открытие естественной миссенс-мутации FIX-R338L-Padua у пациентов с тромбофилией.⁵⁸ Этот вариант FIX обладает 8-кратным увеличением специфической активности по сравнению с человеческим FIX дикого типа, что приводит к более прочному образованию тромба.

Мы продемонстрировали, что генная терапия, направленная на печень, привела к 5-10-кратному повышению эффективности у мышей с гемофилией В, в то время как Finn et al. продемонстрировали превосходство генотерапии, направленной на мышцы с помощью AAV.^59,60 Мы и другие исследователи также показали превосходство FIX-Padua после направленной генотерапии печени с помощью AAV в до-клинических моделях животных, при этом не было выявлено повышенного иммуногенного или тромбогенного риска.^61-64 Эти данные открыли путь к клиническим испытаниям на основе гиперфункционального FIX-Padua, который стал золотым стандартом для клинических испытаний генотерапии гемофилии В.

Исследование III фазы Health Outcomes with Padua Gene; Evaluation in Hemophilia B (HOPE-B) с использованием etranacogene dezaparvovec, AAV5-вектора, содержащего кодон-оптимизированный человеческий FIX-Padua, показало превосходные результаты в отношении ABR и профиля безопасности.^65,66 В этом исследовании, финансируемом компаниями uniQure и CSL Behring, 54 взрослым мужчинам с гемофилией В (умеренно тяжелой - n = 10; тяжелой - n = 44) с активностью FIX ~2% от нормы вводили дозу 2 x 10¹³ vg/kg и наблюдали в течение 52 недель за побочными эффектами, активностью FIX, ABR и профилактикой FIX.^65,66

Кроме того, качество жизни, связанное со здоровьем (HRQoL), измеренное с помощью специфического для гемофилии инструмента Hem-A QoL, оценивалось через 6 и 12 месяцев после инфузии. Примечательно, что из 54 пациентов у 21 были уже существующие nAbs AAV5. Один пациент не получил полной дозы препарата и был исключен из исследования. Другой пациент не ответил на лечение из-за высокого титра нейтрализующих антител (nAbs = 3,212).

Через 6 месяцев после инфузии была достигнута средняя активность FIX 39,0% (OCA) или 16,5% (CCA), которая сохранялась до достижения первичной конечной точки эффективности через 18 месяцев с показателями 36,9% (OCA) или 19,7% (CCA). Недавно Coppens et al. продемонстрировали среднюю активность FIX на уровне 36,7% (OCA) через 24 месяца после инфузии и сообщили об отсутствии клинически значимой корреляции между титром AAV5 nAbs и активностью FIX на протяжении всего исследования.⁶⁷ По сравнению с начальным периодом профилактики FIX участники продемонстрировали снижение ABR на 64% и снижение потребности в профилактике FIX на 95%, что свидетельствует о статистическом превосходстве etranacogene dezaparvovec над профилактикой FIX.

Кроме того, у этих участников было отмечено общее улучшение HRQoL на 21,5%. Оценка безопасности показала наличие 92 нежелательных эффектов, связанных с лечением, у 37 участников. Семьдесят четыре из 92 (80,4%) были легкими.^65,66 У 11 участников (20%) наблюдалось повышение уровня ALT, что в большинстве случаев расценивалось как легкое или умеренное нежелательное явление. Девять из 11 участников получали глюкокортикоидную терапию в среднем в течение 79,8 дней, после чего уровень ALT снизился при сохранении стабильной экспрессии FIX. Кроме того, ингибиторы FIX не развились ни у одного участника⁶⁵.

Это клиническое испытание показало стабильную экспрессию FIX, позволило увеличить число пациентов, подлежащих лечению, даже в условиях низкого/умеренного уровня анти-AAV5 NAbs (т.е. при включении AAV nAb) и продемонстрировало в целом приемлемый профиль безопасности. Недавно препарат etranacogene dezaparvovec, получивший обозначение Hemgenix®, был одобрен FDA и Европейским Союзом.

В настоящее время в другом клиническом исследовании III фазы под названием BENEGENE-2 изучается эффективность и безопасность fidanacogene elaparvovec, известного также как SPK-9001 или PF-06838435. В этом исследовании, спонсором которого выступила компания Pfizer, 45 серонегативных по AAV взрослых мужчин с умеренной и тяжелой формой гемофилии B получили инъекцию 5 x 10¹¹ vg/kg вектора AAV-LK03, кодирующего человеческий FIX-Padua под контролем специфического для печени промотора аполипопротеина Е (ApoE) enhancer/alpha1-antitrypsin (hAAT) (ApoE/hAAT).

Стабильная активность FIX, составляющая 27,7%, 25,5% и 25,0%, наблюдалась соответственно через 6, 12 и 24 месяца после введения препарата⁶⁸ , а также снижение ABR на 71%⁶⁹ , что позволило достичь первичной конечной точки. Профиль безопасности соответствовал результатам предыдущей фазы I/II. Повышение уровня ALT было зарегистрировано у 26,6% и контролировалось с помощью глюкокортикостероидов. Хотя это исследование еще продолжается, данные за 2 года подтверждают стабильную экспрессию трансгена и его безопасность, что в точности повторяет данные, полученные в исследовании HOPE-B, хотя, по-видимому, требует гораздо меньших доз⁷⁰.

В отличие от клинических испытаний генотерапии гемофилии А, эти два исследования фазы III показывают, что уровень экспрессии FIX относительно стабилен и не снижается с течением времени при условии, что трансдуцированные гепатоциты не очищаются в результате иммунной реакции. Как и в большинстве исследований генотерапии, наблюдалось повышение уровня трансаминаз, которое устранялось глюкокортикоидной терапией при сохранении стабильного уровня FIX. Однако остается открытым вопрос о том, будет ли эта экспрессия оставаться стабильной в течение следующих десятилетий.

Отбор пациентов по-прежнему является фактором, требующим улучшения для всех видов генотерапии AAV. Примечательно, что как серо-негативные, так и серо-позитивные участники исследования HOPE-B продемонстрировали схожую активность FIX, тем самым показав, что серо-позитивные пациенты, не достигшие определенного порога содержания AAV nAbs, по-прежнему чувствительны к генотерапии AAV.

Ни у одного из участников обоих исследований не развились nAbs против FIX-Padua или тромботические осложнения, что согласуется с до-клиническими данными^62,71 , свидетельствующими о том, что экспрессия трансгена в гепатоцитах вызывает толерантность к трансгенному белку. Как и при анализе активности FVIII, наблюдались некоторые расхождения между хромогенным сгустком FIX и OCA, причем в последнем случае активность была выше.

Однако различия, наблюдаемые в этих двух анализах, не характерны для FIX-Padua, полученного с помощью генотерапии, а, скорее всего, обусловлены особенностями биохимии белка Padua. Хотя активность FIX варьирует, между анализами существует корреляция⁷².

Трансгены FVIII или FIX, доставляемые с помощью векторов AAV, остаются преимущественно эписомальными. У взрослых пациентов гепатоциты медленно обновляются, и, следовательно, ожидается, что не-интегрированные трансгены будут размываться при делении клеток. В связи с этим возникает некоторая неуверенность в том, что при использовании AAV-векторов можно добиться пожизненной экспрессии FVIII или FIX⁷³ в условиях медленного оборота гепатоцитов у взрослых, поскольку известно, что экспрессия трансгенов снижается при быстром делении гепатоцитов у новорожденных или ювенильных животных.^71-76

В отличие от AAV, использование интегрирующих векторов обеспечивает длительную экспрессию фактора свертывания даже в условиях быстро пролиферирующих гепатоцитов.⁷⁷ Пациенты детского возраста являются идеальной целевой группой для генотерапии, поскольку их можно лечить до начала суставных кровотечений, артропатий и других осложнений, связанных с гемофилией. Однако, поскольку гепатоциты у таких пациентов быстро пролиферируют, ожидается, что доставка AAV в эту группу пациентов приведет к преходящей экспрессии фактора свертывания крови из-за разбавления и потери векторных геномов.^74-76

Таким образом, существующие стратегии генотерапии гемофилии на основе AAV исключают педиатрических пациентов с гемофилией. Учитывая их склонность к стабильной геномной интеграции, лентивирусные векторы рассматриваются в качестве альтернативы AAV для генотерапии, направленной на печень (у взрослых или педиатрических пациентов)^59,78,79 или для ex vivo инженерии HSPCs.^10-12

Однако существует потенциальный риск безопасности, связанный с квазислучайным характером интеграции этих векторов.^13-17 Это может привести к активации онкогенов или инактивации генов-супрессоров опухолей, хотя этот риск может быть значительно снижен путем тщательного конструирования вектора.⁸⁰

В идеале предпочтительна эффективная направленная интеграция, основанная на интеграции трансгенов FVIII или FIX в так называемый "безопасный" локус в геноме или путем редактирования дефектных эндогенных генов FVIII или FIX.⁸¹ Основное преимущество редактирования самих генов FVIII или FIX заключается в том, что паттерн экспрессии и клеточная специфичность будут близко напоминать таковые для нативных генов, поскольку в значительной степени определяются эндогенными промоторами этих генов FVIII или FIX.

В качестве альтернативы можно предпочесть другие "безопасные" локусы (например, альбумин), если промотор в этих локусах сильнее промотора FVIII или FIX, что, как ожидается, это приведет к более высоким уровням экспрессии трансгена.⁸¹ Подходы к лечению гемофилии на основе редактирования генов предполагают создание целевых двунитевых разрывов (DSB) в геноме, а затем вставку или коррекцию копии гена в этом месте.

В контексте генотерапии гемофилии такие разрывы вызываются с помощью стратегий, основанных на нуклеазе цинковых пальчиков (ZFN), или технологий CRISPR/Cas. ZFN способны индуцировать DSBs в нужном геномном локусе при непосредственной доставке в печень мыши, а при совместной доставке с соответствующим образом сконструированным вектором-мишенью для генов обеспечивается замена генов в указанном ZFN локусе как путем направленной, так и независимой от гомологии целевой вставки генов^82,83.

Впервые была доказана возможность частичной коррекции гемофилии путем редактирования генов с помощью ZFN у гемофильных мышей, которая сохранялась даже в условиях индуцированной пролиферации гепатоцитов благодаря направленной стабильной геномной интеграции трансгена.⁸² На основании этих до-клинических исследований впоследствии было проведено клиническое испытание у пациентов с тяжелой формой гемофилии В путем редактирования генов на основе ZFN.^84,85

В этом методе две молекулы ZFN, доставляемые с помощью AAV, нацелены на локус альбумина как на безопасный сайт-мишень, позволяющий вставлять донорскую кДНК FIX, доставляемую с помощью другого AAV, ниже по течению от промотора альбумина. Следовательно, для эффективного редактирования генов необходимо присутствие этих трех различных конструкций в каждой трансдуцированной клетке.

К сожалению, пациент с гемофилией В не смог сократить использование концентрата FIX, и оценить эффективность редактирования генома не удалось. Испытания I/II фазы были прекращены, что свидетельствует о том, что данная стратегия редактирования генов требует дальнейшей оптимизации, прежде чем в конечном итоге будет достигнута устойчивая фенотипическая коррекция.

Появилось множество сообщений, демонстрирующих потенциал CRISPR/Cas для редактирования генов при гемофилии А или В в качестве альтернативы ZFNs. В этих случаях либо сам дефектный ген фактора свертывания исправлялся in situ, либо локус альбумина использовался в качестве "тихой гавани", кооптируя мощный альбуминовый промотор для запуска FVIII или FIX. В этих исследованиях изучались различные варианты Cas и методы доставки генов (AAV, аденовирус, гидродинамическая трансфекция).^76,86-94

Как правило, даже у новорожденных или в условиях индуцированной пролиферации гепатоцитов удается достичь стабильного уровня фактора свертывания и хотя бы частичной коррекции диатеза кровотечения. Уровни FIX в физиологическом диапазоне или выше могут быть достигнуты при использовании вместо него кодон-оптимизированного FIX-Padua.^71,86-94

Компания Intellia therapeutics интегрировала функциональную копию кДНК FIX в интрон локуса безопасного альбумина.⁹⁵ Для этого она использовала невирусные липидные наночастицы (LNP) для доставки мРНК CRISPR/Cas9 и направляющей РНК альбумина (gRNA), а также AAV, кодирующей кДНК F9. Такой гибридный подход с использованием LNP-AAV позволил обеспечить точную интеграцию в геном, что привело к стабильной экспрессии FIX под действием эндогенного промотора Alb и транзиторной экспрессии Cas9, снизив тем самым вероятность вне-целевых разрезов⁹⁵.

Использование LNP имеет ряд преимуществ: возможность повторного дозирования, большая грузоподъемность и низкий профиль иммуногенности по сравнению с AAV-векторами. Была получена целевая интеграция около 50% в клетки печени, что привело к стабильной концентрации FIX в плазме крови взрослых мышей с гемофилией B в течение 10 месяцев. Аналогичным образом, нормальный уровень циркулирующих белков FIX сохранялся на 28-й день после инъекции у не-человеко-образных приматов⁹⁵.

Важно оценить характер интеграции AAV в контексте редактирования генов на основе CRISPR/Cas. Хотя известно, что геномы векторов AAV могут располагаться эписомально или случайным образом интегрироваться в уже существующие DSB по всему геному, мы и другие исследователи наблюдали, что геномы векторов AAV могут также интегрироваться в специфические DSB, индуцированные CRISPR.^96-98

Это может вызвать потенциальные опасения в отношении генотоксичности из-за непрерывной экспрессии Cas9 и gRNA в результате интеграции копий вектора AAV, кодирующих компоненты CRISPR/Cas. Breton et al. разработали анализ секвенирования следующего поколения ITR-Seq для обнаружения in vivo интеграции AAV в геномные сайты редактирования ДНК, который поможет нам понять специфичность и эффективность нуклеаз, редактирующих геном, в до-клинических и клинических исследованиях⁹⁸.

Хотя для повышения эффективности нацеливания генов обычно требуется CRISPR/Cas, другие исследования показали, что нацеливание может быть достигнуто и без использования CRISPR/Cas9 или других нуклеаз для индуцирования DSBs. В частности, Barzel et al. разработали стратегию, получившую название "GeneRide", в которой ген FIX без промотора, которому предшествует кодирующая последовательность 2A-пептида и который фланкируется гомологичными рукавами, охватывающими стоп-кодон мыши Alb, интегрируется путем гомологичной рекомбинации в ген альбумина⁹⁹.

В результате частота интеграции по мишени составила ~0,5%, а уровень FIX в организме новорожденных и взрослых мышей с гемофилией B - до 20%.⁹⁹ Такая стратегия интеграции 2A-fusion позволяет эффективно нацеливать гены и лечить генетические заболевания как у новорожденных, так и у взрослых, значительно снижая при этом эффекты off-target.⁹⁹

Одобрение первых препаратов генотерапии для лечения гемофилии А (Roctavian-valoctocogene roxaparvovec компании BioMarin) и гемофилии В (Hemgenix-etranacogene dezaparvovec компании CSL Behring/uniQure) открывает новую главу в лечении пациентов с тяжелой формой гемофилии. Это не только важная веха в лечении гемофилии, но и значительный шаг в нашей борьбе с болезнью и человеческими страданиями, имеющий потенциально более широкое значение для всей отрасли".

Другие испытания III фазы генотерапии гемофилии А или В еще продолжаются и основаны на различных конструкциях векторов, капсидов и/или методах производства. Имеющиеся данные по этим исследованиям обнадеживают, поскольку позволяют достичь терапевтических уровней FVIII или FIX, что соответствует снижению потребления фактора и частоты кровотечений, в соответствии с результатами, полученными в ходе основных испытаний одобренных препаратов.

В отсутствие стандартов AAV и сравнений титров и качества векторов "head-to-head" сравнение дозовых реакций в этих различных клинических исследованиях не представляется простым. Несмотря на эту оговорку, можно предположить, что в некоторых исследованиях для достижения сопоставимых клинических преимуществ и уровней факторов потребовались гораздо меньшие дозы векторов. Возможно, это отражает различия в конструкции векторов, капсидов и/или методах их производства.

Несмотря на достигнутый прогресс, впереди нас ждут и другие трудности, и состояние дел, пожалуй, лучше всего можно подытожить одной из известных цитат сэра Уинстона Черчилля: "Это еще не конец. Это даже не начало конца. Но это, возможно, конец начала" (Лондон, 10 ноября 1942 г.). Одной из основных проблем, требующих решения, является высокая вариабельность среди пациентов, получающих лечение, что приводит к существенному разбросу уровней FVIII или FIX после генотерапии.

Точные причины этих различий до конца не выяснены, но они могут отражать различия на уровне проникновения вектора, внутриклеточной транспортировки, регуляции экспрессии FVIII или FIX и/или иммунных механизмов. Примечательно, что в предыдущем исследовании генотерапии гемофилии В на основе AAV высокий стабильный уровень экспрессии FIX был связан с полиморфизмом в гене интерлейкина-6 (IL-6), хотя причинно-следственная связь официально не была установлена¹⁰⁰.

Гуморальный и клеточный иммунный ответ против трансгенного продукта или генно-модифицированных клеток может быть вызван после получения AAV-генотерапии. Этот иммунный ответ зависит от нескольких сопутствующих факторов, включая природу самого трансгена, мутацию дефектного эндогенного гена, способ введения вектора и трансдуцированной клетки-мишени, дозу вектора и его дизайн.

До-клинические исследования показали, что нежелательные иммунные реакции против трансгенного продукта или трансдуцированных клеток могут быть предотвращены и/или подавлены путем индукции иммунной толерантности. Примечательно, что индукция иммунной толерантности зависит от индукции трансген-специфических регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+FoxP3+ Treg-клеток), которые, как полагают, играют роль в индукции иммунной толерантности после печеночной генотерапии с использованием AAV или других векторов.^101-104

Известно, что резидентные антиген-презентирующие клетки печени, такие как клетки Купфера, гепатоциты, стеллатные клетки и LSECs, играют роль в индукции толерантности, секретируя IL-10 и трансформирующий фактор роста-β, сигналы Notch, предоставляя антигены, полученные из гепатоцитов, Tregs и истощая эффекторные T-клетки по Fas/FasL-зависимому пути.^105-108

Для индукции толерантности необходимо индуцировать Tregs и активировать антиген-специфические CD8+ T-клетки пути белка программируемой клеточной гибели-1 (PD-1).¹⁰¹ Примечательно, что активация пути PD-1 не влияет на активацию CD8+ T-клеток, но влияет на их функциональность после активации. Величина индукции толерантности и опосредованного CD8+ Т-клетками клиренса определяется также дозой используемого вирусного вектора.¹⁰⁹

Кроме того, толерантность к фактору свертывания крови может быть достигнута, как показано в исследовании Chen et al., где мышам с гемофилией А перед проведением генотерапии вводили высоко-трег-селективную мутированную версию мышиного IL-2. Это привело к толерантности к FVIII путем предотвращения образования ингибиторов, которая стабильно сохранялась в течение как минимум 6 месяцев.¹¹⁰ Кроме того, толерантность может быть достигнута комбинацией rapamycin и ibrutinib, которая блокирует опосредованную антителами активацию комплемента в отношении капсида AAV и продуцируемого фактора свертывания.¹¹¹ Аналогично, иммунная модуляция с помощью анти-CD20 и рапамицина привела к аналогичному нарушению образования ингибиторов FVIII.¹¹²

Вероятно, адаптивные и врожденные иммунные механизмы играют определенную роль в дозозависимом transaminitis, который часто наблюдается во всех испытаниях генотерапии гемофилии, однако для дальнейшего изучения этих механизмов необходимы дополнительные исследования. Хотя преходящая иммуносупрессивная терапия кортикостероидами помогла стабилизировать экспрессию фактора у многих испытуемых, она не всегда была эффективной и вызывала известные побочные эффекты.

Поэтому важно продолжать разработку стратегий, позволяющих еще больше снизить дозы векторов без ущерба для общей эффективности векторной и трансгенной инженерии. Например, недавно мы испытали новый биоинженерный трансген (в сотрудничестве с доктором Blouse и коллегами), обозначенный как CB 2679d-GT, который обладал улучшенной каталитической активностью, сродством к активированному FVIII и устойчивостью к ингибированию антитромбином¹¹³.

Этот новый трансген значительно превосходит FIX-Padua и позволяет еще больше снизить дозу AAV-вектора при одновременном повышении терапевтической эффективности, что делает его потенциально привлекательным кандидатом для будущих клинических испытаний.

Еще один нерешенный вопрос касается, по-видимому, разных результатов в исследованиях гемофилии А и В, где экспрессия FVIII, по-видимому, менее стабильна, чем FIX. Хотя этот вопрос пока неясен, было предложено несколько механизмов, которые могли бы объяснить такое снижение активности FVIII, включая: (1) сайленсинг гена F8, (2) опосредованный FVIII ответ на разворачивание белка, (3) незамеченный иммунный ответ против трансдуцированных клеток (против капсида AAV и/или FVIII) или (4) характеристики вектора, связанные с методом его производства.^45,114 Нацеливание экспрессии FVIII на эндотелиальные клетки, которые являются естественными клетками, продуцирующими FVIII, потенциально может преодолеть некоторые из этих проблем, вызванных избыточной экспрессией FVIII в эктопических типах клеток, таких как гепатоциты.

Несмотря на демонстрацию многолетней экспрессии в моделях мелких и крупных животных и в испытаниях III фазы у больных гемофилией А и В, пока неясно, приведет ли генная терапия AAV к пожизненной экспрессии факторов свертывания крови. Таким образом, редактирование генов может открыть новые перспективы, которые в конечном итоге приведут к созданию полноценного лекарства. Однако, учитывая неутешительные результаты предыдущих испытаний генных редакторов на основе ZFN при гемофилии, было бы предпочтительнее сначала провести до-клинические исследования на крупных животных моделях с использованием последних достижений технологии CRISPR.

В исследованиях CRISPR на мышиных моделях в качестве вектора для доставки компонентов CRISPR/Cas обычно используется AAV, однако его длительная экспрессия повышает риск потенциальных событий вне мишени или DSB-индуцированных побочных эффектов, таких как хромотрипсис или p53-опосредованные реакции на повреждение ДНК^119,120.

Поэтому по-прежнему существует необходимость разработки эффективных не-вирусных подходов к доставке генов для введения компонентов CRISPR/Cas вместе с донорским шаблоном в нужные клетки-мишени. В идеале предпочтительнее подход, при котором компоненты CRISPR/Cas будут присутствовать в трансфицированных клетках только в течение критического окна для достижения эффективного редактирования генов, после чего их присутствие уже не требуется.

Наконец, нельзя исключить, что экспрессия бактериального белка Cas9 или его производных и ортологов может вызвать нежелательный иммунный ответ, который приведет к уничтожению клеток, подвергшихся генному редактированию¹²¹.

Вопрос о том, сможет ли редактирование генов для лечения гемофилии в конечном итоге оправдать свои ожидания и преодолеть некоторые проблемы традиционной генотерапии в условиях "известных неизвестных" и "неизвестных неизвестных", в настоящее время далеко не решен, и только всесторонние доклинические исследования, основанные на фактических данных, и хорошо спланированные клинические испытания в конечном итоге дадут ответы на некоторые из этих вопросов.