Классические системы редактирования генов специфически связывают целевые геномные последовательности и вносят двунитевые разрывы ДНК с помощью одной из четырех основных эндонуклеаз: нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), нуклеазы, подобной эффектору активатора транскрипции (TALEN), мегануклеазы или кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/CRISPR-ассоциированных (Cas) белков. Системы CRISPR/Cas стали доминировать в области редактирования генов благодаря простоте использования и высокой эффективности редактирования [17]. Эти системы используют направляющие РНК для придания специфичности мишени и белки Cas (из бактерий, таких как Streptococcus pyogenes - SpCas9) для создания двунитевых разрывов ДНК.

Редактирование генов с помощью системы CRISPR/Cas приводит к двунитевым разрывам ДНК, которые восстанавливаются посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологично направленной репарации (HDR) (рис. 1). NHEJ является основным механизмом восстановления двухцепочечных разрывов ДНК и всегда активен во всех клетках. Этот путь, подверженный ошибкам, может вносить вставки или делеции (indels), которые нарушают работу гена-мишени и преждевременно укорачивают последующий белок. Нарушение генов посредством NHEJ является высокоэффективным, но в то же время очень вариабельным, поскольку каждая обработанная клетка приобретает различные indels. Обычно вставляется или удаляется только пара пар оснований, но возможны делеции в тысяч пар оснований, хромосомные транслокации и даже фрагментации хромосом [18,19]. Этот подход может быть использован для создания полезных гипоморфных моделей, где колонии или эмбрионы, полученные из одной клетки, могут быть отсортированы на контрольные (не отредактированные), гетерозиготные или гомозиготные с образованием indels [20].



Fig. 1. Gene editing strategies to treat dyslipidemias. Lipid nanoparticles (LNPs) or viral vectors can be used to deliver nucleases, modified Cas9, or dead Cas9 fusion proteins. Techniques relying on DNA double-strand breaks can be repaired via non-homologous end joining (NHEJ) to introduce insertions and deletions (indels) which disrupt gene function, or homology-directed repair (HDR) which uses template DNA to restore gene function. Newer techniques rely on DNA single-strand breaks to alter single nucleotides (base editing) or introduce targeted indels or base conversions (prime editing). Fusion proteins can perform epigenetic modifications without breaking DNA strands. Knockdown strategies have been used to decrease PCSK9, ANGPTL3, APOC3, and LPA expression for therapeutic lipid lowering. Restoration of LDLR has also been explored for therapeutic lipid lowering. These approaches are being developed for the treatment of HoFH (homozygous familial hypercholesterolemia) and other rare monogenic diseases. In the future, gene editing approaches may be expanded to the treatment of refractory dyslipidemia and high risk patients with common dyslipidemia. Figure created with Biorender.com. ANGPTL3, Angiopoietin-like 3; APOC2, apolipoprotein C2; APOC3, apolipoprotein C3; CAS, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated; HDR, homology-directed repair; HoFH, homozygous familial hypercholesterolemia; indel, insertions or deletions; LCAT, lecithin-cholesterol acyltransferase; LDLR, low density lipoprotein receptor; LNP, lipid nanoparticle; LPA, lipoprotein(a); MTTP, microsomal triglyceride transfer protein; NHEJ, non-homologous end joining; PCSK9, proprotein convertase subtilisin/kexin type 9.

Нарушение генов CRISPR/Cas было использовано для создания новых клеточных и животных моделей для исследований липидов и атеросклероза. Jarrett et al. пытались смоделировать атеросклероз, используя AAV-CRISPR/Cas9 для разрушения печеночного рецептора липопротеинов низкой плотности (Ldlr) у взрослых мышей [21]. Эти мыши продемонстрировали тяжелую гиперхолестеринемию и развили атеросклеротические поражения в аорте, что делает нарушение гена ценной альтернативой нокауту зародышевого Ldlr. Кроме того, разрушения генов с помощью CRISPR/Cas также использовалось в беспристрастном скрининге. Emmer et al. провели геномный CRISPR-скрининг в клетках Huh7 и выявили более 100 положительных и 50 отрицательных регуляторов потребления LDL клетками, что подчеркивает эффективность этого метода для биологических открытий [22].

HDR встречается реже и ограничивается делящимися клетками в фазах S и G2 клеточного цикла. Этот более точный путь восстанавливает двухцепочечные разрывы ДНК с использованием шаблона ДНК, что позволяет исправить генетическую мутацию, но также снижает эффективность. Zhao et al. использовали CRISPR/SpCas9 HDR для нокаута преждевременной усеченной мутации в гене Ldlr в оплодотворенных мышиных яйцеклетках [23]. После высокожирной диеты у мышей наблюдалось повышение уровня общего холестерина, общих триглицеридов (TG) и LDL-C , а также атеросклеротические поражения аорты, что имитировало клинические особенности семейной гиперхолестеринемии. Однако, поскольку HDR в основном ограничивается пролиферирующими клетками, его полезность в тканях, имеющих центральное значение для дислипидемии (т.е. гепатоциты, адипоциты, кардиомиоциты), остается неясной. В связи с этим исследователи лечили неонатальных мышей, чтобы максимизировать терапевтический эффект HDR, но все же добились менее 10% редактирования [23]. Более того, необходимый шаблон для репарации ДНК может осложнить доставку, особенно в вирусных векторах с ограниченной грузоподъемностью.

Хотя направляющие РНК CRISPR/Cas предназначены для нацеливания на конкретные геномные последовательности, механизмы редактирования генов могут взаимодействовать с участками, которые являются несовершенными, потенциально внося вне-целевые indels в гены-супрессоры опухолей или онкогены. Кроме того, при редактировании генов с использованием двухцепочечных разрывов ДНК наблюдалась аберрантная вставка вирусной или Cas ДНК [21,24]. Таким образом, непредсказуемость indels и возможность хромосомных аномалий и онкогенеза представляют собой серьезные ограничения для их клинического использования.

Достижения в области систем редактирования генов усовершенствовали эти инструменты, превратив их из непредсказуемых биологических ножниц в более точные пинцеты. Новые методы сохранили характерную способность определять и связывать конкретные целевые последовательности, но расширили их вторую функциональность. Никазы Cas9 (модифицированные нуклеазы, которые разрезают только целевую нить ДНК) могут использоваться в паре для создания точных двухцепочечных разрывов ДНК с повышенной точностью и уменьшением внецелевых эффектов [25,26]. Никазы также можно использовать в паре с редакторами оснований или обратными транскриптазами (см. следующие разделы). Также было показано, что более короткие направляющие РНК и другие разработанные высокоспецифичные Cas-нуклеазы улучшают специфичность [27,28]. Наконец, каталитически неактивные белки Cas9 были использованы в таких областях, как редактирование эпигенома [29,30].

Никазы или неактивные белки Cas могут быть объединены с деаминазами одноцепочечной ДНК для получения редакторов оснований цитозина или аденозина [31,32]. Хотя редактирование оснований ограничено переходными мутациями и ограничено требованиями к последовательности сайта-мишени (предпочтения последовательности Cas9 PAM) [33], эти редакторы набирают популярность, поскольку они модифицируют отдельные нуклеотиды без образования двунитевых разрывов ДНК. Эта ключевая характеристика снижает вероятность серьезных внецелевых мутаций [34]. Редакторы оснований могут точно вводить нонсенс-мутации, которые преждевременно укорачивают белок, или миссенс-мутации, которые нарушают функцию белка. Эти редакторы могут также "исправлять" патогенные варианты, изменяя исходную мутацию или используя колебания генетического кода для изменения интересующего кодона (см. Chadwick and Musunuru [35]).

При прайм-редактировании никаза Cas9 сливается с ферментом обратной транскриптазы, который использует РНК-шаблон для введения новой ДНК [36]. Эта единая система работает без двухцепочечных разрывов ДНК или шаблона донорской ДНК и может точно вводить любые точечные мутации или indels в пределах большого окна редактирования [36]. In vitro прайм-редактирование применялось для исправления нескольких генетических причин заболеваний (каждая со своими требованиями к причинному гену) в клеточных линиях человека [36]. Хотя эта технология еще не была широко протестирована в моделях in vivo, теоретически она может быть использована для исправления большого количества мутаций, включая делеции, дупликации и инверсии, что дает возможность исправления большинства вариантов, вызывающих заболевания. Более того, направляющая РНК для prime editing guide (peg)RNA может быть создана для нацеливания на область "горячей точки" данного гена и использоваться для исправления нескольких вариантов, расположенных в непосредственной близости. Возможность "исправления" патогенных мутаций помимо редактирования одного основания и с большей эффективностью, чем HDR, значительно расширяет доступные последовательности мишени и терапевтические подходы (обзор Scholefield и Harrison [37]).

Dead Cas9 могут доставлять ДНК-метилтрансферазы или ацетилтрансферазы для редактирования эпигенома и изменения экспрессии генов [29,30]. Этот подход полностью обходит необходимость изменения последовательностей ДНК. Вместо этого эпигенетическое редактирование изменяет способ представления ДНК или гистоновых белков с взаимодействующими белками и может вызывать более тонкие изменения по сравнению с подходами полной (де)активации генов. Возникающие в результате эпигенетические изменения могут ослабевать (в течение нескольких месяцев) по мере экспрессии самого редактора и могут потребовать многократного применения для достижения устойчивого эффекта [38]. Наше ограниченное понимание того, как эпигенетические модификации могут влиять на проявления заболеваний, ограничивает текущее использование эпигенетического редактирования только фундаментальной наукой. Однако, поскольку этот подход не изменяет последовательность ДНК и его эффект может быть преходящим, редактирование эпигенома может иметь преимущество для лечения некоторых заболеваний, таких как рак.

Вставка 1 Как создать желаемые редактирования генов Нарушение работы генов: Классический двунитевой разрыв ДНК с образованием инделя NHEJ Редактирование оснований или редактирование праймера для введения преждевременного стоп-кодона Восстановление гена: Гомологически-направленная репарация Редактирование оснований или праймовое редактирование для исправления патогенной мутации оснований Прайм-редактирование для восстановления патогенного сегмента гена Модификация экспрессии генов Эпигенетическое редактирование для повышения или понижения активности генов

Значительные успехи были достигнуты в разработке методов доставки, которые являются ткане- и клеточно-специфичными и могут быть безопасно и эффективно использованы у людей.

Врожденные и адаптивные клеточные иммунные реакции на Cas-нуклеазы или вирусные векторы наблюдались как в животных моделях [39,40], так и у людей [41,42]. Последствия этих результатов, а также то, снижают ли они общую эффективность или влияют на безопасность у людей, остаются неясными. В мышиной модели ранее существовавший иммунитет против Cas9 был связан с повышенным ответом Т-клеток и потерей гепатоцитов, отредактированных генами [43]. Таким образом, важно разработать стратегии доставки, которые максимизируют эффективность доставки, ограничивая при этом иммунный ответ.

Системы CRISPR/Cas могут быть доставлены в виде ДНК, мРНК или белка. Доставка компонентов редактирования генов в виде ДНК приводит к длительной экспрессии, что может повысить эффективность. Однако длительная или избыточная экспрессия белков Cas ассоциируется с увеличением внецелевого редактирования [44,45]. Кроме того, длительное присутствие нуклеазы может способствовать иммунному ответу, хотя инженерные системы CRISPR/Cas9 могут предложить ценный подход к ограничению такого рода реакций [42]. Доставка CRISPR/Cas в виде мРНК снижает риск интеграции вектора и ограничивает экспрессию нуклеазы, что способствовало успеху двух недавних исследований с использованием этого подхода у не-человекообразных приматов [46,47]. Доставка белков Cas также является транзиторной и может ограничить риск внецелевого редактирования.

Грузы для редактирования генов могут быть доставлены с помощью физических методов, вирусных векторов и невирусных наночастиц (обзор сделан Taha et al. [48]). Физическая доставка (т.е. микроинъекция, электропорация или генная пушка) наиболее подходит для редактирования генов in vitro (например, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, iPSC [49]) и ex vivo (например, первичные клетки [50]). Вирусные векторы, в частности AAV, популярны благодаря своей простоте, использованию в текущих испытаниях по переносу генов и успеху в терапии переноса генов, одобренной FDA. Несколько серотипов AAV легко инфицируют печень - орган, представляющий интерес для лечения дислипидемий [51]. Однако векторы на основе AAV имеют некоторые ограничения. Среди них - ограниченная грузоподъемность вируса (всего 4,7 кб, тогда как только SpCas9 составляет ~4 кб) [9] и, что важно для их использования у людей, это гуморальные и клеточные иммунные реакции [52]. Образование нейтрализующих антител против капсида AAV ограничивает повторное введение, а опосредованная Т-клетками цитотоксичность при таргетной терапии печени приводит к преходящему повышению трансаминаз, которое, однако, реагирует на лечение стероидами. Поскольку редактирование генов вносит постоянные изменения в ДНК после однократного введения, оно может обойти необходимость многократного введения AAV. Кроме того, были разработаны и отредактированы с аналогичной эффективностью более мелкие ортологи Cas, которые устраняют ограничениям по размеру AAV [53]. AAV остаются основным средством доставки для доказательных экспериментов на животных, даже если профили безопасности и эффективности все еще оцениваются на людях.

Невирусные наночастицы набирают популярность благодаря своей биоразлагаемой природе, безопасности и широким возможностям доставки ДНК, мРНК и белков Cas9 [46,47,54,55]. Эти наночастицы эндоцитируются и высвобождают свой груз внутриклеточно. LNPs могут быть сконструированы для повышения иммуносовместимости и предсказуемой и специфической доставки груза в целевые ткани после внутривенного введения [56]. Добавление лиганда N-ацетилгалактозамина (GalNAc) может увеличить доставку в гепатоциты и обойти стандартное поглощение LNPs с помощью LDLR [57]. Это усовершенствование может улучшить доставку LNP у пациентов с гомозиготной семейной гиперхолестеринемией и недавно было протестировано на не-человекообразных приматах с нокаутом LDLR дикого типа [58]. LNPs были исследованы в клинике в качестве средств доставки для лечения рака, вирусных инфекций и генетических заболеваний. Более того, их использование в нескольких стратегиях вакцины COVID-19 на основе мРНК продемонстрировало простоту повторного введения и благоприятные профили безопасности [59,60]. По этим причинам LNPs быстро набирают популярность как наиболее универсальное средство доставки.

Вставка 2 Как доставить оборудование для редактирования генов Физическая доставка (электропорация или генная пушка) Ограниченное применение in vitro и ex vivo. Адено-ассоциированные вирусы Легко инфицируют орган-мишень (например, печень) Ограниченная грузоподъемность Связаны с реакциями иммуногенности Повторное дозирование ограничено образованием нейтрализующих антител. Липидные наночастицы Большая грузоподъемность Более благоприятный профиль иммуногенности по сравнению с вирусными векторами Возможность повторного дозирования Переходная доставка Ограниченное биораспределение - Добавление таргетных лигандов для увеличения доставки в целевой орган (например, GalNAc для доставки в гепатоциты).

Инструменты редактирования генов могут быть использованы для точного восстановления или нарушения работы гена (например, пропуск экзонов или введение нонсенс или сплайс-сайтовых мутаций), и дислипидемии находятся на переднем крае разработки терапии с использованием этих подходов. В то время как применение генной репарации ограничено лечением моногенных заболеваний, потенциальное применение генной дезадаптации более широко, включая распространенные формы дислипидемии. Несколько доклинических исследований, направленных на гены, влияющие на LDL-C, хорошо известный и модифицируемый причинный фактор риска [61] и/или триглицериды, еще один независимый указатель риска сердечно-сосудистых заболеваний [62], показали многообещающие результаты. Помимо этих целей, важную роль в выявлении новых целей с соответствующими фенотипическими результатами у пациентов играют исследования секвенирования человека и биобанки, связанные с электронными медицинскими картами. Эти вычислительные подходы также дают некоторое представление о безопасности и переносимости желаемой мутации, поскольку они получены от реальных людей. В будущем мишени для лечения дислипидемии также могут быть объединены в персонализированные коктейли для редактирования генов.

Патогенные варианты гена, кодирующего LDLR, являются основной причиной семейной гиперхолестеринемии и ее редкой формы - гомозиготной семейной гиперхолестеринемии. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последнее десятилетие, варианты лечения для многих из этих пациентов все еще остаются неоптимальными. Подходы редактирования генов могут предложить долгосрочное решение, если будет разработано безопасное и эффективное лечение. В весомом исследовании фибробласты кожи с семейной гиперхолестеринемией были получены от пациента, гомозиготного по делеции трех пар оснований в LDLR (Таблица 2). Полученные из фибробластов iPSCs были обработаны никазами CRISPR/SpCas9 и ремонтным шаблоном [63]. 83% обогащенных клонов (дважды положительных по нуклеазе и направляющим РНК) продемонстрировали коррекцию обоих аллелей и дифференцировались в гепатоцитоподобные клетки. Исправленные клетки экспрессировали белок LDLR и интернализировали LDL. Отредактированные iPSCs выгодны тем, что их можно скринировать (обогащать для редактирования определенной мишени и снижать активность вне мишени), селективно расширять и дифференцировать для использования в аутологичном замещении клеток. Кроме того, они обходят проблемы иммуногенности при доставке и экспрессии нуклеазы. Оценка поглощения, долговечности и эффективности этих гепатоцитоподобных клеток in vivo будет иметь решающее значение для продвижения этого подхода.

Table 2. Summary of gene editing approaches to treat dyslipidemias.

Zhao et al.. использовали CRISPR/SpCas9 для создания новой мышиной модели атеросклероза, экспрессирующей мутацию преждевременного укорочения Ldlr [23]. Этот мутант нарушал экспрессию белка LDLR в печени и приводил к развитию атеросклероза при кормлении высокожирной диетой. Для лечения заболевания новорожденным мышам вводили двойные AAVs, доставляющие нуклеазу SpCas в одной конструкции и направляющую РНК с донорской ДНК в другой. Как и ожидалось, HDR-опосредованная коррекция мутации была низкой, около 6,7%, но смогла восстановить белок LDLR до 18% по сравнению с мышами дикого типа. Мыши с частично восстановленным белком LDLR продемонстрировали снижение общего холестерина на ~65% и были защищены от образования атеросклеротических бляшек. Хотя этого оказалось недостаточно для нормализации гиперхолестеринемии, вероятно, частичное восстановление активности LDLR у пациентов приведет к увеличению ответа на лечение, снижающее уровень липидов. Несмотря на скромное редактирование, отсутствие наблюдаемого внецелевого мутагенеза поддерживает дальнейшее развитие этого подхода. Однако, как упоминалось выше, высокоточное HDR-опосредованное восстановление происходит в делящихся клетках в фазах S и G2 клеточного цикла, с ограниченной применимостью в пост-митотических клетках. Редактирование генов во время эмбриогенеза, хотя и является потенциально эффективным, может вызвать этические проблемы и проблемы безопасности, которые должны быть полностью решены.

Jarrett et al. использовали AAV для одновременной доставки направляющих РНК, нацеленных на Ldlr и Apob, в Cas9-трансгенных мышей [64]. Этот творческий подход позволил изучить терапевтическое разрушение гена Apob, который в других случаях является эмбрионально летальным [65]. Совместное нарушение Apob снизило уровень холестерина в плазме, подавило выработку печеночных LDL и смягчило атеросклеротическое заболевание, наблюдавшееся при нарушении только Ldlr. Редактирование Ldlr достигло 54% и не имело существенных различий между группами, получавшими одну или две направляющие РНК. Редактирование Apob достигло поразительных 74%. Однако, несмотря на высокую эффективность редактирования, этот подход вряд ли может быть применен у людей; ингибирование APOB связано с увеличением жира в печени и неизвестными долгосрочными последствиями [66]. Кроме того, наблюдался довольно высокий уровень внецелевой активности: выше фона мутагенез в одном интронном сайте, образование indels в контрольных направляющих группах "stuffer sequence" и небольшие вставки в последовательность вектора (также наблюдаемые при других подходах с двухцепочечным разрывом ДНК в AAV). Эта вне-целевая активность может быть связана с трансгенной мышиной моделью Cas9 и может быть ограничена при преходящей экспрессии нуклеазы. Во всяком случае, подход двойного таргетинга позволяет лучше понять биологию Apob и предоставляет убедительные данные для одновременного таргетинга двух генов. Эти многообещающие результаты поддерживают идею мультиплексирования других генов-мишеней.

Несмотря на важность этих доказательных исследований, более 2000 известных патогенных и возможно патогенных вариантов LDLR [67] делают разработку и тестирование безопасности и эффективности персонализированных стратегий редактирования генов (при существующих технических и нормативных препятствиях) сложной задачей. Хотя эти соображения могут быть смягчены путем дальнейшего развития методов редактирования праймеров, путем разрушения другого гена, известного своим влиянием на уровень LDL-C (например, PCSK9 или Angiopoietin-like 3, ANGPTL3), может стать жизнеспособным альтернативным решением [68-73].

Хотя данных пока нет, другие трудно поддающиеся лечению моногенные дислипидемии с хорошо установленными генетическими основами и неудовлетворенными потребностями могут быть в конечном итоге подвергнуты лечению с помощью редактирования оснований или праймеров. Подобно стратегиям таргетинга LDLR, пациенты с аутосомно-рецессивной гиперхолестеринемией (LDLRAP1), sitosterolemia (ABCG8/G5), синдромом семейной хиломикронемии (APOC2, APOA5, LMF1, LPL, GPIHBP1), дефицитом LCAT или abetalipoproteinemia (MTTP) нуждаются в восстановлении генов [74]. Учитывая диапазон причинных мутаций, приоритетными, скорее всего, будут основательные и относительно более распространенные варианты в пределах каждого из этих генов или генные "горячие точки" с высокой концентрацией мутаций. Дальнейшее развитие прайм-редактирования расширит список патогенных вариантов, подлежащих исправлению.

Наиболее успешные доклинические стратегии редактирования генов дислипидемии направлены на создание нулевого аллеля (формирование indel или введение преждевременного стоп-кодона). Таким образом, разумно предположить, что редактирование оснований может быть эффективным в лечении чрезвычайно повышенного уровня Lp(a) . Уровень Lp(a) признан причинно связанным с атеросклеротическими сердечно-сосудистыми заболеваниями и стенозом аортального клапана [75]. Его уровень в основном генетически определяется присутствующим гаплотипом LPA. В настоящее время проводится или недавно завершилось несколько клинических испытаний с использованием анти-смысловых олигонуклеотидов или siRNA против гена LPA [76,77]. Если эти испытания и исследования результатов будут успешными, они обеспечат прочную основу для разработки подхода к редактированию оснований.

Множество генетических исследований человека используют PCSK9 в качестве терапевтической мишени. Мутации с потерей функции в PCSK9 связаны со снижением уровня LDL-C и риска ишемической болезни сердца и не имеют явных негативных последствий для здоровья [68-70]. Носители этих вариантов удобно моделируют последствия терапевтического подавления PCSK9. С этой целью лечение с помощью моноклональных антител, малых интерферирующих РНК и анти-смысловых олигонуклеотидов, нацеленных на мРНК или белок PCSK9, уже одобрено регулирующими органами, такими как FDA и EMA, или находится в стадии разработки [78-81]. Редактирование генов PCSK9 в качестве метода лечения гиперхолестеринемии было недавно подробно рассмотрено Musunuru et al. [82,83]. Мы рассмотрим здесь некоторые из этих исследований по редактированию генов с нашей собственной точки зрения.

Стратегии редактирования генов, нацеленные на PCSK9, получили распространение после многообещающих результатов in vivo на мышах. В первых исследованиях использовался аденовирус для доставки CRISPR/SpCas9 и направляющей РНК для разрушения мышиного печеночного Pcsk9 [84]. В течение нескольких дней опосредованный NHEJ-мутагенез Pcsk9 превысил 50%, белок плазмы снизился на 90%, а холестерин в плазме снизился на 35-40%. Более того, не было обнаружено никаких признаков вне-целевого мутагенеза в 10 выбранных участках. Независимая и высокочувствительная оценка вне-целевого редактирования с использованием аналогичного аденовирусного метода редактирования генов также не выявила мутагенеза в более чем 180 сайтах-кандидатах [85]. Аналогичные эффекты редактирования генов были также обнаружены в модели химерной печени гуманизированных мышей [86].

Хотя аденовирусные векторы первоначально использовались из-за их большей грузоподъемности, идентификация меньших Cas белков и прогресс в дизайне LNP позволили проводить исследования с использованием более клинически благоприятных методов доставки. Редактирование гена Pcsk9 у мышей дикого типа с помощью AAV, доставленного Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9, на 1 kb меньше, чем SpCas9), достигло 40-50%, снижение белка PSCK9 в плазме около 95% и снижение холестерина в плазме около 40%, продемонстрировав, что редактирование гена SaCas9 сравнимо с "классическим" редактированием гена SpCas9 [53]. LNPs были также успешно использованы для доставки мРНК SpCas9 в паре с химически модифицированными направляющими РНК, нацеленными на Pcsk9 [87]. Эти модификации повысили стабильность, не ингибируя функцию оттачивания направляющей РНК или взаимодействие Cas9. Действительно, авторы сообщили о беспрецедентной 80% эффективности редактирования генов в печени, о необнаруживаемых уровнях циркулирующего белка PCSK9 и снижении уровня холестерина на 35-40% у мышей дикого типа [87].

Инструменты редактирования оснований также использовались для воздействия на PCSK9. В первых исследованиях использовался редактор цитозиновых оснований BE3 и направляющая РНК, нацеленная на мышиный Pcsk9, для специфического введения нонсенс-мутаций у мышей, в результате чего уровень белка PCSK9 в плазме снизился вдвое [88]. Хотя уровень холестерина в плазме снизился только на 30 %, что несколько меньше, чем наблюдалось в стратегиях с NHEJ-опосредованным разрушением генов, такое снижение все же обеспечивает терапевтический эффект и позволяет избежать рисков, связанных с двухцепочечными разрывами ДНК. Однако большой размер редактора оснований в сочетании с направляющей РНК потребовал от авторов использовать аденовирусный вектор. В более поздних работах были разработаны расщепленные редакторы оснований, которые доставляются в двойных AAV, а затем восстанавливаются in vivo [89]. Используя этот более клинически благоприятный вектор, авторы сообщили об эффективности редактирования Pcsk9 в 20-25% и 38% редактирования в печени за все время исследований. Такой эффективности может быть достаточно для целей дислипидемии. Независимо от подходов, эти исследования NHEJ и редактирования оснований продемонстрировали, что генетическое нарушение Pcsk9 осуществимо и приводит к значительному снижению уровня белка PCSK9 и LDL-C. Недавние исследования на не-человекообразных приматах еще больше сократили разрыв на пути к клиническим испытаниям. С помощью AAV, доставляющей мегануклеазу, нацеленную на консервативную последовательность в PCSK9, у макак-резус удалось добиться 64% редактирования, 84% снижения циркулирующего белка PSCK9 и 60% снижения уровня LDL-C в плазме при самой высокой дозе [24]. Несмотря на эти многообещающие результаты, данный подход привел к легкому повышению уровня трансаминаз в крови у всех обезьян и к более высокой частоте внецелевого редактирования. Инженерная мегануклеаза второго поколения привела к снижению циркулирующего белка PCSK9 более чем на 50%, к снижению уровня LDL-C более чем на 30%, значительному снижению вне-целевого расщепления, но к такому же повышению уровня трансаминаз в крови [24]. Примечательно, что большинство инсерций размером более 15 п.н. в местах двунитевого разрыва ДНК в PCSK9 содержали последовательность вектора AAV. Также были отмечены вне-целевые сайты, в основном в интронных или межгенных областях. У всех леченных не-человекообразных приматов снижение уровня белка PCSK9 и LDL-C сохранялось в течение трех лет без каких-либо негативных изменений в гистопатологии печени после первоначального повышения трансаминаз, что частично объясняется иммунным ответом на преходящую экспрессию мегануклеазы, доставленной AAV [40]. Повышенная специфичность нуклеазы in vivo, определяемая по снижению вне-целевой активности, наблюдалась при использовании самонацеливающегося вектора и более короткого промотора [90]. Используя LNPs в качестве альтернативного средства доставки и метод редактирования оснований, Rothgangl et al. продемонстрировали редактирование в среднем на уровне 26%, снижение циркулирующего белка PCSK9 на 32% и снижение уровня LDL-C на 14% [46]. мРНК, кодирующая редактор оснований, быстро очищалась, что, вероятно, способствовало отсутствию наблюдаемой внецелевой активности, хотя можно было бы провести более надежную оценку. Через две недели подгруппа не-человекообразных приматов была обследована во второй раз, чтобы определить, может ли эффективность редактирования увеличиться при повторном лечении [46]. Однако дальнейшего увеличения эффективности редактирования не наблюдалось, что, вероятно, связано с иммунным ответом на сам редактор оснований после первичного лечения. В группах с повторными дозами были обнаружены антитела к Cas9 и транзиторно повысились трансаминазы крови. Состав LNP был оценен на предмет специфичности для печени путем анализа целевого редактирования PCSK9 в девяти органах. В то время как в восьми органах наблюдалось редактирование менее 1%, в селезенке наблюдалось редактирование от 6% до 12% в зависимости от количества доз. Ограниченные временные рамки исследования (29 дней) не позволили провести оценку долгосрочной безопасности и стойкости.

LNPs также использовались Musunuru et al. для доставки редактора оснований CRISPR для нокдауна печеночного PCSK9 у циномолгусовых обезьян [47]. Краткосрочные двухнедельные исследования продемонстрировали более 50% редактирования PCSK9, 81% снижение белка PCSK9 и 65% снижение уровня LDL-C. Использование редактора оснований нового поколения может объяснить более высокую эффективность редактирования по сравнению с редактором, использованным Rothgangl и др. [46]. Несмотря на то, что большая часть редактирования приходилась на печень, как и в случае с Rothgangl, некоторое редактирование наблюдалось в селезенке и надпочечниках. Долгосрочные исследования (8 месяцев) при более высокой дозе продемонстрировали 66% редактирование основания, 90% снижение циркулирующего PCSK9 и 60% снижение уровня LDL-C. Эти результаты отражают снижение уровня LDL-C на ~50%, о котором сообщалось в недавнем мета-анализе доступных в настоящее время методов лечения, направленных на PCSK9 [91]. У обеих когорт не-человекообразных приматов вскоре после приема препарата наблюдалось умеренное повышение уровня трансаминаз в крови (приписываемое LNPs), которое было устранено в течение двух недель. Внецелевой анализ в обработанных LNPs первичных гепатоцитах обезьян-циномольгусов выявил активность в одном участке, который имеет минимальную гомологию с геномом человека. В прямых образцах печени обезьян, обработанных LNPs, при различных дозах наблюдалось менее 1% или полное отсутствие вне-целевого редактирования. Когда терапия была применена к человеческим гепатоцитам, редактирование также было ограничено PCSK9 [47]. Эти стратегии редактирования на основе LNP у не-человекообразных приматов, по-видимому, вызывают лучший профиль специфичности по сравнению с подходом редактирования генов с помощью AAV. Захватывающим является тот факт, что только что началась фаза 1b исследования безопасности препарата для редактирования оснований, нацеленного на PCSK9, у пациентов с гетерозиготной семейной гиперхолестеринемией и сердечно-сосудистыми заболеваниями (NCT05398029). Если результаты, наблюдаемые в исследованиях на не-человекообразных приматах, приведут к аналогичным результатам у людей, использование редактирования оснований для воздействия на PCSK9 может привести к снижению уровня холестерина, сравнимому с тем, который достигается при использовании имеющихся в настоящее время моноклональных антител к PCSK9, при этом преимущество заключается в однократном введении препарата.

ANGPTL3 - еще одна привлекательная мишень для снижения уровня липидов. Как и в случае с PCSK9, люди с мутациями потери функции в ANGPTL3 демонстрируют снижение уровня липидов в плазме и защиту от ишемической болезни сердца без каких-либо явных побочных эффектов [71-73]. Evinacumab, моноклональные антитела, нацеленные на белок ANGPTL3, уже одобрен для лечения гомозиготной семейной гиперхолестеринемии. Ингибирование ANGPTL3 заметно снижает уровень LDL-C у этих пациентов по LDLR-независимому механизму [92-94], что делает ANGPTL3 идеальным кандидатом для лечения этой редкой формы гиперхолестеринемии. Более того, моноклональные антитела и siRNA, нацеленные на мРНК ANGPTL3, также разрабатываются для лечения гипертриглицеридемии (NCT04832971, NCT04863014) [95].

Оптимизированная система LNP, доставляющая мРНК CRISPR/SpCas9 и направляющую РНК, нацеленную на Angptl3, обеспечила эффективность редактирования около 38%, снижение циркулирующего белка ANGPTL3 на 65%, снижение уровня LDL-C на 56% и снижение уровня TG на 29% [96]. Эти результаты сохранялись в течение 100 дней после инъекции, при этом не было обнаружено никаких внецелевых эффектов в девяти наиболее подходящих местах. Используя аденовирус, кодирующий редактор оснований и направляющую РНК, нацеленную на Angptl3, Chadwick et al. продемонстрировали 35% редактирование, 49% снижение белка ANGPTL3, 31% снижение TG и 19% снижение холестерина у мышей дикого типа в течение одной недели [97]. Далее они проверили эффект доставки редактора оснований со смесью направляющих РНК - половина нацелена на Angptl3, а половина на Pcsk9. В то время как нацеливание на один ген и комбинированное нацеливание генов приводило к сходному снижению уровня холестерина в плазме (~20%), нацеливание только на Angptl3 снижало уровень TG сильнее, чем нацеливание на Pcsk9 отдельно или в комбинации. Неясно, способствовало ли уменьшение дозы каждой направляющей РНК вдвое отсутствию аддитивного эффекта на липиды. Наконец, они проверили эффект редактирования оснований Angptl3 на фоне нокаута Ldlr, в модели гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, и обнаружили снижение уровня триглицеридов и холестерина на ~50% через две недели после введения. Эффект снижения уровня липидов и отсутствие редактирования вне мишени, по-видимому, также подтверждается предварительными результатами на не-человекообразных приматах [98].

Некоторые предостережения относительно использования внутриклеточного ингибирования ANGPTL3 вытекают из данных, полученных в ходе клинического испытания 2b фазы с использованием Vupanorsen, анти-смыслового олигонуклеотида, нацеленного на ANGPTL3, при котором было зарегистрировано повышение уровня печеночных ферментов и увеличение количества жира в печени [99]. Хотя эти побочные явления могут быть вызваны нецелевым действием препарата, нельзя исключать и ANGPTL3-зависимый эффект. Таким образом, хотя разрушение Angptl3 становится еще одной перспективной мишенью для лечения повышенного уровня LDL-C и триглицеридов, крайне важно сначала решить эти проблемы безопасности.

7.3. Таргетинг APOC3 Аполипопротеин С3 (APOC3) - еще одна привлекательная мишень для лечения снижения уровня липидов, особенно для лечения гипертриглицеридемии. Естественно возникающие мутации потери функции в APOC3 связаны со снижением уровня триглицеридов и уменьшением риска ишемической болезни сердца [100]. Более того, гомозиготная потеря функции APOC3 у людей улучшает постпрандиальную липемию [101]. CRISPR инактивация ApoC3 у хомяков и кроликов защищает от атеросклероза [102,103]. Хотя эти исследования были направлены только на создание нокаутных моделей для понимания роли ApoC-III в атеросклерозе, они продемонстрировали, что APOC3 является вероятным кандидатом для дальнейшей доклинической оценки.

Постоянный характер изменений ДНК, вызванных редактированием генов, требует тщательной и критической оценки безопасности этой технологии, прежде чем ее можно будет широко использовать для лечения заболеваний человека. В то время как некоторые проблемы безопасности являются общими с другими генно-ориентированными методами лечения (например, неблагоприятные события, связанные с методами доставки или развитием аутоантител, описанные во введении), другие присущи редактированию генов. Среди них - непреднамеренные последствия нарушения работы генов и риск вне-целевого воздействия.

Всесторонняя характеристика фенотипа людей, несущих варианты с потерей функции в генах, предназначенных для разрушения, может быть полезной для оценки эффекта от разрушения этих генов. Действительно, выбор PCSK9 и ANGPTL3 в качестве мишеней редактирования генов для лечения дислипидемий подтверждается очевидным хорошим здоровьем людей с дефицитом PCSK9 [68-70] и ANGPTL3 [71-73]. Оценка вне-целевых рисков остается еще более сложной, поскольку геном человека отличается от генома животных моделей, а также потому, что каждый отдельный человек имеет уникальную генетическую структуру. Кроме того, стандартные подходы для прогнозирования внецелевых мутаций еще не разработаны. В настоящее время используется углубленный анализ in silico, сопровождаемый тестированием на клетках человека (таких как первичные гепатоциты или iPSC-произведенные гепатоциты), как сообщают Musunuru и коллеги [47].

Хотя обзор этических и социальных последствий редактирования генов выходит за рамки данного обзора, важно помнить, что эта тема все еще горячо обсуждается, особенно в контексте редактирования зародышевых и наследуемых генов человека [104]. Текущая скудность информации о безопасности и невозможность с уверенностью исключить отсутствие внецелевых эффектов склоняет к консенсусу, что клиническое использование должно быть ограничено соматическим редактированием генов.

За последние десятилетия методы лечения дислипидемии эволюционировали от небольших молекул, которые нужно принимать ежедневно, моноклональных антител, назначаемых раз в две недели, до препаратов на основе РНК (анти-смысловые олигонуклеотиды и siRNAs), которые нужно принимать раз в несколько месяцев. Подходы редактирования генов стремятся еще больше расширить терапевтическое окно, обещая постоянный эффект. Эти методы эволюционируют от более грубых подходов к двухцепочечному разрыву ДНК к более утонченным подходам к одноцепочечному разрыву ДНК, которые вносят точные изменения.

Эти подходы обещают стать перспективными для лечения редких моногенных заболеваний со значительными неудовлетворенными медицинскими потребностями. Хотя ранние попытки использовать редактирование генов были прекращены из-за недостаточной эффективности (NCT03041324), испытания ранней фазы на пациентах с фенилкетонурией (NCT05222178) и врожденным амаврозом Лебера (NCT03872479) продолжаются. Важно отметить, что недавно опубликованные результаты первого клинического испытания по редактированию генов в печени у пациентов с транстиретиновым амилоидозом выглядят многообещающими [8]; результаты через месяц показали, что одна доза NTLA-2001, терапевтической мРНК CRISPR/Cas9 и направляющей РНК, доставляемой с помощью LNP, значительно снижает уровень транстиретина в крови при небольшом количестве слабых побочных эффектов. Если многообещающие доклинические данные в отношении ANGPTL3 подтвердятся, гомозиготная семейная гиперхолестеринемия может стать первым редким нарушением липидного обмена, которое будет лечиться с помощью этого передового подхода.

Возможно, более интересным является то, что быстрый прогресс в разработке более безопасных инструментов в сочетании с подтвержденными терапевтическими мишенями, такими как PCSK9 и ANGPTL3, может расширить применение редактирования генов у пациентов с редкими заболеваниями на более широкий круг пациентов с рефрактерной дислипидемией и высоким риском атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний. Интерес представляет исследование фазы 1b с использованием технологии редактирования генов для разрушения PCSK9 в печени (таким образом снижая циркулирующий белок PCSK9 и уровень LDL-C ) у пациентов с гетерозиготной семейной гиперхолестеринемией и установленным атеросклеротическим сердечно-сосудистым заболеванием (NCT05398029).

Эти новые стратегии редактирования генов открыли дверь к долгосрочным терапевтическим решениям, которые могут произвести революцию в лечении дислипидемии. Однако, поскольку эти методы лечения приводят к постоянным изменениям в геноме пациента, крайне важно определить острый, промежуточный и долгосрочный профиль безопасности редактирования генов in vivo у людей. Более того, помимо волнения, вызванного этими новыми научными достижениями, дальнейшее развитие таких мощных инструментов должно руководствоваться этическими соображениями и сопровождаться четкими границами, ограничивающими использование соматического редактирования генов.