В конце 2023 года FDA одобрило препарат Casgevy для лечения серповидно-клеточной болезни - это первое разрешение на терапию, в которой используется инструмент редактирования генома - кластеризованные регуляторные межпалиндромные повторы (CRISPR) для специфической инактивации гена человека в качестве лечения генетического заболевания. Хотя генотерапия на основе CRISPR потенциально может лечить несколько генетических заболеваний, опасения по поводу изменений в нецелевых участках задержали ее терапевтическое использование.

David Rueda, биофизик-одиночка из Имперского колледжа Лондона, изучает внецелевую активность CRISPR-ассоциированного белка (Cas) 9, одной из наиболее широко изученных CRISPR-нуклеаз. В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Molecular Cell, он и его команда продемонстрировали, что отрицательно свернутые конформации ДНК усиливают внецелевое действие Cas9.¹ Эти результаты указывают на важные соображения для будущих применений технологии редактирования генома.

На самом деле это очень похоже на то, что можно увидеть в "Звездном пути". Это настоящий тяговый луч, который позволяет нам захватывать объекты в космосе и манипулировать ими". --David Rueda, Имперский колледж Лондона

В основе CRISPR лежат два основных компонента: направляющая РНК (gRNA) из 17-24 нуклеотидов, которая находит целевую последовательность, и нуклеаза Cas, которая делает разрез в этом точном месте. Как правило, для того чтобы Cas9 связала и расщепила целевую последовательность ДНК, необходимо наличие последовательности protospacer adjacent motif (PAM) непосредственно ниже по течению от цели; это обычно обеспечивает редактирование по мишени. Однако и в этом случае система не совершенна.

В предыдущем исследовании Rueda и его команда продемонстрировали, что растяжение ДНК увеличивает активность Cas9 вне мишени.² Далее команда захотела проверить эти результаты в физиологическом контексте: им было интересно посмотреть, как отрицательная суперспираль, или скручивание ДНК, которое происходит во время нормальной транскрипции и репликации, влияет на активность CRISPR Cas9 вне мишени.

Отрицательно свернув линейную нить ДНК, выделенную из бактериофага, команда продемонстрировала, что такая конформация значительно увеличивает связывание Cas9 с нецелевыми участками³.

Matt Newton, соавтор исследования, который в настоящее время является приглашенным ученым в Институте Фрэнсиса Крика, был взволнован, увидев эти эффекты. "Затем мне захотелось узнать, изменит ли это что-нибудь, если вы нацелитесь на настоящую геномную ДНК человека?" - сказал он.

CRISPR Gene Editing: Cas9 and Beyond Read More

Для анализа геномной ДНК человека команда выбрала метод скрининга in vitro - циркуляризацию для регистрации эффектов расщепления путем секвенирования (CIRCLE-seq).⁴ Исследователи фрагментировали и заключали в кольцо ДНК из клеточной линии человека и обработали ее Cas9 и ДНК-гиразой, чтобы вызвать отрицательную суперспиральность in vitro. Активность Cas9 линеаризовала циркулярную ДНК, и команда секвенировала линейные фрагменты, выявляя последовательности, в которых фермент делал разрез. Команда показала, что обработка ДНК-гиразой более чем в два раза увеличивает количество сайтов расщепления вне мишени.

Следующим шагом было подтверждение результатов на человеческих клетках. Команда обработала клетки Cas9 и использовала INDUCE-seq - метод, позволяющий выборочно секвенировать фрагменты с двухцепочечными разрывами ДНК, характерными для расщепления Cas9.⁵ Когда исследователи сравнили последовательности off-target из INDUCE-seq с последовательностями из экспериментов CIRCLE-seq, они обнаружили менее чем 25-процентное совпадение между результатами. Эти данные позволили предположить дополнительные эффекты, связанные с изменением структуры ДНК другими клеточными способами, например транскрипцией. Проверив свою гипотезу, команда обнаружила, что более 70 процентов сайтов off-target совпадают с областями с высокой транскрипционной активностью.

Схема активности Cas9, на которую влияют несовпадение последовательностей и конформация ДНК.

(1) Направляющая РНК (gRNA) и область PAM обычно направляют белок Cas9 к определенной последовательности-мишени для расщепления ДНК (верхняя панель). (2) Несовпадения (выделены оранжевым цветом) между ДНК и гРНК препятствуют связыванию и расщеплению (средняя панель). (3) Измененные конформации ДНК могут обеспечить связывание Cas9 при несовершенном выравнивании последовательностей (нижняя панель). © ЭШЛИ КЭМПСОЛЛ

"Влияние сверхсвертывания ДНК на геномную активность Cas9 относительно интересно и ново", - говорит Shengdar Tsai, молекулярный генетик из Детской исследовательской больницы Святого Иуды, который не участвовал в исследовании, но имеет патенты на разработку технологий секвенирования генома, включая CIRCLE-seq. Он заинтересован в проведении дополнительных исследований, изучающих частоту этих внецелевых участков в клетках и их влияние с помощью более глубокого профилирования. "Понимание геномной активности редакторов - очень важный вопрос, особенно для терапевтического применения", - говорит Tsai,. "Мы действительно хотим знать, что эти редакторы делают в геномах живых клеток".

"Эти результаты могут предоставить дополнительный механизм, с помощью которого в клетках появляются внецелевые разрезы, и, возможно, помогут нам разработать новые системы CRISPR-Cas, которые будут более точными", - сказал Руэда.



Генотоксические эффекты базового и праймерного редактирования

Читать

Newton MD, et al. Negative DNA supercoiling induces genome-wide Cas9 off-target activity. Mol Cell. 2023;83(19):3533-3545

Newton MD, et al. DNA stretching induces Cas9 off-target activity. Nat Struct Mol Biol. 2019;26(2019):185-192

King GA, et al. Supercoiling DNA optically. Proc Natl Acad Sci. 2019;116(53):26534-26539

Tsai SQ, et al. CIRCLE-seq: A highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets. Nat Methods. 2017;14:607-614

Dobbs FM, et al. Precision digital mapping of endogenous and induced genomic DNA breaks by INDUCE-seq. Nat Commun. 2022;13:3989