Остеоартрит - это приводящее к инвалидности, дегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующим разрушением суставов3. Хотя в настоящее время неясно, является ли основной причиной ОА повреждение хряща, ОА всегда сопровождается разрушением хряща и потерей уникального внеклеточного матрикса, который в норме обеспечивает упругость, необходимую для функционирования сустава1. Хондроциты при ОА подвергаются сложным изменениям, включая анаболические и катаболические изменения. Хондроциты являются центральными действующими лицами в этом регуляторном каскаде - как мишень для внешних биомеханических и биохимических стимулов, а также источник протеаз, цитокинов и медиаторов, которые регулируют ухудшение состояния суставного хряща4. Несмотря на высокую распространенность и заболеваемость ОА, эффективных методов лечения, модифицирующих болезнь, в настоящее время не существует, а молекулярные механизмы, вовлеченные в ОА, остаются малоизученными.
Наряду со значительной потерей суставного хряща, доминирующим клиническим симптомом ОА является боль5. Специализированные периферические сенсорные нейроны в изобилии присутствуют в тканях суставов, включая синовий и субхондральную кость6, и способствуют возникновению боли при ОА. Эти нейроны экспрессируют уникальный репертуар VGSCs7. Существует девять различных VGSC (Nav1.1-Nav1.9), кодируемых генами SCN1A-SCN11A8. Nav1.7, Nav1.8 и Nav1.9 представляют особый интерес как мишени для лечения боли из-за их преимущественной экспрессии в периферических сенсорных нейронах ганглиев дорсальных корешков (DRG) и их роли в инициации и распространении потенциала действия в периферических болевых путях7. Модуляция Nav1.8, экспрессируемого DRG, может ослабить боль при ОА9. Критическая роль Nav1.7 в сигнализации боли10 и генетическое подтверждение (сильная боль при усилении функции Nav1.7, мутаций11,12 и нечувствительность к боли при потере функции Nav1.7, мутаций13,14) еще больше указывают на Nav1.7, в качестве терапевтической мишени для устранения боли. Примечательно, что мутации с усилением функции Nav1.7, повышают болевую чувствительность у некоторых пациентов с ОА15. Роль Nav1.7, в воспалительной боли подтверждается наблюдениями у мышей с глобальным Nav1.7, и DRG-специфическим нокаутом16,17. Роль Nav1.7, экспрессируемого DRG, в возникновении боли при ОА была подтверждена снижением боли при ОА после спинального введения ProTx II, селективного антагониста Nav1.7, в модели ОА, вызванной мононатрием йодоацетата (MIA)18.
Хотя экспрессия VGSCs в возбудимых клетках хорошо известна8, они также наблюдались в типах клеток, которые не считаются электровозбудимыми, включая астроциты, микроглия, макрофаги и раковые клетки19. Хрящ не содержит сосудов и лишен нервных окончаний, но ангиогенез и рост сенсорных нервов в хряще при ОА могут способствовать возникновению боли при ОА20. Кроме того, сообщалось о наличии чувствительных к тетродотоксину (TTX) VGSCs в хондроцитах кролика2. Тем не менее, несмотря на наличие доказательств того, что аберрантная активация VGSCs способствует возникновению боли при ОА21, наличие и функция VGSC(ов) в хондроцитах, а также их роль в прогрессировании ОА и возникновении боли остаются практически неизвестными.
Чтобы выявить новые, дифференциально экспрессируемые гены при ОА, мы провели анализ РНК-секвенирования (RNA-seq) в нормальном и артритном хряще и определили Nav1.7, как единственный значительно повышенный регуляторный VGSC, связанный с ОА. Здесь мы демонстрируем, что в отличие от Nav1.7, экспрессируемого DRG, который участвует только в сигнализации боли при ОА, Nav1.7, экспрессируемый хондроцитами, регулирует биологию хондроцитов и прогрессирование ОА. Мы показали, что блокада Nav1.7, защищает суставы от разрушения, а блокада Nav1.7, опосредует свои хондропротекторные эффекты, по крайней мере частично, за счет регуляции внутриклеточной сигнализации Ca2+ и секретома хондроцитов...
a,b, F/F0 (a) and area under the curve (AUC) of intracellular Ca2+ (b) in human OA chondrocytes following ATP stimulation, measured by plate reader. ATP present from red arrow. c,d, HSP70 (c) and midkine (d) levels in conditioned medium of C28I2 cells pre-treated with BAPTA-AM, followed by ProTx II or PF-04856264. e, F/F0 of intracellular Ca2+ in KB-R7943 treated C28I2 chondrocytes following ATP stimulation, assayed by confocal fluorescence microscopy. f,g, HSP70 (f) and midkine (g) levels in conditioned medium of C28I2 cells treated with KB-R7943 in the presence or absence of PF-04856264. h, Expression of NCX isoforms in C28I2 cells. i, Knockdown efficiency of NCX1 in C28I2 cells. j,k, F/F0 (j) and AUC of intracellular Ca2+ (k) following ATP stimulation in C28I2 chondrocytes transfected with scramble or NCX1 siRNA measured by plate reader. l, HSP70 and midkine levels in conditioned medium of chondrocytes transfected with scramble or NCX1 siRNA and treated with ProTx II or PF-04856264. m, Model of mechanisms of chondrocyte- and DRG-expressed Nav1.7 in OA, and amelioration of OA and pain via Nav1.7 blockade. b–d,f,g,k,l, Data are mean ± s.d. b,f,g, P values calculated by one way ANOVA with Bonferroni post hoc test. k, Two-tailed unpaired Student’s t-test. c,d,l, Two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test. b,f–i,k, n = 3 biological replicates. c,d,l, n = 4 biological replicates.
Discussion
Хотя классически они считаются субстратом для инициации и распространения потенциала действия40, низкая плотность VGSCs была зарегистрирована во многих типах клеток, которые традиционно считались невозбудимыми, включая макрофаги, микроглия и астроциты, где они могут участвовать в регуляции эффекторных функций, таких как фагоцитоз, подвижность, высвобождение цитокинов и ответ на травму41-43. Хондроциты экспрессируют множество типов ионных каналов44,45, которые участвуют в различных физиологических процессах, включая установление потенциала покоя, механореактивность, регуляцию объема, сигнализацию кальция, развитие костей, регуляцию внутриклеточного рН, клеточный биосинтез и пролиферацию46-51. В частности, известно, что экспрессия нескольких типов ионных каналов изменена в хондроцитах при ОА44,45,52, а специфический для хряща нокаут механосенсорных ионных каналов уменьшает возрастной ОА53.
Sugimoto и др. сообщили о токе TTX-S в суставных хондроцитах кролика2 , однако его молекулярная идентичность была неизвестна. Здесь мы демонстрируем, что хондроциты ОА человека обнаруживают натриевый ток TTX-S, который вырабатывается в основном функциональным Nav1.7. Мы наблюдали плотность натриевого тока 2,4 pA pF-1 (39,7pS pF-1) в хондроцитах человека. Если предположить, что одноканальная проводимость54 составляет 6,4 pS, а вероятность открытия10,54 - 0,4-0,6 при 0 mV, это означает, что плотность каналов составляет 0,1-0,15 каналов на µм2 и 350-525 каналов на клетку. Примечательно, что токи TTX-S в хондроцитах ОА человека составляют в среднем 62% от общего натриевого тока, в то время как токи ProTx II-S составляют 40%. Этот результат подчеркивает существование натриевых каналов Nav1.7, в первичных хондроцитах ОА человека и указывает на возможность дробного присутствия натриевых каналов TTX-S, не относящихся к Nav1.7, в этом типе клеток.
Известно, что Nav1.7, регулирует секрецию цитокинов в дендритных клетках42. Здесь мы продемонстрировали, что блокаторы Nav1.7, влияют на анаболические и катаболические процессы хондроцитов через регуляцию секретома хондроцитов. Сочетание фракционирования кондиционированной среды и последующего протеомного анализа привело к идентификации HSP70 и midkine как ключевых молекул в кондиционированной среде клеток, обработанных ингибиторами Nav1.7, которые участвуют в контроле метаболизма хондроцитов. Повышенное высвобождение HSP70 и midkine в результате блокады Nav1.7, в Nav1.7,-экспрессирующих хондроцитах может иметь как аутокринный, так и паракринный эффект и позволяет Nav1.7,-экспрессирующим и не экспрессирующим хондроцитам интегрировать сигналы из местной среды для организации анаболических и катаболических процессов, которые способствуют ОА. Мы продемонстрировали, что увеличение внутриклеточной передачи сигналов Ca2+ необходимо для усиления секреции HSP70 и midkine, вызванного блокадой Nav1.7, в хондроцитах. Этот эффект был сведен на нет фармакологическим ингибированием и генетической абляцией NCX1, это подчеркивает важнейшую роль NCX1 в регуляции внутриклеточной передачи сигналов Ca2+ и последующей секреции HSP70 и мидкина в ответ на блокаду Nav1.7,. Следует отметить, что блокада Nav1.7, вызывает определенную последовательность изменений уровня внутриклеточного кальция в хондроцитах: сначала она снижает уровень Ca2+, стимулируемый АТФ, чему противодействует ингибирование NCX1; затем происходит устойчивое повышение уровня Ca2+, которое, возможно, контролируется серией межбелковых и белок-липидных взаимодействий. Наши результаты свидетельствуют о том, что блокаторы Nav1.7, перспективны в качестве терапевтических средств для защиты от потери хряща и ослабления боли при ОА. Мы продемонстрировали на нескольких моделях животных, что CBZ, блокатор натриевых каналов, который в настоящее время используется в клинической практике, предотвращает потерю хряща в животных моделях ОА, причем этот эффект не ограничивается только блокированием восприятия боли. Эти результаты подчеркивают потенциальное клиническое использование доступного в настоящее время блокатора натриевых каналов, одобренного FDA, который может быть использован для лечения ОА.
Наконец, мы определили Nav1.7, как ионный канал, связанный с ОА, с двойной ролью в возникновении боли и в гомеостазе хряща, причем Nav1.7, экспрессируемый нейронами DRG, участвует в возникновении боли, а Nav1.7, экспрессируемый хондроцитами, регулирует биологию хондроцитов, потерю хряща и возникающую боль при ОА посредством мощного влияния на секретом хондроцитов (рис. 4m). Идентификация Nav1.7, как нового гена, экспрессируемого хондроцитами и связанного с ОА, открывает мишень для разработки терапии, которая может обеспечить как модификацию заболевания, так и не вызывающее привыкания обезболивающее лечение при ОА.
