Согласно последним исследованиям, пропуск экзонов с помощью CRISPR/Cas9 активирует внутреннюю сигнализацию β-катенина и ингибирует иммуноактивирующие цитокины, такие как CCL20 и CXCL2, что помогает подавить иммунное уклонение. Примерно 30 % всех случаев HCC обусловлены мутациями гена TNNB1, но терапия ICI не может быть использована для лечения этого подтипа. Рекомбинантные цитокины также изучаются в качестве иммуностимуляторов у онкологических больных [101], и трансартериальная инфузия кандидатов в иммуноактивирующие цитокины также может быть эффективной [102].

Функциональный нокаут-скрин с использованием библиотек GeCKO выявил гены, участвующие в пролиферации и метастазировании клеток HCC. С помощью sgRNA были предсказаны гены ADAMTSL3 и PTEN, участвующие в пролиферации и метастазировании. ADAMTSL3 участвует в пролиферации и метастазировании HCC, и в будущих исследованиях будут изучены эти гены. Когда ADAMTSL3 удаляется из клеток HCC, они могут пролиферировать. Впервые было обнаружено, что потеря функции ADAMTSL3 в HCC связана с пролиферацией. Наши результаты также демонстрируют, что потеря функции PTEN подавляет инвазию клеток HCC, подтверждая эффективность скрининга in vivo на основе CRISPR, несмотря на то, что потеря функции PTEN приводит к распространению и инвазии опухоли [103].

В первом в своем роде исследовании Song et al. сгенерировали sgRNA, содержащую специфическую последовательность, и использовали CRISPR/Cas9 для создания клеток HCC, экспрессирующих нокаут HBsAg. Как показали результаты исследования in vitro и in vivo, злокачественный потенциал HBV-HCC может быть увеличен с помощью HBsAg за счет механизмов усиления и ослабления функции. IL-6/STAT3 и STAT3 могут опосредовать сигнальные пути HBV-HCC, опосредованные HBsAg. Как было продемонстрировано здесь, технология CRISPR/Cas9 нацелена на ORF HBsAg, тем самым обеспечивая новую терапию HCC, связанную с HBV [104].

На основе модели Saputra и коллег показано, что не синергичные (анти-синергичные или аддитивные) комбинации препаратов более эффективно подавляют распространение резистентных субклонов, чем синергичные, и обеспечивают долгосрочную защиту от резистентности [105].

Было показано, что клетки HCC свиньи, нокаутированные по AXIN1 и/или ARID1A, менее восприимчивы к sorafenib и doxorubicin с помощью CRISPR нокаута. Кроме того, исследование позволяет предположить, что свиньям можно вводить аутологичные клетки для создания генетически адаптированных опухолей. Внутри-печеночная инъекция CRISPR-редактированных клеток позволит создать дополнительные генетически адаптированные модели HCC на основе модели Oncopig. Создание точных моделей HCC свиней станет возможным благодаря редактированию in vivo драйверных генов HCC в гепатоцитах свиней с помощью компонентов CRISPR. В дополнение к этим трансляционным моделям HCC можно будет протестировать инновационную прецизионную медицину и определить эффективные терапевтические средства для лечения часто встречающихся генных мутаций с помощью этих перспективных инструментов [106].

Геномный скрининг CRISPR показал, что экспрессия NCAPG часто предсказывает рецидив опухоли в области неструктурного поддержания хромосом. Хирургическая резекция и трансплантация печени являются лучшими вариантами лечения HCC. На основании AUC 0,80 в двух отдельных наборах данных авторы утверждают, что уровень транскрипта NCAPG и цирроз печени могут быть использованы для отличия ранних рецидивирующих раков от нерецидивирующих опухолей. Уровень белка NCAPG позволяет точно идентифицировать семь из восьми ранних рецидивирующих опухолей. Исследования также показали, что у пациентов с высоким уровнем NCAPG значительно снижаются шансы на безболезненную выживаемость [107].

С помощью CRISPR/Cas9 в клеточных линиях гепатомы человека HLF и SNU449 был нокаутирован тирозинкиназный рецептор Axl. Оценка клеток HLF-Axl-1, HLF-Axl-2, SNU449-Axl-1 и SNU449-Axl-2 была завершена с использованием двух отдельных клонов событий геномного редактирования (HLF-Axl-1, HLF-Axl-2). В результате анализа ELISA в супернатанте не полностью отредактированных клеток SNU449-Axl-1 были обнаружены как общий Axl, так и растворимый Axl. Однако иммуноблоттинг не выявил экспрессии белка Axl. В результате этих экспериментов выяснилось, что геномная гетерогенность может способствовать неполному редактированию с помощью CRISPR/Cas9 в раковых клетках [108].

Клеточные линии человека Huh-7 и HepG2 были обработаны CRISPR/Cas9 для устранения сайтов связывания семейства МТ, и по сравнению с CRL-12461, нормальной клеточной линией печени, клетки Huh-7 и HepG2 генерировали гораздо больше МТ-транскрипции. Более того, после разрушения домена связывания CTCF были обнаружены изменения в уровнях H3K4me3 и H3K9me3 гена MT при сравнении области связывания CTCF с доменом связывания CTCF как в технике захвата хромосомной конформации (3C), так и в технике иммунопреципитации хроматина (ChIP). Изменение локальной геномной организации для регуляции транскрипции генов было исследовано как потенциальный метод лечения заболеваний [109].

Эти исследования демонстрируют, как редактирование генов с помощью CRISPR/Cas9 может быть использовано в экспериментальных моделях для получения специфических, измеримых эффектов против патогенеза HCC. Их работа подчеркивает, что молекулярные характеристики играют критическую роль в определении поведения рака и стратегий лечения, иллюстрируя терапевтический потенциал целевых генетических вмешательств.

HCC поддается лечению с помощью CRISPR/Cas9 как в исследованиях in vitro, так и in vivo. Эти исследования требуют более глубокого понимания потенциальных механизмов и терапевтических мишеней HCC. Для внедрения полученных результатов в клиническую практику необходимо также провести клинические испытания на человеческих образцах. Терапия HCC с помощью CRISPR/Cas9 все еще находится на начальном этапе клинических испытаний. Это зависит от нескольких факторов, включая безопасность и эффективность, механизмы доставки, регуляторные и этические соображения, а также индивидуальные особенности.

CRISPR/Cas9 и гены, связанные с лекарственной устойчивостью В ходе скрининга геномных библиотек CRISPR/Cas9 с использованием трех sgRNA и двух дополнительных sgRNA Wei и др. обнаружили, что PHGDH способствует устойчивости к Sorafenib. Помимо PHGDH, было обнаружено, что AKT1S1, TBL1Y, SKAP2 и AMPD2 также способствуют устойчивости к Sorafenib. Ранее скрининг библиотеки нокдаунов shRNA у мышей также показал, что MAPK вызывает устойчивость HCC к Sorafenib. При введении Sorafenib в клетки HCC инактивация PHGDH приводит к усилению апоптоза. Инактивация PHGDH увеличивает клеточную гибель в клетках HCC [110].

Важнейшим вопросом для исследований HCC является создание моделей рака, устойчивых к Sorafenib. Важную роль в этом процессе играет PHGDH - фермент, отвечающий за биосинтез серина, компонента синтеза нуклеотидов и белков. Метаболизм опухоли часто изменен, и для быстрого деления клеток ей требуется повышенное поступление серина. PHGDH катализирует первый этап синтеза серина, и этот фермент контролирует его поток. Помимо производства серина, он также участвует в репликации ДНК и РНК, что необходимо для пролиферации клеток, поддерживая синтез нуклеотидов. PHGDH подвергается нокауту с помощью технологии CRISPR, нарушая путь синтеза серина. Это приводит к ряду внутриклеточных последствий, включая снижение доступности нуклеотидов, окислительный стресс, повреждение ДНК и нарушение анти-оксидантной защиты, что повышает чувствительность к Sorafenib. Становится очевидным, почему нокаут PHGDH повышает восприимчивость клеток HCC к Sorafenib-индуцированному апоптозу, если связать его роль в выживании и пролиферации клеток со стрессом и ответом на повреждение ДНК [111-113].

Активность CRISPR в клетках гепатомы приводила к избыточной экспрессии генов, которые обеспечивали устойчивость к regorafenib. Клетки гепатомы, в которых мутировал ген HK1, устойчивы к химиотерапевтическому препарату regorafenib. Было замечено, что ингибиторы гликолиза можно сделать более эффективными с помощью фармакологических средств, например, lonidamine, который ресенсибилизирует клетки к regorafenib. FDA еще не одобрило такие ингибиторы. Кроме того, экспрессия HK1 повсеместна, поэтому ингибирование других идентифицированных генов было бы полезным после дальнейшего подтверждения, поскольку маловероятно, что HK1 может быть использован для лечения пациентов, устойчивых к TKI. Оценив уровень экспрессии HK1 или одной из других мишеней, можно будет прогнозировать исход терапии TKI, тем самым устраняя ненужную заболеваемость и затраты, связанные с неадекватными кандидатами [114].

Как часть гликолиза, HK1 имеет решающее значение для преобразования глюкозы в глюкозо-6-фосфат, что является первым шагом. В результате клетки производят энергию и метаболиты, необходимые для различных клеточных функций, особенно тех, которые нуждаются в высокой энергии. Ниже подробно описано, как мутации HK1 могут приводить к резистентности к regorafenib. Раковые клетки в большей степени полагаются на гликолиз для производства энергии, несмотря на аэробные условия, что известно как эффект Варбурга. HK1 играет важную роль в этом процессе. В присутствии regorafenib, который обычно подавляет опухолевую пролиферацию и ангиогенез, мутация в HK1 может изменить активность фермента, в результате чего клетки будут больше вырабатывать энергии и смогут выжить. Раковым клеткам для выживания необходим гликолиз, и многие из них имеют механизмы, позволяющие поддерживать его даже в условиях стресса. Эти клетки могут противостоять воздействию regorafenib, если мутации HK1 сделают их менее зависимыми от метаболических путей, на которые нацелен regorafenib. Regorafenib запускает апоптоз в раковых клетках, чтобы они могли выработать обходной путь к нарушению метаболизма, вызванному лекарством. Чтобы эти клетки выжили, им необходим функционирующий гликолитический путь, который обеспечивает их энергией, необходимой для того, чтобы избежать апоптоза. Избегая обычных путей, ведущих к запрограммированной клеточной смерти, мутантные раковые клетки HK1 могут выработать устойчивость к препарату, если они смогут продолжать эффективно метаболизировать глюкозу. Препарат действует на многочисленные киназы, участвующие в росте и прогрессировании рака. Мутантная форма HK1 может вызывать изменения в клеточных сигнальных путях. Это может привести к тому, что препарат не будет работать так, как нужно, поскольку клетки будут "игнорировать" его действие [115].

Основным препятствием для успешного лечения распространенного рака печени является лекарственная устойчивость к Lenvatinib. В недавнем исследовании с помощью единственного скрининга геномной библиотеки CRISPR/Cas9 был найден ключевой ген, связанный с устойчивостью к Lenvatinib в HCC. Этим геном оказался DUSP4, который в будущем может послужить важным ориентиром для повышения устойчивости к ингибиторам, связанным с тирозинкиназами. У пациентов с HCC, у которых отсутствует DUSP4, Lenvatinib реактивирует ERK и MEK. В экспериментах in vivo успешно использовалась ксенотрансплантационная модель мыши [116].

Когда экспрессия DUSP4 поддерживается на нормальном уровне, он предотвращает чрезмерную пролиферацию и образование опухолей, инактивируя MAPK-путь, включая ERK1/2. При снижении или потере DUSP4 ERK1/2 меньше дефосфорилируется, что приводит к его фосфорилированию и активации. В результате активации ERK гены, участвующие в выживании, росте и пролиферации клеток, могут транскрибироваться в ядро, повышая устойчивость клеток к таким препаратам, как Lenvatinib, оказывающим анти-пролиферативное действие. В раковых опухолях часто повышается уровень нескольких тирозинкиназных рецепторов, и Lenvatinib ингибирует их. Раковые клетки могут выживать и размножаться, запуская эти рецепторы, включая MAPK/ERK-путь. Даже если Lenvatinib ингибирует вышележащие рецепторы при потере DUSP4, путь ERK остается активным или гиперактивным, что сводит на нет его влияние на замедление роста опухоли. Исследователи могут разработать стратегию воздействия на ERK-сигнализацию, если поймут, что потеря DUSP4 приводит к реактивации ERK-сигнализации. Лечение Lenvatinib можно сочетать с дополнительными ингибиторами непосредственно пути ERK1/2 (часто называемыми ингибиторами MEK). Отключая сигналы выживания, на которые полагаются раковые клетки из-за потери DUSP4, такая комбинированная терапия может преодолеть резистентность [117].

В исследовании Chen et al. было обнаружено, что нокаут гена KEAP1 может предотвратить устойчивость Sorafenib к NRF2, и изучался вопрос, может ли ингибитор NRF2 остановить рост HCC в синергии с Sorafenib. Далее они обнаружили, что FGF21 играет решающую роль в регуляции NRF2. В результате связывания FGF21 с NRF2 через его С-концевую часть возникла петля положительной обратной связи, которая уменьшила убиквитинирование NRF2 и стабилизировала белок. В свете этих данных ингибирование FGF21 может быть полезным для управления резистентностью к Sorafenib при HCC [118].

В рамках первого исследования резистентности к Sorafenib были использованы геномные библиотеки транскрипционной активации CRISPR (SAM). По сравнению с предыдущим исследованием по выявлению резистентности к Sorafenib с помощью GeCKO v.2 [119], ученые сделали впечатляющие и разнообразные открытия, объединив данные профилирования экспрессии генов в клетках Huh7 с библиотекой SAM. Согласно результатам исследования, клетки HCC могут развивать устойчивость к Sorafenib в результате действия LRP8. Было обнаружено, что все три sgRNA, нацеленные на LRP8, присутствуют в клетках Huh7 с высоким числом копий. Экспрессия LRP8 в клетках HCC, подвергшихся воздействию Sorafenib, также была значительно повышена. Сверх-экспрессия LRP8 в клетках HCC также ассоциировалась со снижением апоптоза и повышением активности β-катенина [120].

В ходе исследований была получена новая информация, которая помогла прояснить причины возникновения резистентности к Lenvatinib в HCC. Гипометилирование и драйверные мутации, такие как TP53, вызывают повышение регуляции LAPTM5. Lenvatinib и гидроксихлорохин (HCQ) ингибируют образование аутолизосом, что подавляет рост опухоли. Нокаутируя LAPTM5 или вводя HCQ, ингибирование аутофагии может дать многообещающие результаты по преодолению резистентности и улучшению выживаемости пациентов за счет сочетания ингибирования аутофагии с Lenvatinib [121].

Опухоли лечили regorafenib или транспортным средством на основе киномных библиотек CRISPR, из которых были получены Cas9-экспрессирующие клетки HCC для исследований ксенотрансплантации. Согласно анализу последовательностей, опухоли, обработанные regorafenib, содержат на 31 ген больше, чем опухоли, обработанные транспортным средством, включая два паралога LATS2, который является неотъемлемой частью сигнального пути Hippo. Ингибирование YAP или Bcl-xL в клетках HCC, нечувствительных к regorafenib, сделало их чувствительными к regorafenib. По результатам скрининга потери функции CRISPR в HCC, regorafenib эффективен против HCC [122].

Перепрофилирование и выбор наиболее эффективных вариантов лечения путем изучения существующих лекарств и их комбинаций является интригующим. Скрининговое исследование CRISPR/Cas9 показало, что ifenprodil и Sorafenib сочетаются для эффективного лечения HCC. Комбинированная терапия IFEN и SOR может быть эффективной стратегией для раковых клеток, устойчивых к SOR. Эта комбинация может неадекватно подавлять пролиферацию раковых клеток, которые стали устойчивыми к лечению [123].

Как показано в одном из исследований, CRISPR-скрининг может помочь выявить терапевтические мишени для лечения Sorafenib. Экспрессия SGOL1 является прогностическим показателем для лечения Sorafenib с помощью NGS в сочетании с редактированием генома CRISPR/Cas9. Экспрессия SGOL1 в клетках HCC с высокой дифференциальной экспрессией может свидетельствовать о плохом прогнозе. Таким образом, лечение пациентов с HCC Sorafenib и SGOL1 может продлить их жизнь на месяцы или даже годы [119].

По сравнению с контрольными клетками, жизнеспособность клеток HUH-7 повышалась при лечении умеренными дозами Sorafenib или Lenvatinib. Как мы уже сообщали, KEAP1 инактивирован, что имеет важные клинические последствия. KEAP1 стал лучшим геном-кандидатом после проведения процесса, названного Model-Based Analysis of Genome-wide CRISPR/Cas9 Knockout, или сокращенно MAGeCK. При краткосрочном и долгосрочном лечении Sorafenib клетки HCC, разрушенные KEAP1, показали меньшую чувствительность. Клетки, разрушенные KEAP1, демонстрировали меньшее количество ROS, индуцированных Sorafenib, чем клетки дикого типа. Несколько недавних методов лечения HCC, включая regorafenib, также продемонстрировали устойчивость к клеткам, с нарушенным KEAP1 [124].

Недавно появились данные о том, что Sorafenib усиливает терапевтический эффект IQGAP1 и FOXM1 за счет предотвращения важнейших сигнальных путей, таких как PI3K/AKT и MAPK/ERK, путем нокаута IQGAP1 и FOXM1 в сочетании с приемом Sorafenib. Во-вторых, нарушалась работа стволовых клеток рака CD133+, что играет ключевую роль в устойчивости к Sorafenib. Sorafenib и EVs могут быть объединены в будущем противораковом лечении, чтобы улучшить результаты по сравнению с использованием только Sorafenib [125].

В исследовании SNHG9 для изучения его биологической функции использовали CRISPR-dCas9. Они обнаружили, что снижение экспрессии SNHG9 подавляет метастазирование HCC, и изучили молекулярные механизмы, ответственные за это. SNHG9 отвечает за экспрессию генов, опухолевый генез и связывание ДНК-метилтрансфераз, поэтому его нокаут может приводить к деметилированию промотора GSTP1 [126].

Анализ длинной не кодирующей РНК (lncRNA) SNHG9 (Small Nucleolar RNA Host Gene 9) в HCC показывает, что она играет важную роль в прогрессии и метастазировании опухоли [127]. Хорошо известно, что lncRNA играют важнейшую роль в регуляции различных клеточных процессов, включая прогрессию рака. Они могут влиять на транскрипцию, стабильность мРНК или трансляцию, не кодируя белки, и таким образом модулировать экспрессию генов. Технология CRISPR может нарушить прогрессию клеточного цикла путем нокаута SNHG9, возможно, через регуляцию генов, связанных с прогрессией клеточного цикла, что необходимо для пролиферации раковых клеток. Потеря SNHG9 может снизить пролиферацию раковых клеток, уменьшая рост опухоли и возможности метастазирования. Эти процессы имеют решающее значение для метастазирования, позволяя раковым клеткам перемещаться и вторгаться в окружающие ткани и, в конечном итоге, в отдаленные органы. Помимо взаимодействия с белками, участвующими в перестройке цитоскелета и клеточной адгезии, SNHG9 также участвует в перестройке цитоскелета или регулирует их экспрессию [127]. Нокаут SNHG9 может нарушать миграцию и инвазию, снижая способность клеток HCC к метастатическому распространению. Нокаут SNHG9 может непреднамеренно вызывать запрограммированную гибель клеток. Отсутствие SNHG9 устраняет этот ингибитор апоптоза, делая раковые клетки более восприимчивыми к внешним сигналам гибели и противораковым препаратам, что приводит к уменьшению размеров опухоли и метастатического распространения. Экспрессия SNHG9 может быть напрямую связана с генами, связанными с метастазированием. Он может модулировать сигнальные пути, способствующие выживанию клеток в отдаленных тканях, например, матричные металлопротеиназы (MMPs), которые участвуют в ремоделировании тканей и инвазии. Его нокаут нарушает эти процессы, снижая способность раковых клеток к распространению. Раковые клетки должны иметь возможность попасть в кровоток, чтобы распространиться в другие органы, а для этого процесса необходим ангиогенез, который отвечает за формирование новых кровеносных сосудов. Если SNHG9 действует как ингибитор ангиогенеза, его нокаут будет препятствовать васкуляризации, которая поддерживает рост опухоли и доступ раковых клеток в кровоток [128].

Группы существенно различались по экспрессии miRNA-4764-5p и lncRNARP11-156p1.3. Значительное снижение жизнеспособности и количества клеток наблюдалось в клетках HEPG2, нокаутированных с помощью CRISPR/Cas9-опосредованного нокдауна RP11-156p1.3. Выбранные РНК могут служить потенциальными терапевтическими мишенями для HCC и являются важными патогенетическими игроками [128].

В большинстве случаев после нокаута RP11-156P1.3 в клетках HCC исследователи проводят анализы жизнеспособности клеток (например, MTT или MTS) [129,130]. В результате нокаута RP11-156P1.3 в клетках HCC они могут сообщить о значительном снижении жизнеспособности клеток, выраженном в процентах. Например, "Жизнеспособность клеток HCC была снижена на 40 % по сравнению с контрольными клетками через 72 ч после нокаута". Можно определить влияние на пролиферацию клеток с помощью такого анализа, как BrdU, или подсчета клеток. Результаты можно выразить в процентах от пролиферации или в процентах от количества клеток в разные моменты времени. Через четыре дня после нокаута RP11-156P1.3 пролиферация клеток была значительно снижена на 35 %. Анализ образования колоний может продемонстрировать снижение онкогенного потенциала путем измерения количества колоний из CRISPR-редактированных клеток по сравнению с контрольными клетками. После удаления RP11-156P1.3 в клетках HCC наблюдалось заметное снижение на 50% количества колоний, образовавшихся за две недели. Исследователи использовали проточную цитометрию для анализа данных клеточного цикла, чтобы определить, приводил ли нокаут lncRNA к увеличению числа клеток G1, что свидетельствует об аресте клеточного цикла. Распределение клеточного цикла значительно изменилось при нокауте RP11-156P1.3: на 25 % увеличилось количество G1-клеток, что говорит о том, что RP11-156P1.3 регулирует клеточный цикл". Последним шагом будет окрашивание и анализ клеток с помощью Annexin V/PI, а затем проточная цитометрия. Увеличение числа ранних и поздних апоптотических клеток может служить убедительным свидетельством того, что RP11-156P1.3 способствует выживанию клеток. Нокаут RP11-156P1.3 вызывал выраженный апоптотический ответ, что приводило к увеличению на 30 % количества аннексин V-позитивных клеток [131-134].

Было показано, что геномный скрининг активации CRISPR является эффективным методом выявления онкогенных lncRNA, на которые затем можно направить клиническое воздействие. Авторы всесторонне показали, что lncRNA играют физиологическую роль в развитии HCC с помощью вычислительного анализа клинических транскриптомных данных и функционального CRISPR-скрининга активации. Как показала способность CASC11 регулировать MYC и его последующие мишени, прогрессирование HCC регулируется. Поэтому необходимо продолжить изучение функциональных кандидатов в lncRNA, чтобы превратить их в биомаркеры и терапевтические мишени для пациентов с HCC [135].

В результате действия CASC11 экспрессия MYC регулируется через определенный путь. Например, CASC11 может усиливать сигнальные пути Wnt/β-катенин, которые имеют решающее значение для выживания и пролиферации клеток. Препятствуя его деградации, CASC11 может увеличить ядерную транслокацию β-катенина в рамках этого пути, стабилизируя β-катенин. β-катенин способствует транскрипции MYC и других целевых генов после связывания с семейством транскрипционных факторов TCF/LEF. Прогрессия клеточного цикла, ингибирование апоптоза и усиленный клеточный метаболизм - все это неотъемлемые составляющие агрессивного фенотипа раковых клеток, которым способствует данная регуляция. Чтобы понять степень влияния CASC11 на прогрессирование HCC, исследователи, вероятно, измерят его количественно. Например, можно было бы наблюдать CRISPR/Cas9-нокаут CASC11 в клеточных линиях HCC, и тогда свойства опухоли могли бы измениться соответствующим образом. Значительное снижение пролиферации клеток было отмечено с помощью анализов пролиферации клеток (таких как MTT/MTS); например, "нокаут CASC11 привел к снижению пролиферации клеток на 60 % через 72 ч по сравнению с контрольными клетками". Анализы миграции и инвазии (например, заживление ран и трансвелл) также могут свидетельствовать о существенном снижении метастатических свойств. Анализ qRT-PCR и вестерн-блотов будет использоваться для оценки уровня MYC после нокаута CASC11, показывая, например, "снижение мРНК MYC на 80 % и белка MYC на 90 %". Также можно продемонстрировать на мышиных моделях, что нокаут CASC11 значительно снижает рост опухоли. Исследователи могут заявить: "Опухоли в группе с нокаутом CASC11 были на 50 % меньше, чем в контрольной группе".

При переходе от лабораторных к клиническим исследованиям таких lncRNA, как SNHG9, RP11-156P1.3 и CASC11 при HCC, необходимо учитывать несколько соображений. Некоторые виды рака, включая HCC, экспрессируют lncRNA в клеточно-специфической манере, что делает возможным их использование в качестве прогностических маркеров. Исследователь может изучить корреляцию между уровнями SNHG9, RP11-156P1.3 и CASC11 и прогрессированием заболевания, выживаемостью пациентов и ответом на терапию. LncRNA могут быть прогностическими биомаркерами, если они сильно коррелируют между собой, поскольку некоторые lncRNA участвуют в онкогенезе, метастазировании и резистентности к терапии. Если эти lncRNA важны для HCC, на них можно будет направить воздействие. Эти lncRNA могут быть уничтожены с помощью CRISPR/Cas9, что потенциально может нарушить прогрессию раковых клеток, а не просто использоваться для исследований. Разработка lncRNA, которые могут быть использованы в качестве прогностических маркеров или терапевтических мишеней, требует проведения клинических испытаний, в ходе которых будет оценена безопасность и эффективность воздействия на эти lncRNA на людях. При подготовке к поэтапным клиническим испытаниям часто проводятся доклинические исследования на клеточных линиях и животных моделях сначала для оценки безопасности (фаза I), а затем эффективности (фазы II и III) [136,137].

С использованием Hep@PGEA был успешно создан терапевтический вектор для ортотопической HCC, способный обращать ее заряд. Увеличивая высвобождение pCas9 и высвобождая его для реверсии заряда с помощью ключей, Hep@PGEA может эффективно конденсировать и доставлять pCas9 в ортотопическую HCC. Предложенная терапевтическая стратегия, как оказалось, не обладает какой-либо очевидной токсичностью при HCC [138]. Похоже, что генотерапия в сочетании с Sorafenib и генотерапия в сочетании с комплексами Hep@PGEA/pCas9 является эффективным способом лечения HCC, обеспечивая новый терапевтический подход. Кроме того, благодаря высокой степени обогащения печени, системы доставки на основе Hep@PGEA могут быть использованы и для лечения других заболеваний печени [139].

В результате оптимизации наносистемы лекарственные препараты и гены эффективно загружались и высвобождались, достигая эффективности загрузки 23,15% для Sorafenib и 76,65% для pEGFR. Согласно исследованию высвобождения SEHPA NPs in vitro, они высвобождаются в 2 раза больше при pH 5,5, чем при pH 7,4 в течение 72 ч. Через 24 ч после инъекции SEHPA NPs были в 2 раза более многочисленны в опухолевых тканях мышей, переносящих опухоль, чем не модифицированные наночастицы (NPs). Через 16 дней после лечения SEHPA NPs достигли 85 % ингибирования роста опухоли по сравнению с 52 % при использовании только Sorafenib благодаря улучшенному нацеливанию на опухоль и синергетической терапии. Кроме того, по окончании исследования SEHPA NPs уменьшили массу опухоли на 62 % по сравнению с 21 % при использовании только Sorafenib. Эффективная доставка и борьба с опухолями стали возможны благодаря рациональному дизайну наносистемы.

В рамках исследования с использованием полых наночастиц мезопористого диоксида кремния, покрытых полиамидоаминоаптамерами, была продемонстрирована совместная доставка Sorafenib и CRISPR/Cas9. Благодаря исключительной стабильности наночастиц с ядром-оболочкой, генно-лекарственная смесь была успешно доставлена, при этом значительное количество лекарства было помещено внутрь частиц, а его высвобождение тщательно регулировалось. Было установлено, что наночастицы SEHPA имеют стабильный профиль высвобождения, длительный период полураспада в крови и приличное время циркуляции. Хотя ни окрашивание HE, ни биохимические анализы крови не позволили выявить SEHPA NPs, они накапливались в области опухоли. После редактирования гена EGFR in vivo, IHC использовался для проверки подавления экспрессии EGFR в опухолевых тканях, а секвенирование in vivo использовалось для подтверждения эффективности редактирования гена EGFR. Основываясь на этих данных, наносистема может быть использована в качестве синергетической системы для лечения HCC путем сочетания генотерапии и химиотерапии [140].

Ксенотрансплантаты были созданы путем введения человеческих клеток HCC, сконструированных для экспрессии люциферазы, 6-недельным самкам мышей BALB/c nude. Мы дали ксенотрансплантату семь дней, чтобы закрепиться в паренхиме печени, после чего начали лечение фрагментами этого ксенотрансплантата. Для мониторинга роста опухоли после введения люциферинового субстрата использовали биолюминесцентную визуализацию, при этом эффективность излучения определяли по фотон/секунда/см²/steradians. Апоптоз, эффективность излучения биолюминесценции, общая выживаемость, вес опухоли, частота редактирования гена survivin, экспрессия белка survivin с помощью иммуногистохимии и частота редактирования гена survivin - вот некоторые конечные точки эффективности. Лучевая эффективность при лечении Hep@PGEA/pCas9 снизилась на 60-70 %, а при комбинации с Sorafenib - на 95-98 %. Общая выживаемость не отличалась в течение 37 дней эксперимента. Было установлено, что частота редактирования гена survivin составляла 0,0% (контроль), 0,42 г (Hep@PGEA/pCas9), 0,12 г (Sorafenib) и 0,026 г (комбинация). Уровень апоптоза был увеличен в 2 раза при использовании Hep@PGEA/pCas9 и в 4 раза при комбинированном лечении по сравнению с контролем. Экспрессия белка Survivin снижалась на 60 % при использовании Hep@PGEA/pCas9 и на 90 % при использовании комбинации.

Наносистема дает многообещающие результаты, но до ее клинического применения еще предстоит преодолеть несколько препятствий. Работа находится на ранней стадии и еще не прошла клинические испытания на людях, поэтому продемонстрировать терапевтическую эффективность и безопасность было непросто. Сравнение наносистемы с мышиными моделями позволило бы получить информацию о биораспределении, накоплении в опухоли, эффективности редактирования генов и противоопухолевом эффекте. Неизвестно, является ли она токсичной, не-целевой или иммуногенной, поэтому испытания первой фазы должны проводиться на людях. Масштабирование производственных процессов и поддержание контроля качества в соответствии с клинической надлежащей производственной практикой все еще представляют собой проблемы. Утверждение регулирующих органов для генотерапии и адресной доставки лекарств, вероятно, будет более сложным. Для того чтобы определить, можно ли использовать эту наносистему для лечения больных раком печени, потребуется ее оптимизация и всестороннее тестирование.

Несмотря на то, что ортотопическая модель мыши продемонстрировала доказательство эффективности концепции у пациентов с HCC, необходима дальнейшая оптимизация. Испытания будут проводиться на иммунодефицитных моделях, с повторными дозами, улучшением эффективности доставки, редактированием по мишени, увеличением масштабов производства наночастиц, тестированием против последовательностей сурвивина, сочетанием с иммунотерапией, повторными дозами и поэтапными клиническими испытаниями. Несмотря на то что первые данные обнадеживают, необходимо проделать дополнительную работу, чтобы решить проблемы с моделями, эффективной доставкой, эффективным производством, комбинаторными стратегиями, фармакологией и клиническими испытаниями.

Наконец, вся информация и данные, представленные выше, показаны и перечислены на рис. 2 и в табл. 1. Таблица 2 дает упрощенное представление, но важно отметить, что реальные сценарии могут быть гораздо сложнее, в зависимости от специфики терапии, индивидуальных особенностей пациента и текущих достижений в каждой области. Каждый подход подлежит всестороннему изучению и клиническим испытаниям для подтверждения его эффективности и безопасности, особенно в таком деликатном контексте, как лечение HCC.



Figure 2 The activation of tumor cell apoptosis, cell cycle, and oxidative stress through CRISPR/Cas9 technology as a gene therapy tool through diverse range of signaling pathways and functional mechanisms.

Table 1 A summary list on CRISPR/Cas9 system for treating HCC including involved tissues/cell lines, genes/targets and their functions

Table 2 A simplified list comparing CRISPR/Cas9 gene therapy with other common gene therapy approaches for HCC

Редактируя клетки in vitro и имплантируя их ортотопически, можно создавать генетически адаптированные опухоли для биомедицинского моделирования. Этот подход открывает большие перспективы в области биомедицинского моделирования. Свиные модели также могут быть использованы для моделирования других типов рака. Также возможно применение человеческих ген-отредактированных клеток к другим видам с использованием животных с ослабленным иммунитетом. Компоненты доставки CRISPR могут быть оптимизированы in vivo для создания свиных моделей редактирования генов. Достижения в создании животных моделей, содержащих адаптированные мутации, облегчат разработку и тестирование подходов точной медицины.

Кроме того, инновационные методы лечения на основе CRISPR могут быть изучены на свиньях путем оптимизации и тщательного тестирования перед клиническими испытаниями на людях. Несмотря на то, что CRISPR/Cas имеет потенциал стать эффективным терапевтическим подходом для лечения генетических заболеваний, по некоторым причинам он до сих пор не применяется на людях. Технология CRISPR/Cas9 будет усовершенствована путем тестирования ее терапевтического потенциала на животных моделях. Размер, анатомическое и биологическое сходство свиней делают их идеальной животной моделью для тестирования безопасности и эффективности CRISPR/Cas9.

Несмотря на то, что CRISPR/Cas9 обладает потенциалом эффективного терапевтического подхода для лечения генетических заболеваний, он может оставаться неприменимым к пациентам по нескольким причинам, которые все еще находятся на стадии оценки модели.

По мере того как генотерапия на основе CRISPR/Cas9 выходит за рамки предварительных результатов, полученных в рамках текущего исследования, она становится все более тонкой и специфичной для конкретной мишени. Будущие исследования, вероятно, будут направлены на разработку генетических изменений, которые позволят максимально повысить эффективность генных модификаций для подавления роста HCC. Например, нокауты SNHG9 и CASC11 продемонстрировали важность этих генов для пролиферации и метастазирования. Более выраженный терапевтический эффект может быть достигнут путем выявления более целевых генов и соответствующих CRISPR-стратегий, что позволит выйти за рамки моногенного подхода и перейти к возможному полигенному процессу. Ограничения существующих методов лечения HCC, таких как Sorafenib, делают технологию CRISPR/Cas9 перспективным кандидатом для комбинирования с существующими или новыми препаратами. Исследования должны выявить синергетические комбинации для оптимизации терапевтических эффектов генного редактирования при минимизации вне-целевых эффектов и резистентности, что является проблемой, наблюдаемой в текущих схемах. Эффективная доставка генетического материала в клетки-мишени с помощью наночастиц становится все более сложной задачей. Эти векторы доставки нуждаются в усовершенствовании с точки зрения специфичности, стабильности и безопасности. Биосовместимые материалы, целевые лиганды и механизмы контролируемого высвобождения, вероятно, будут изучаться более интенсивно, с акцентом на минимизацию иммуногенности. Будущие усилия должны включать разработку строгих клинических испытаний для проверки эффективности, безопасности и практической применимости CRISPR/Cas9 для лечения HCC, поскольку большинство исследований все еще являются доклиническими. Необходимо разработать систематический подход к учету долгосрочных результатов, потенциальных побочных эффектов и улучшения качества жизни в рамках этих испытаний. Пациенты с HCC отличаются значительной генетической гетерогенностью, что делает персонализированную генотерапию более эффективной. Для этого необходимо провести дополнительные исследования по всестороннему генетическому обследованию и разработке наборов инструментов CRISPR, адаптированных к индивидуальным профилям пациентов, которые будут быстрыми и экономически эффективными.

Было выявлено несколько ограничений, касающихся методов доставки CRISPR для лечения HCC, которые необходимо устранить для улучшения клинической трансляции. Некоторые из этих ограничений включают: 1) специфичность мишени и вне-целевые эффекты, 2) эффективность доставки, 3) иммуногенность, 4) эффективность редактирования in vivo, 5) контроль редактирования генов и 6) масштабирование и производство. Следующее поколение CRISPR/Cas9-систем для терапии HCC должно объединить достижения в области материаловедения, иммунологии, геномного анализа и клеточной биологии, чтобы устранить эти ограничения. Успешная клиническая трансляция может быть достигнута благодаря этим усовершенствованиям, которые обеспечат точность, безопасность и контроль.

Научному сообществу необходимо объединить усилия для преодоления этих препятствий, начиная с совершенствования технических аспектов и заканчивая созданием строгих этических и нормативных рамок. Для превращения CRISPR в надежный и широко применимый терапевтический подход прогресс в этих областях будет иметь первостепенное значение.

Ксенотрансплантаты или органоиды, полученные от пациентов, являются важными доклиническими моделями HCC, которые позволяют лучше понять потенциальные клинические исходы до начала испытаний на людях. Помимо изучения фармакокинетики и фармакодинамики системы CRISPR, исследования должны проводиться на различных животных моделях, чтобы уменьшить вне-целевые эффекты. Минимизация вне-целевых эффектов очень важна для обеспечения безопасности. Исследователям необходимо использовать геномные методы высокого разрешения для картирования сайтов off-target и понимания непреднамеренных взаимодействий в геноме гепатоцитов. Кроме того, приоритетными должны быть стратегии безопасной доставки и транзиторной экспрессии, чтобы свести к минимуму непреднамеренное редактирование генома за счет инженерных достижений, направленных на повышение достоверности фермента Cas. Важное значение имеет комплексная токсикологическая оценка. В частности, печень известна своей уязвимостью к генно-терапевтическим вмешательствам, поэтому компоненты CRISPR должны быть оценены на предмет их иммуногенности, генотоксичности и других системных эффектов. В обсуждаемых исследованиях определены конкретные lncRNAs и другие генетические элементы, влияющие на развитие HCC. В ходе независимых исследований нам необходимо подтвердить эти выводы, изучить терапевтические результаты манипуляций с этими мишенями и установить четкую связь между этими мишенями и патогенезом HCC. Крайне важно определить наиболее эффективную дозу, которая минимизирует риски. Для этого необходимо оптимизировать векторы доставки гепатоцитов, ограничив при этом не-целевые ткани. Кроме того, эффект редактирования генов необходимо изучать в течение длительного времени. Чтобы начать испытания на людях стратегий CRISPR/Cas9 для лечения HCC, важно убедиться, что они соответствуют всем нормативным требованиям, включая юридические и этические требования к генотерапии.

Будущее генного редактирования CRISPR/Cas9 в улучшении результатов лечения пациентов вызывает осторожный оптимизм при анализе доказательств, представленных в ходе исследований HCC. Однако оно должно пройти по точным каналам научных, этических и клинических путей. В результате CRISPR/Cas9 может привести к революционным достижениям в лечении HCC в ближайшие годы. Для того чтобы редактирование генов полностью соответствовало реальным клиническим условиям и улучшало значимые результаты лечения пациентов, необходимы тщательные исследования, этические стандарты и подходы, ориентированные на пациента.

Эффективная терапевтическая стратегия для лечения HCC может быть разработана с использованием новой технологии редактирования генов CRISPR/Cas9. Подход на основе CRISPR направлен на коррекцию генетических факторов патогенеза, прогрессирования и лекарственной устойчивости HCC путем точного нацеливания и редактирования генов, вовлеченных в ее патогенез, прогрессирование и лекарственную устойчивость. Клеточные линии и животные модели HCC продемонстрировали многообещающие результаты доклинических исследований. Модели HCC продемонстрировали противоопухолевый эффект и ингибирование роста рака при нокауте или редактировании определенных онкогенов, опухолевых супрессоров и генов, связанных с метастазированием, пролиферацией и химиорезистентностью. С помощью CRISPR можно адаптировать генные модификации для воздействия на молекулярные механизмы, лежащие в основе HCC, что было продемонстрировано на примере CTNNB1, PDHA и DUSP4. До клинической трансляции необходимо решить множество ограничений и проблем. Нам необходимо оптимизировать методы доставки, чтобы максимизировать нацеливание на опухолевые клетки, минимизировать вне-целевые эффекты и обеспечить безопасность. Персонализированный подход может потребоваться и при HCC из-за генетической гетерогенности заболевания. CRISPR в сочетании с химиотерапией, иммунотерапией или наночастицами может дать лучшие результаты, чем самостоятельная стратегия. Редактирование генов CRISPR/Cas9 пока находится на ранних экспериментальных стадиях, но благодаря своей универсальности и точности может стать основой лечения HCC в будущем. Проведение тщательных доклинических исследований и поэтапных клинических испытаний имеет решающее значение для определения реальной жизнеспособности и этических аспектов. CRISPR/Cas9 обладает огромным потенциалом для развития терапии HCC, но для того, чтобы сделать передовые генетические инструменты доступными для пациентов, необходимы дальнейшие междисциплинарные исследования. В результате редактирование генов с помощью CRISPR/Cas9 доказало свою терапевтическую эффективность в отношении сложных генетических факторов HCC, но превращение этих доказательств концепции в клинические методы лечения требует систематических инноваций и оценки в долгосрочной перспективе. CRISPR преуспеет в лабораторных исследованиях, но не может быть использован в клинических условиях без сотрудничества в научной, нормативной и этической сферах.