Инсулин является важнейшим регулятором энергетического обмена в организме. В частности, связывание инсулина с рецепторами на поверхности клеток облегчает поступление глюкозы из кровотока во многие типы клеток организма, в первую очередь в мышечные и жировые, чтобы они могли использовать ее в качестве энергии. Инсулин сигнализирует о том, что имеется избыток глюкозы, и чтобы клетка хранила глюкозу для дальнейшего использования в виде гликогена в печени и в мышцах, а также превращалась в жир в адипоцитах. Параллельно с этим инсулин замедляет расщепление жиров и белков, поскsольку они не так уж и нужны, когда глюкозы много. Количество инсулина, циркулирующего в крови, динамически изменяется в ответ на на постоянно меняющиеся энергетические потребности организма и зависит от доступности каждого источника топлива. Специализированные эндокринные клетки, называемые β-клетками, расположенные в островках Лангерганса в поджелудочной железе, они отвечают за жестко регулируемую выработку и высвобождение инсулина. Например, после приема пищи уровень глюкозы в крови повышается, поскольку углеводы расщепляются до глюкозы и β-клетки быстро чувствуют этот повышение уровня глюкозы в крови и выделяют соответствующее количество инсулина в ответ, позволяя клеткам всего организма использовать эту глюкозу для производства энергии. Уровень глюкозы в крови падает по мере поступления глюкозы в клетки, что заставляет β-клетки замедлять выделение инсулина. Это снижение секреции инсулина в сочетании с повышением уровня контр-регуляторного гормона глюкагона клетками и предотвращает падение уровня глюкозы в крови ниже установленного порога (70 мг/дл у человека), так как минимальная концентрация необходима для нормального функционирования тканей центральной нервной системы. Быстро изменяя количество инсулина и глюкагона в кровообращении, β- и α-клетки поддерживают уровень глюкозы в крови в узком оптимальном диапазоне.

При type 1 diabetes (T1D) β-клетки избирательно разрушаются в результате аутоиммунным процессом, что приводит к неспособности вырабатывать инсулин.^5,6 Без инсулина гомеостаз глюкозы и баланс энергетического обмена в организме полностью нарушаются. Поскольку многие типы клеток больше не могут импортировать глюкозу для получения энергии, они вынуждены переключиться на метаболизм свободных жирных кислот, которые высвобождаются при расщеплении триглицеридов в адипоцитах в качестве основного источника энергии. Важно отметить, что при переработке печенью свободных жирных кислот, в ней образуются кетоны, которые также могут использоваться в качестве источника энергии другими тканями. Хотя этот процесс является нормальным в периоды голодания и низкоуглеводной диеты, полное отсутствие инсулинового сигнала при T1D приводит к неконтролируемому расщеплению жиров и неконтролируемой выработке кетонов. Быстрое накопление кетонов изменяет рН крови, что приводит к опасному для жизни состоянию, называемому кетоацидозом.^7,8 Таким образом, пациенты с T1D должны вводить экзогенный инсулин, чтобы выжить и восстановить необходимые сигнальные пути, которые правильно регулируют энергетический обмен. Хотя инъекции инсулина позволяют пациентам с T1D оставаться в живых, воспроизвести точную динамику секреции инсулина клетками β может быть сложной задачей. При расчете дозы инсулина пациентам необходимо учитывать не только то, что потребность в инсулине тесно связана с энергетиче SCsим метаболизмом, но другие факторы, такие как интенсивность и продолжительность физической активности, а также уровень стресса, которые могут влиять на то, сколько инсулина требуется организму в данный момент времени. Неправильная оценка количества инсулина, необходимого в конкретный момент времени, может создать как краткосрочные, так и долгосрочные проблемы. Например, недостаточное количество инсулина приведет к тому, что уровень глюкозы в крови пациента будет выше, чем должен быть. В крайних случаях высокий уровень глюкозы может изменить осмолярность крови и привести к опасному для жизни обезвоживанию.⁸ Умеренно высокий уровень глюкозы не является серьезной проблемой в краткосрочной перспективе, хотя пациент может чувствовать себя неоптимально. Однако в течение жизни пациента хроническое повышение концентрации глюкозы в крови может привести к повреждению тканей во всех органах организма. Поэтому очень важно стараться поддерживать уровень глюкозы в крови как можно ближе к норме, чтобы избежать долгосрочных осложнений, таких как сердечно-сосудистые, почечные и глазные заболевания.^9,10 С другой стороны, введение слишком большого количества инсулина опасно в краткосрочной перспективе, по SCsольку может привести к снижению уровня глюкозы в крови ниже нижней границы нормы. Центральная нервная система нуждается в постоянном поступлении глюкозы, и определенная концентрация глюкозы в крови необходима для того, чтобы обеспечить достаточный транспорт глюкозы через гематоэнцефалический барьер.¹¹ Таким образом, когда уровень глюкозы в крови падает ниже этого порога, человек может человек может начать вести себя ненормально, поскольку его мозг, по сути, голодает. Если уровень глюкозы продолжает падать, человек может потерять сознание и в конечном итоге умереть.¹² Следовательно, пациенты, принимающие инсулин, должны пытаться ориентироваться между этими двумя крайностями и определять количество инсулина, необходимое их организму, исходя из их текущего метаболического состояния.

За последние годы лечение T1D достигло больших успехов. В частности, новые средства, такие как инсулиновые помпы и непрерывные мониторы глюкозы, несомненно, облегчили жизнь с диабетом и помогли многим пациентам добиться лучшего контроля над уровнем глюкозы в крови.¹³ Несмотря на эти достижения, однако многие пациенты по-прежнему не достигают поставленных целей. Более того, даже если они достигают целевых показателей уровня глюкозы в крови, терапия может оставаться обременительной, так как она требует постоянного мониторинга и корректировки. Из-за сложности воспроизведения точной динамики секреции инсулина β-клетками с помощью экзогенных инъекций инсулина, потенциально лучшая альтернатива лечения заключается в замене утраченных β-клеток новыми, позволяя этим пересаженным клеткам отслеживать уровень глюкозы в крови и выделять соответствующее количество инсулина в ответ. Такая трансплантация обеспечит "функциональное излечение" пациентов с T1D, поскольку им больше не придется контролировать уровень глюкозы в крови с помощью инъекций инсулина. Больные диабетом 2-го типа, которые полагаются на инъекции инсулина, также могут получить пользу от такой трансплантации. T1D является потенциально идеальным кандидатом для заместительной клеточной терапии. Поскольку отдельные β-клетки способны ощущать изменения уровня глюкозы во внеклеточном пространстве и выделять инсулин, нет необходимости в сложной рабочей структуре из множества интегрированных типов клеток, как это было бы необходимо при тканевой инженерии целых органов, таких как сердце или почка. Напротив, до тех пор, пока β-клетки должным образом выделяют инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой и пересаживаются в место, которое способствует адекватному обмену этих молекул с кровотоком, такая клеточная заместительная терапия может обеспечить функциональное лечение от T1D.

Совершенствование трансплантации целой поджелудочной железы, начавшееся в 1960-х годов продемонстрировали, что донор SCsая ткань поджелудочной железы может восстановить гомеостаз глюкозы у пациентов с диабетом.¹⁴ Однако трансплантация островков поджелудочной железы для восстановления массы β-клеток имела ограниченный успех до разработки Эдмонтонского протокола в 2000 году, который продемонстрировал, что инфузия островков в печень через воротную вену была достаточной для восстановления гомеостаза глюкозы.^15,16 Их первоначальные испытания привели к инсулин-независимости у всех семи пациентов через 1 год после трансплантации, что значительно улучшило предыдущие результаты.

Благодаря оптимизации режима иммуносупрессии, а также благодаря усовершенствованию методов выделения островков, результаты трансплантации островков значительно улучшились. Хотя все эти пациенты, кроме одного, нуждались в дополнительном инсулине через 10 лет после трансплантации, все реципиенты сохранили определенный уровень функции трансплантата, что обеспечило значительные преимущества в контроле уровня глюкозы и устранении тяжелых гипогликемических явлений.¹⁷ Последующие исследования трансплантации продолжали демонстрировать улучшение результатов лечения пациентов, а трансплантация островков приблизилась к успеху трансплантации целой поджелудочной железы без соответствующего хирургического риска.^18-23 Важно отметить, что эти замечательные исследования продемонстрировали, что концепция замещения массы β-клеток путем трансплантации панкреатических островков является относительно безопасной и эффективной в лечении T1D.

Хотя трансплантация человеческих островков от умерших доноров продемонстрировала возможность применения клеточной заместительной терапии для лечения диабета, существует ряд проблем, которые ограничивают ее более широкое применение. В частности, успех трансплантации повышается при пересадке большого количества островков, что часто приводит к необходимости использования нескольких донор SCsих поджелудочных желез.^15,20,24 Не только количество поджелудочных желез, доступных для выделения островков, ограничено, но и трансплантация клеток из нескольких генетических групп одному пациента может усугубить иммунное отторжение и несостоятельность трансплантата.^25,26 Кроме того, стресс, связанный с очисткой клеток из поджелудочной железы, может повредить островки перед трансплантацией.²⁷ Эту проблему с выбором источника можно обойти, дифференцируя стволовые клетки ( SCs) в β-клетки in vitro, создавая неограниченный запас инсулин-продуцирующих клеток. Эти островки, полученные из стволовых клеток (SCs-островки), можно генерировать из одноклеточного источника с использованием стандартизированного процесса, а полученный клеточный продукт можно хорошо охарактеризовать, чтобы сделать трансплантацию более предсказуемой. Кроме того, продукт, полученный из SCs, может быть генетически сконструирован таким образом, чтобы обладать преимущественными свойствами, не встречающимися в первичных островках, например, устойчивость к стрессовым факторам, таким как гипоксия или способность обходить иммунную систему хозяина.

Последние достижения в области технологий SCs привели к проведению первых клинических испытаний с использованием продуктов поджелудочной железы, полученных с помощью SCs. В частности, компания ViaCyte разработала полученную из SCs популяцию клеток эндодермы поджелудочной железы, известную как PEC-01, которая, как они продемонстрировали, созревает в течение нескольких месяцев in vivo и они превратились в эндокринные клетки, продуцирующие инсулин, в моделях грызунов.^29-31 Кроме того, они разработали несколько итераций (вариантов) извлекаемого макрокапсульного устройства для содержания пересаженных клеток. В первом клиническом исследовании 2014 года на людях (clinicaltrials.gov: NCT02239354) использовалось устройство Encaptra, которое было разработано для полной иммунозащиты клеток с помощью непроницаемой для клеток мембраны.³² Хотя пересаженный продукт PEC-Encap переносился хорошо и имел мало побочных эффектов, испытание было остановлено из-за недостаточного функционального приживления продукта.³³ Хотя некоторые эндокринные клетки были обнаружены, фиброз вокруг капсулы привел к потере трансплантата, а секреция инсулина из устройства не была обнаружена.^33,34 Для преодоления этой проблемы новое устройство PEC-Direct содержит отверстия в мембране для обеспечения васкуляризации с целью улучшения обмена питательными веществами и способствует выживанию клеток. Поскольку клетки хозяина могли проникать в устройство, то после трансплантации требовалась иммуносупрессия. Продолжающееся клиническое испытание было начатое в 2017 году на семи площадках для тестирования этого устройства (clinicaltrials.gov: NCT03163511), и недавно были опубликованы первые результаты.^33,35 Они продемонстрировали чувствительную к глюкозе выработку С-пептида через 6-9 месяцев после трансплантации, когда пересаженные клетки превращались из клкток предшественников поджелудочной железы в эндокринные клетки поджелудочной железы. После удаления трансплантата большая часть этих клеток, полученных в результате трансплантации, иммунореактивна на общий эндокринный маркер хромогранин A (CHGA). Интересно, что, несмотря на наличие областей с С-пептид-позитивными β-подобными клетками, большинство этих эндокринных клеток окрашивались на клеточный маркер глюкагон. Также наблюдались протоковые клетки и редкие ацинарные клетки. Как и предполагалось, пористая конструкция способствовала росту кровеносных сосудов внутри устройства. Этот феномен был более заметен в областях, содержащих клетки, полученные из трансплантата. Однако в других областях устройства преобладающим типом клеток были фибробласты хозяина, что привело к отложению фиброзной ткани, а не сосудов, полученных от хозяина. Хотя наблюдаемые уровни циркулирующего С-пептида в этих исследованиях были слишком низкими, чтобы вызвать ощутимую клиническую пользу, связанную с трансплантированными клетками, эти клинические испытания продемонстрировали, что содействие васкуляризации в трансплантате, способствовало долгосрочному выживанию и функционированию эндокринных клеток у людей. Параллельно с этим они подчеркивают важность ограничения фиброзной реакции. Важно отметить, что эти исследования не выявили каких-либо серьезных проблем с безопасностью, связанных с пересаженными клетками, таких как образование опухолей.

В клинических испытаниях ViaCyte эксплантированные трансплантаты через несколько месяцев жизни in vivo были очень неоднородны у разных пациентов, поскольку клетки были пересажены как предшественники поджелудочной железы и им было позволено завершить дифференцировку in vivo. ^33,35 В идеале β-клетки могли бы быть окончательно дифференцированы in vitro и способны к секрецию инсулина, реагирующего на глюкозу, до трансплантации. Это позволило бы получить более постоянную популяцию клеток, это способствовало бы относительно быстрому восстановлению контроля уровня глюкозы в крови. В 2014-2015 годах несколько групп опубликовали протоколы для получения стволовых клеток β (SC-β), секретирующих инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой.^36-38 Поскольку этот процесс дифференцировки также приводит к образованию других типов эндокринных клеток, таких как например, глюкагон-продуцирующие клетки α, эти кластеры дифференцированных клеток часто называют SCs- островками. Эти клетки, как было показано, улучшают гликемический контроль у мышей-диабетиков, что подчеркивает их потенциальную полезность in vivo.^36,37,39-44 Недавно эти SCs-клеточки были также использованы для лечения больных диабетом нечеловеческих приматов.^45,46 Хотя приматы не достигли полной инсулиновой независимости, трансплантированные SCs-клетки значительно снизили потребность в инсулине и значительно улучшили гликемический контроль, что еще раз подтверждает потенциальную полезность SCs-островков в качестве терапии. В настоящее время SCs-клетки также были пересажены пациентам с T1D в рамках клинических испытаний компании Vertex Pharmaceuticals, которые началисмь в 2021 году (clinicaltrials.gov: NCT04786262). Первые два пациента получили половину предполагаемой целевой дозы для оценки профиля безопасности препарата VX-880, полученного из SCs. Кроме того, эти клетки были пересажены без иммунозащитного устройства, чтобы избежать проблем с обменом питательных веществ и фиброзом, и поэтому пациентам требовались иммуносупрессивные препараты для обеспечения выживаемости трансплантата. Хотя первые результаты еще не прошли экспертную оценку, предварительные положительные результаты, о которых сообщается в пресс-релизе, показали, что трансплантация этих SCs-клеток улучшила гликемический контроль у этих двух пациентов с T1D (https://www.businesswire.com/news/home/20220606005424/en/). Трансплантация SCs-клеток потребовала больше времени для улучшения гликемического контроля, чем в моделях на грызунах, и причину этой задержки еще предстоит выяснить.

Эти многообещающие результаты первых клинических испытаний подчеркивают большие перспективы SCs-клеток для лечения T1D. Однако существует несколько проблем, которые необходимо решить, прежде чем эта клеточная терапия станет рутинной процедурой (рис. 1). Во-первых, SC-β клетки, полученные с помощью современных протоколов направленной дифференцировки все еще не настолько функциональны, как первичные человеческие β-клетки, а их транcrрипционный и хроматиновый ландшафт остается незрелым. Кроме того, существующие методики дифференцировки все еще приводят к появлению не-целевых типов клеток, в частности клеток, которые напоминают тип клеток эндокринной железы кишечника, называемых enterochromaffin cell (EC))⁴⁷ . Наличие этих "не-целевых" клеток, а также наблюдаемая более низкая секреция инсулина на клетку по сравнению с первичными островками указывает на то, что еще есть возможность улучшить эти протоколы дифференцировки. Если секреция инсулина на клетку может быть увеличена еще больше, то для лечения пациента потребуется меньше клеток. Сокращение необходимого количества клеток имеет большое значение как с точки зрения объема трансплантата, так и с точки зрения затрат на производство клеток. С этой целью был достигнут значительный прогресс в улучшении функции SC-islets по сравнению с оригинальными протоколами,^{39,40,44,48,49}, а последние достижения в области технологий секвенирования отдельных клеток позволили получить беспрецедентные характеристики этих клеток для дальнейшего выяснения путей совершенствования стратегий дифференцировки SC-β клеток.^43,47,50,51

Во-вторых, в идеале должна существовать стратегия, позволяющая обойти необходимость принимать иммуносупрессивные препараты после трансплантации. Для типичного пациента с T1D, способного достичь целевого уровня глюкозы в крови с помощью инъекций инсулина, как показывает уровень гемоглобина А1с, потенциально серьезные побочные эффекты пожизненной иммуносупрессии могут не перевесить преимущества дальнейшего улучшения гликемического контроля. Таким образом, в настоящее время разрабатывается несколько стратегий защиты трансплантированных SCs-клеток от иммунной атаки. Одним из привлекательных методов является инкапсуляция клеток в устройство с тонко контролируемым размером пор, которое облегчает диффузию малых молекул, таких как глюкоза и инсулин, но блокирует проникновение иммунных клеток в устройство.⁵² Биоматериалы также могут быть изготовлены с помощью обучающей химии, чтобы вызвать местную иммунную толерантность вокруг трансплантированных клеток.⁵³ В качестве альтернативы, сами SCs-островки могут быть генетически сконструированы таким образом, чтобы удалить антигены, которые сигнализируют об их уничтожении иммунной системой хозяина, а также добавить поверхностные сигнальные молекулы, которые индуцируют иммунную толерантность.^54,55

Наконец, существует несколько практических факторов, которые необходимо решить, чтобы эта клеточная терапия стала широко применяться в клинике. В частности, очень важно уменьшить стрессовую реакцию в островках сразу после трансплантации, чтобы уменьшить начальную гибель клеток, которая может привести к значительной потере трансплантата.⁵⁶ Содействие быстрой васкуляризации является ключевым фактором для уменьшения этих стрессов, чтобы способствовать выживанию клеток и долгосрочному здоровью трансплантированных SCs-клеток. Генетическая инженерия клеток, устойчивых к этим неидеальным условиям, также может способствовать их выживанию в период, предшествующий васкуляризации до того, как произойдет васкуляризация. Кроме того, разработка крупномасштабных производственных методов для генерации SCs-клеток, а также методов их криоконсервации и распространения будет иметь решающее значение для широкого распространения этой процедуры.

Проводимые клинические испытания, возглавляемые компанией Vertex Pharmaceuticals, показали, что существующие протоколы позволяют генерировать SCs-розетки, способные улучшить гликемический контроль у пациентов с T1D. Однако, дальнейшее совершенствование SCs-клеток, чтобы они лучше имитировали функциональность первичных островков взрослого человека позволило бы уменьшить количество клеток, необходимых для трансплантации и упростить производство достаточного количества клеток. Например, концептуально, если секреция инсулина на клетку удваивается, то потенциально для излечения пациента требуется вдвое меньше клеток. Уменьшение объема трансплантата облегчает процедуру трансплантации, снижает потребность в питательном обмене в месте трансплантации и открывает альтернативные возможности для пересадки. Кроме того, меньшее количество клеток необходимо будет производить, что существенно с точки зрения стоимости производства и логистики клеточной терапии.

SCs-островки создаются в ходе многоступенчатого процесса дифференцировки, который пытается имитировать этапы эмбрионального развития с помощью своевременного применения факторов роста и малых молекул, что позволяет SCs пройти через несколько промежуточных типов клеток на пути к превращению в конечные эндокринные клетки поджелудочной железы (Рисунок 2)⁵⁷.

Эта методика дифференцировки занимает примерно месяц или больше, и функциональное созревание может продолжаться в течение неcrольких месяцев после трансплантации клеток in vivo.^43,51 Пути развития, на которые направлен этот процесс, могут быть очень чувствительны к изменениям во времени и интенсивности сигналов, и поэтому небольшие изменения сигналов в определенное время могут привести к значительным изменениям при выборе клеточной судьбы. Следовательно, многие попытки улучшить генерацию SCs-островков состоят из вариантов с различными комбинациями и временем воздействия растворимых факторов. Последнее поколение протоколов лучше генерирует островок-подобные кластеры, состоящие в основном из эндокринных клеток, хотя не все из них являются β-клетками. Значительную часть могут составлять α-клетки, а также некоторые δ-клетки. Интересно, каковы роль или важность этих других типов эндокринных клеток для функции β-клеток в контексте SCs-клеток и существует ли оптимальное соотношение клеток, на которое следует ориентироваться во время дифференцировки, неизвестно. Современные протоколы также позволяют получить значительный процент SCs-производных ECs (SC-ECs), которые напоминают один из видов кишечных эндокринных клеток.⁴⁷ При использовании менее оптимизированных протоколов или клеточных линий также существует возможность сохранять клетки предшественники в конечных островковых кластерах, а также производить другие типы энтодермальных клеток, например, печеночного происхождения.^39,58 Следовательно, увеличение секреции инсулина на клетку в SCs-островках может быть достигнуто за счет улучшения созревания SCs-клеток или уменьшения процентного содержания этих не-целевых клеточных популяций.



Figure 1. Key pillars of a successful SC-islet therapy for treating T1D

The remaining challenges limiting the application of SC-islets as a treatment option for diabetes cover a broad range of considerations. The first major component of a successful SC-islet therapy is the ability to produce a highly functional, uniform cell-based product for transplantation. Further optimization of differentiation protocols should aim to limit the generation of off-target cell populations and improve the gene expression and chromatin accessibility profiles to match those of human adult islets. These advancements would ideally improve the amount of insulin secreted by SC-b cells and thus reduce the number of cells required per patient. Furthermore, improved transplant survival and a reduced, or eliminated, need for immunosuppressive drugs can be achieved by applying bioengineering strategies. Specifically, using immunomodulating biomaterials or genetically engineered hypoimmune SC-islets could maximize the efficacy of transplanted grafts while minimizing the immune response commonly associated with the transplantation of allogeneic materials. Finally, regulatory standards must be es#tablished to maximize the safety and efficacy of SC-islet transplantation. This includes improving methods for large-scale manufacturing of SC-islets with sufficient quality control characterizations, such as avoiding mutations that pose safety risks, and developing standardized methods for storage and distribution. Additionally, as these challenges are addressed and SC-islet products are improved, guidelines to optimize dosing, transplantation site, and graft survival must be established.

С момента разработки первоначального протокола SC-islet в 2014-2015 гг. 2015,^36-38 был опубликован ряд отчетов, в которых значительно улучшили функцию SCs-клеток и охарактеризовали их созревание. Первым значительным достижением стало установление динамической функции SC-islets.^42,44 Двухфазная секреция инсулина является хорошо известной характеристикой функции островков человека,^62,63 но SCs-островки, полученные в ранних протоколах, не обладали этой особенностью. Обогащенная бессывороточная среда в сочетании с изменением размера кластера с помощью техники диспергирования и агрегации одиночных клеток позволило получить кластеры островков SCs, которые достигли двухфазной кинетики секреции инсулина, напоминающей кинетику островков человека.⁴² Примечательно, что Исключение ингибитора Alk5 II из этой среды значительно улучшило секрецию инсулина. Хотя этот ингибитор необходим на предыдущем этапе эндокринной индукции, преимущества его удаления на последующей стадии созревания убедительно свидетельствовали о том, что TGF-β важен для функционального созревания SCs-клеток. Аналогичным образом, обогащенные β-кластеры (eBCs), образованные путем сортировки INS^GFP+ β-подобных клеток и объединения их в кластеры, продемонстрировали улучшенную функцию.⁴⁴ Эти eBCs состояли исключительно из SCs-производных эндокринных клеток, причем около 90% клеток имели С-пептид+/глюкакон, а остальные экспрессировали несколько гормонов. Дыхательная функция митохондрий, энергетика митохондрий и мембранный потенциал митохондрий во время стимуляции глюкозой свидетельствуют о метаболическом созревании eBCs как факторе улучшения секреции инсулина. Еще одним фактором, способствующим этим улучшениям, является дисперсия отдельных клеток и реагрегации кластеров островков SCs, что способствовало обогащению С-пептид+ эндокринными клетками ^42,47 наряду с сортировкой на основе поверхностного маркера CD49a.⁴⁷

Известно, что трехмерная архитектура островков человека имеет важное значение для реакции на глюкозу и секреции инсулина.⁶⁴ Поэтому , Были разработаны протоколы ранней дифференцировки SCs-клеток с использованием 3D кластеров клеток, либо с самого начала дифференцировки в суспензионной культуре^36,38, либо до эндокринной спецификации на границе воздух-жидкость.³⁷ Интересно, что PDX1+/NKX6-1+ клетки предшественники поджелудочной железы могут быть эффективно сгенерированы из человеческих плюрипотентных SCs (hPSCs) в традиционной планарной культуре, но эти протоколы требовали 3D агрегации клеток для эффективного получения эндокринных клеток из этих клеток предшественников.^37,59 Недавно было обнаружено, что состояние актинового цитоскелета и нижележащие сигналы yes-associated protein (YAP) оказалось жизненно важным для программы клеток предшественников поджелудочной железы.^39,65-67 В частности, полимеризованное состояние цитоскелета в результате культивирования на полистироле для тканевых культур ингибировало NEUROG3-опосредованную эндокринную индукцию в PDX1+/NKX6-1+ клетках предшественников поджелудочной железы.³⁹ Чтобы обойти необходимость в 3D-формате во время эндокринной спецификации, была разработана планарная методология, при которой актиновый цитоскелет был деполимеризован с помощью соединения latrunculin A (LatA) в течение первых 24 ч эндокринной спецификации.³⁹ Этой короткой обработки было достаточно, чтобы инициировать надежную эндокринную спецификацию PDX1+/NKX6-1+ клеток предшественников поджелудочной железы в планарной культуре. Эти дифференцированные эндокринные клетки впоследствии могли рассеиваться с поверхности культуры и объединяться в островок-образные кластеры для использования в последующих анализах. SCs-островки, полученные с помощью этого подхода продемонстрировал улучшенную динамическую секрецию инсулина in vitro и более быстрое обращение вспять тяжелого диабета у мышей по сравнению с клетками, полученными с помощью протокола суспензионной дифференцировки. Важно отметить, что эта планарная методология была также более удобной для для дифференцировки SCs-клеток из широкого спектра линий SCs с различным генетическим фоном.^40,57

Несколько других уникальных подходов были использованы для улучшения функции SCs-клеток. Например, соблюдение строгого цикла feed/fast⁴⁸ Этот график питания запускал ритмичную транскрипцию генов, участвующих в энергетическом метаболизме, а также генов, связанных с синтезом, транспортом и высвобождением инсулина, что привело к улучшению функции SCs-клеток. В ряде исследований модуляция WNT-сигнализации в различные моменты времени в протоколе дифференцировки было показано, что модулирование WNT-сигнализации в различные моменты времени в протоколе дифференцировки улучшает выбор судьбы и созревание эндокринных клеток. В одном из исследований различные субпопуляции дефинитивной эндодермы, полученной из hPSC, демонстрировали обратную активацию канонического и неканонического WNT-сигналинга.⁴⁹ В частности, клетки дефинитивной эндодермы, экспрессирующие CD177, отличались повышенной неканонической WNT-сигнализацией и их тенденцией к дифференцировке в панкреатическую линию, в то время как

Figure 2.

Growth factors and small molecules used during the multistage differentiation of hPSCs to SC-islets.

The generation of SC-islets from hPSCs is a multistage process that involves the temporal application of small molecules and growth factors (highlighted in red). At each stage, specific developmental pathways are targeted to mimic human pancreatic development. While multiple differentiation protocols have been reported, each follows the same general differentiation trajectory by first specifying hPSCs into definitive endoderm using Activin A (AA) and WNT pathway activation, most often with CHIR99021. Next, definitive endoderm cells are guided into a primitive gut tube state using keratinocyte growth factor (KGF), also known as fibroblast growth factor 7 (FGF7). Notably, some protocols include additional compounds that target WNT (e.g., IWP249) and TGF-β signaling pathways to improve primitive gut tube specification. Generating pancreatic progenitor cells requires additional activation of protein kinase C with TPPB and retinoic acid (RA) signaling pathways while simultaneously inhibiting bone morphogenetic protein (BMP) signaling with LDN193189 and sonic hedgehog (SHH) signaling with SANT1. Epidermal growth factor (EGF) and nicotinamide have also been shown to improve the generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors.⁵⁹ Interestingly, it has been reported that the use of a selective bromodomain and extraterminal domain (BET) inhibitor can maintain pancreatic progenitors cells in a proliferative and expandable state.60 This can potentially accelerate SC-islet manufacturing by providing an intermediate point from which to generate SC-islets. During the later stages of SC-islet differentiation, reported protocols begin to diversify both in nomenclature of cell populations and compounds applied. For example, latrunculin A (LatA) has been used to specify endocrine cells in planar culture.39 Additional nomenclature differences arise with some protocols describing the initial SC-islet product as ‘‘immature’’ and include an additional stage to generate ‘‘mature’’ SC-islets using an aurora kinase inhibitor (ZM447439)43 or WNT analogs.⁶¹

экспрессованные клетки повышали уровень каноничеcкой передачи сигналов WNT и определяли судьбу печени. Обработка IWP2, небольшой молекулой ингибитором секреции лигандов WNT, после спецификации эндодермы способствовало развитию панкреатичеcrой линии. Более того, сортировка дефинитивной популяции эндодермы для обогащения CD177+ клеток привела к генерации SCs-клеток с улучшенным созреванием и функцией. В рамках альтернативного подхода к дифференцировке была предпринята попытка воссоздать многоклеточные взаимодействия во время органогенеза поджелудочной железы путем комбинирования SCs, полученных из жировой ткани человека, и эндотелиальных клеток пупочной вены человека с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками человека (hiPSC)-произведенными эндокринными предшественниками в геле на основе полисахаридов.⁶¹ Интересно, что эти многоклеточные сфероиды продемонстрировали, что неканонический WNT-сигналинг стимулировал созревание β-клеток. Добавление экзогенного WNT4 помогло этим островковым органоидам достичь стимулированной глюкозой секреции инсулина, что указывает на необходимость стимулирования неканонической передачи сигналов WNT во время созревания SCs-клеток островков. И наоборот, в другом исследовании было показано, что ингибирование канонической передачи сигналов WNT во время эндокринной дифференцировки улучшает результаты, что еще раз подчеркивает, что тип и время подачи сигнала WNT во время дифференцировки могут радикально влиять на спецификацию и созревание SCs-клеток.⁶⁸

Используя протокол дифференцировки, включающий несколько упомянутых здесь улучшений, был представлен в одном из исследований. Всесторонний анализ SCs-клеток по сравнению с первичными островками человека.⁴³ Эти SCs-клетки развивали надежную динамическую секрецию инсулина in vitro, что соответствует изменениям в архитектуре островков, но без изменений в массе β-клеток. Более того, SCs-β клетки демонстрировали транскрипционное созревание в течение 6 недель и имели правильный профиль ионных каналов и механизм экзоцитоза для поддержки надлежащей секреции инсулина. Аспекты метаболизма глюкозы, однако, отличались в SCs-островках по сравнению с первичными островками человека. В частности, переработка глюкозы была аномальной и не была правильно сопряжена с митохондриальным дыханием, которое обычно является ключевым для канонического запуска секреции инсулина в β-клетках.

Аналогичным образом, в другом сообщении было показано, что дефекты метаболизма глюкозы в клетках SCs-β препятствовали правильному высвобождению инсулина, а не возникали из-за недостатков в механизме экзоцитоза.⁶⁹ Лечение проницаемыми для клеток метаболитами для обхода этого узкого места в гликолизе привело к значительному улучшению секреции инсулина в SCs-островках. Эти исследования подчеркивают, что, хотя SCs-островки нынешнего поколения могут выделять значительное количество инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой in vitro, фундаментальные различия все еще существуют между SCs-островками и первичными островками человека, что приводит к наблюдаемым более низким функциональным показателями SCs-клеток. Следовательно, крайне важно лучше охарактеризовать клетки, полученные с помощью этих протоколов, чтобы обосновать следующее поколение стратегий дифференцировки.

В дополнение к профилированию функциональных характеристик SCs-клеток, изучение недостатков в их экспрессии генов и профиля доступности хроматина может выявить дополнительные взаимодействия сигнальных путей, которые могут быть направлены на дальнейшее улучшение спецификации и созревания линии SC-β клеток. Развитие технологий одноклеточного секвенирования направило исследованиz SCs-клеток на тщательную характеристику их транскрипционного и хроматинового ландшафта. Секвенирование у одиночных клеток РНК (scRNA-seq) стало одним из наиболее широко используемых подходов к секвенированию одиночных клеток, позволяя с высокой пропускной способностью многомерно характеризовать клеточное разнообразие путем транскрипционного профилирования каждой отдельной клетки.⁷⁰ Параллельно с бурным развитием технологии scRNA-seq анализ хроматина, доступного для транспозазы, с помощью секвенирования (ATAC-seq) способствовал надежному и чувствительному эпигеномному на уровне отдельных клеток, технологическому исследованию, ATAC-seq может использовать либо отдельные клетки (scATAC-seq)⁷² , либо отдельные ядра (snATAC-seq).⁷³ Эти технологические достижения позволили по-новому взглянуть на дифференцировку SCs в SCs-островки, это транскрипционно динамичный процесс, который часто приводит к образованию гетерогенных клеточных популяций. Кроме того, мультимодальный анализ с помощью комбинированных scRNA-seq и snATAC-seq с использованием интегративных вычислительных методов позволил еще глубже понять состав и созревание SCs-клеток.

Недавно в двух отдельных исследованиях с помощью scRNA-seq были составлены карты транcrрипционных изменений во время дифференцировки SCs-клеток.^47,50 Несмотря на использование различных плюрипотентных линий SCs и протоколов, в обеих дорожных картах наблюдались хорошо известные маркеры клеток предшественников поджелудочной железы (например, PDX1 и NKX6-1) на средних стадиях дифференцировки, а также маркеры эндокринной идентичности, специфичные для островков, в конечных популяциях клеток (например, INS для β-клеток, GCG для α-клеток, и SST для клеток δ). Эти результаты подтвердили хорошо известные знания об органогенезе поджелудочной железы, которые легли в основу ранних протоколов дифференцировки SCs-клеток. Интересно отметить, что оба scRNA-seq обнаружили значительную диверсификацию клеток после стадии предшественников поджелудочной железы. После секвенирования 40 444 клеток во второй половине дифференцировки SCs-клеток в первом исследовании была обнаружена в основном однородная популяция PDX1+ предшественников в конце стадии 3.⁴⁷ На последующих стадиях высокая экспрессия PDX1 в сочетании с экспрессией NKX6-1 и PTF1A предсказывала потенциал эндокринной индукции. Примечательно, не-эндокринные клеточные популяции протоковых, ацинарных и мезенхимоподобных клеток были получены из популяций, которые сохранили экспрессию генов, связанных с клеточным циклом. Во втором сообщении было секвенировано 87 769 клеток в 12 точках во время дифференцировки линии SCs, которая, как известно, приводит к образованию крайне гетерогенных SCs-клеток.⁵⁰ Используя полусупервизорный метод для построения древа судьбы клеток, было продемонстрировано, что дивергентные клеточных популяций, возникших на ранних стадиях, не вносят существенного вклада в популяции вне мишени, наблюдаемые впоследствии. Напротив, конечные не-эндокринные популяции, не являющиеся мишенями, включая протоковые и панкреатические стеллатоподобные клетки, разветвлялись на стадии предшественников поджелудочной железы. Было выявлено 1 150 эндокринно-специфических генов-переключателей, и было сделано предположение, что 656 пар взаимодействий транскрипционных факторов и генов-мишеней потенциально влияют на эндокринную спецификацию. Следует отметить, что передача сигналов NOTCH через HES1 была включена в качестве движущей силы не-эндокринной судьбы.

Одной из наиболее интересных находок, сделанных с помощью scRNA-seq стало выявление клеток SC-EC, которые отсутствуют в первичных островках человека и напоминают эндокринный тип клеток, которые обычно встречаются в кишечнике.⁴⁷ Эти клетки характеризуются экспрессией маркеров энтерохромаффинных генов, таких как TPH1 и LMX1A, а также секрецией серотонина, а не инсулина. Клетки SC-β и вне-целевые клетки SC-EC, по-видимому, возникают из общей популяции NEUROG3+ предшественников.⁴⁷ Эти клетки были впоследствии идентифицированы в SCs-островках на основе различных протоколов дифференцировки и линий SCs многими группами.^43,50,51 Несмотря на заметные различия в экспрессии генов между SC-EC и SC-β клетками, эти две популяции, по-видимому, имеют относительно схожий общий транcrрипционный профиль. Поскольку клетки SC-EC составляют значительный процент конечной клеточной популяции SCs-клеток, но не секретируют инсулин, эффективность дифференцировки и секреции инсулина SCs-островками в расчете на одну клетку может быть значительно улучшена путем перенаправления клеток в SCs-островки, направив эти SC-EC клетки в линию SC-β клеток на этапах спецификации или созревания клеток.

Чтобы получить дальнейшее представление о природе этих клеток и о решении судьбы линии во время дифференцировки SCs-островков, несколько групп недавно провели snATAC-seq анализ для определения профилей доступности хроматина дифференцирующихся клеток в сочетании с транскрипционными данными, полученными с помощью scRNA-seq. Следует отметить, что эти результаты в настоящее время опубликованы в виде препринтов и все еще находятся на рецензировании в связи с новизной как самого snATAC-seq, так и вычислительных методов, использованных для анализа интегрированных наборов данных scRNA-seq и snATAC-seq. В одном из подходов канонический корреляционный анализ был использован для интеграции данных о доступности хроматина и данных об экспрессии генов из разных клеток in silico для создания псевдоклеток с совпадающей эпигеномной и транскриптомной информацией в дифференцирующихся островках SCs.⁷⁴ В другом исследовании, напротив, сообщалось об одновременном мультиомическом секвенировании РНК, экспрессии РНК и доступности хроматина из одной и той же клетки.⁷⁵ Используя канонические гены-маркеры островковых клеток, оба мультиомных исследования выявили различные популяции, представляющие клетки SCs-β, SCsα, SCs-δ и SCs-EC. Примечательно, что оба исследования также обеспечили большее разрешение клеточной гетерогенности путем описания специфических субпопуляций ожидаемых типов клеток. В частности, в одном из отчетов были выделены две популяции предшественников поджелудочной железы на основе различий в экспрессии NKX6-1 и определили четыре различные эндокринных популяций предшественников, идентифицированных по экспрессии NEUROG3, ARX, LMX1A и RFX3.⁷⁴ Аналогичным образом во втором исследовании были определены две популяции SC-EC на основе комплексного анализа мРНК и хемоструктуры о доступности мРНК и хроматина⁷⁵. В обоих исследованиях был проведен анализ траекторий с помощью программы Monocle3⁷⁶ , чтобы охарактеризовать отбор линий во время дифференцировки SCs-клеток.

Предыдущий анализ только данных scRNA-seq позволил предположить, что SC-β и SC-EC клетки являются различными типами клеток, которые имеют общую линию предшественников во время дифференцировки SCs-клеток in vitro,^47,50 но изучение комбинированных данных экспрессии генов и данных о доступности хроматина для каждой клетки выявило градиент клеточных состояний между SC-EC и SC-β клетками.⁷⁵ В частности, существовали субпопуляции SC-β клеток, которые экспрессируют TPH1, известный маркер клеток SC-EC, и которые имели повышенную доступность сайтов связывания для LMX1A, транскрипционного фактора, связанного с судьбой SC-EC клеток. Они также сообщили о потенциально новой роли транскрипционного фактора ремоделирования хроматина CTCF в регуляции выбора клеточной судьбы в сторону энтероэндокринной линии. Кроме того, в другом исследовании CDX2 был определен как самый ранний транскрипционный фактор, экспрессирующийся во время спецификации линии SCs-EC.⁷⁴ Интересно, что они также сообщили о новой популяции CDX2+ β, популяции клеток предшественников в фетальной поджелудочной железе человека, похожей на клетки SCs-EC, что позволило им предположить, что клетки SCs-EC на самом деле имеют панкреатическое, а не кишечное происхождение. В совокупности эти исследования подчеркивают полезность мультиомного анализа одноклеточных клеток для получения более точного представления об идентичности клеток во время дифференцировки SCs-клеток. Важно отметить, что оба исследования показали, что эпигенетические регуляторы являются важными факторами, определяющими идентичность клеток, в частности при выборе клеточной судьбы между SC-EC и SC-β клетками. Применение технологий секвенирования одиночных клеток не только улучшило наше понимание состава SCs-клеток, но и прояснило транскрипционные и эпигенетические различия между островками, полученными из SCs, и островками взрослого человека. SCs-островки, полученные in vitro, остаются транскрипционно и функционально незрелыми по сравнению с островками взрослого человека.^44,77,78 Мультиомные исследования, описанные здесь, продемонстрировали, что клетки SCs-β менее похожи на своих первичных собратьев, чем другие типы эндокринных клеток, полученных с помощью SCs.^74,75 Более того, доступность хроматина первичных островковых клеток взрослого человека была гораздо более ограничена, чем у SCs-клеток, где ген INS оставался открытым в клетках SC-α и SC-δ в дополнение к клеткам SC-β.⁷⁵

Трансплантация SCs-клеток мышам улучшает их секрецию инсулина и реакцию на глюкозу, это говорит о том, что незрелость SCs-клеток можно устранить.^36,37,41-44 Анализ scRNA-seq трансплантированных SCs-клеток показал, что улучшение функции соответствует транскрипционному созреванию.^43,51 В частности, известные маркеры созревания β-клеток, такие как INS, MAFA, IAPP, MNX1 и G6PC2, стали более высоко экспрессироваться в большей SCs-клеток после трансплантации. Эти транcrрипционные изменения, по-видимому, происходили во времени, поскольку некоторые гены (например, G6PC2) увеличивали экспрессию вскоре после трансплантации, в то время как другим (например, MAFA) потребовалось несколько месяцев для повышения экспрессии. Интересно, что клетки SC-EC также сохранялись после трансплантации и демонстрировали повышенную экспрессию ключевых генов, маркеров их идентичности, таких как ^TPH1.^51,75 Несмотря на транскрипционные улучшения, SCs-клеток, тем не менее, имели значительно сниженную активность метаболических путей по сравнению с первичными островками.⁴³ Более того, мультиомический анализ выявил более 600 генов, 350 промоторных областей и 250 мотивов, связывающих транскрипционные факторы, которые увеличились через 6 месяцев in vivo, в то время как только небольшая часть из них также увеличилась во время созревания in vitro.⁷⁵ Эти результаты позволили предположить, что длительное пребывание в естественных условиях приводит к открытию областей хроматина, связанные с клеточной идентичностью и созреванием, в то время как методы культивирования in vitro оставались относительно неэффективными в плане содействия тому же эффекту созревания. В целом, сравнение данных scRNA-seq и snATAC-seq трансплантированных SCs-клеток и первичных островков показало, что SCs-островки становятся более похожими на человеческие островки с течением времени in vivo как в плане транскрипционного профиля, так и в плане доступности хроматина хотя некоторые важные различия все еще остаются. Эти стратегии для высоко детальной характеристики клеток SCs будут иметь неоценимое значение для выяснения механизмов, управляющих развитием островков и факторов, которые в настоящее время ограничивают дальнейшее созревание SCs-клеток.

Как и при трансплантации любого аллогенного материала, пересаженные SCs-клетки становятся мишенью иммунной системы хозяина, что приводит к отторжению трансплантата. Дополнительным осложнением является то, что T1D сам по себе является аутоиммунным заболеванием, мишенью которого являются именно β-клетки. Таким образом, даже если аутологичные SCs-островки будут получены от пациентов с использованием iPSC, возможно, что они все равно станут мишенью для иммунных клеток. Этот вопрос в настоящее время решается с помощью иммуносупрессивных препаратов, которые используются при трансплантации целых органов, и назначаемые в последние годы препараты улучшились.⁷⁹ Хотя эти препараты могут успешно сохранять жизнеспособность трансплантата, они также могут иметь серьезные побочные эффекты, включая повышенный риск инфекций и рака, а также менее серьезные, но дискомфортные симптомы.^80,81 Для многих пациентов эти неблагоприятные побочные эффекты могут не перевешивать преимущества повышенного гликемичского контроля, и поэтому в настоящее время было проведено множество исследований, посвященных альтернативным методам защиты пересаженных клеток от иммунной системы хозяина.

Одним из наиболее изученных подходов является инкапсуляция клеток в биоматериал с тонко настроенными размерами пор, которые позволяют диффузию малых молекул, таких как глюкоза и инсулин, но при этом защищают пересаженные SCs-островки от контакта с иммунными клетками хозяина. Эта область развивается уже несколько десятилетий и и тщательно рассмотрена в других работах,^52,53,82,83. Здесь мы сосредоточимся на нескольких недавних примерах, чтобы подчеркнуть текущее состояние этих технологий. В стратегии макрокапсулирования в одно устройство помещается множество островков.⁸⁴ Такие устройства для инкапсуляции чаще всего состоят либо из полимерной пленки, такой как polytetrafluoroethylene (PTFE), или alginate гидрогеля благодаря их отличной биосовместимости и простоте изготовления. Мембрана устройства и не только обеспечивает защиту от контакта с иммунными клетками хозяина, но и предотвращает распространение клеток трансплантата в другие части тела, за счет нежелательного роста клеток или образования опухоли. Кроме того, устройство можно легко извлечь, если после трансплантации возникнут какие-либо другие проблемы, связанные с безопасностью или эффективностью. Один из популярных вариантов макрокапсулирования островков - коммерчески доступное устройство TheraCyte, которое состоит из внутренней PTFE-мембраны толщиной 0,4 мМ, блокирующей проникновение иммунных клеток хозяина, и внешней 5µМ PTFE мембраны, которая способствует васкуляризации вокруг трансплантата. Хотя эти устройства успешно предотвращают открытое иммунного отторжения ткани поджелудочной железы, ^85-88 эти устройства могут быть ограничены из-за отсутствия надлежащего обмена питательными веществами, особенно до тех пор, пока как показали клинические испытания ViaCyte с подобными устройствами^33,34, а также другие исследования,^90,91 эти устройства макрокапсулирования могут также способствовать развитию фиброза вокруг имплантата, что еще больше препятствует диффузии питательных веществ.^84,92 В настоящее время разрабатываются новые системы для решения этих проблем, связанных с доставкой питательных веществ. Например, устройство макрокапсулирования из PTFE, которое активно прокачивает жидкость через полые волокна, проходящие через его центр, продемонстрировало улучшенный обмен питательными веществами, что способствовало выживанию клеток и позволило увеличить плотность клеток, успешно загружаемых в устройство.⁹³ Секреция инсулина и контроль уровня глюкозы в крови также были улучшены при пересадке клеток крысам-диабетикам, также повышалась секреция инсулина и контроль уровня глюкозы в крови. Интересно, что они также наблюдали уменьшение фиброзной реакции при использовании активного потока жидкости.

Несмотря на то, что для замены внешнего насоса, используемого для перфузии устройства после имплантации, это исследование подчеркивает, что использование активного потока жидкости, а не пассивной диффузии для транспортировки питательных веществ, может значительно повысить жизнеспособность и работоспособность островков в макрокапсульном устройстве.^93,94 Поскольку кислород является одним из наиболее важных из этих питательных веществ для метаболически активных клеток, существует несколько систем доставки кислорода и материалов, генерирующих кислород. Несколько систем доставки кислорода и материалов, генерирующих кислород, были включены в конструкции устройств для инкапсуляции.^91,95,96 В одном из последних вариантов CaO₂ был интегрирован в полидиметилсилоксановую (PDMS) плиту, которая была заключена в агарозный гидрогель, содержащий островки.⁹⁷ CaO₂ реагировал с водой в гидрогеле, вырабатывая кислород, который становился доступным для окружающих клеток. В другом примере частицы Li₂O₂ были суспендированы в перфторуглеродном масле и заключены в силиконовые трубки.⁹⁸ Это ядро было окружено альгинатным гидрогелем, содержащим островки. На месте Li₂O₂ вступал в реакцию с отходами CO₂, образующимися в процессе клеточного дыхания, и генерировал O₂, в результате чего внутри гидрогеля образовывался само-поддерживающийся источник кислорода, количество которого ограничивалось только количеством Li₂O₂ в устройстве. В обоих примерах кислород, генерируемый устройством, значительно повышал жизнеспособность и функциональность островков после трансплантации.

Один из методов пассивного изменения транспорта питательных веществ заключается в управлении геометрией устройства. Например, сеть взаимосвязанных гидрофобных каналов внутри заполненного островками альгинатного гидрогеля, заполненного островками, значительно увеличила диффузию кислорода в устройство из окружающей ткани.⁹⁹ Такая конструкция значительно повысила выживаемость островков при трансплантации мышам-диабетикам и позволила увеличить толщину устройства до 6,6 мм. В качестве альтернативы можно увеличить отношение поверхности к объему и уменьшение расстояния клеток от внешней поверхности устройства может способствовать лучшему переносу массы к инкапсулированным клеткам. Например, прочная полимерная нить была покрыта тонким альгинатным гидрогелевым слоем, содержащим островки, создавая длинное нитевидное устройство с высоким отношением поверхности к объему.¹⁰⁰ Крысиные островки, инкапсулированные в устройство, смогли выжить и остановить развитие диабета у иммунокомпетентных людей и обращать вспять диабет у иммунокомпетентных мышей-диабетиков. Для дальнейшего улучшения механической прочности своей концепции устройства они разработали альтернативный дизайн, в котором альгинатный гидрогель помещался внутри иммунозащитной трубки, состоящей из прочной нановолоконной сетки, которая была изготовлена электронами из медицинского термопластичного силикон-поликарбонат-уретана.¹⁰¹

Эта концепция управления геометрией устройства для улучшения транспортировки питательных веществ может быть расширена до уровня инкапсуляции отдельных островков в стратегии, известной как микроинкапсуляция. В одном из популярных подходов используются альгинатные микрокапсулы, а также различные их варианты⁸³. Интересно, что при уменьшении размера устройств микрокапсул для инкапсуляции до размеров отдельных островков увеличивает диффузию питательных веществ вскоре после трансплантации по сравнению с макрокапсулирующими устройствами, было показано, что меньшие размеры капсул также вызывают сильную реакцию на инородное тело и последующий фиброз.¹⁰² В связи с этим в последнее время были проведены замечательные работы по изменению химии поверхности капсул, в результате чего они стали более эффективными. В связи с этим в последнее время были проведены отличные работы по изменению химического состава поверхности этих микрокапсул, чтобы минимизировать фиброзный ответ. Например, в результате комбинаторный анализ биоматериалов выявил три различных триазолсодержащих ковалентные модификации альгината, которые значительно снижают реакцию на инородное тело как у грызунов, так и у нечеловеческих приматов.¹⁰³ Одна из этих формул, триазол-тиоморфолин диоксид альгината, был использован для инкапсуляции SC-β клеток внутри 1,5-миллиметровых сфер.⁴¹ Такие инкапсулированные клетки восстанавливали гликемический контроль у диабетических, иммунокомпетентных мышей в течение как минимум 174 дней без каких-либо признаков фиброза. Впоследствии было показано, что эта формула предотвращает фиброз и способствует выживанию клеток аллогенных островков у не-человекообразных приматов.¹⁰⁴ Другая группа добавила цвиттериоиновую модификацию в альгинатные микрокапсулы, чтобы значительно уменьшить фиброз благодаря своей способности противостоять адсорбции белка и прикреплению клеток.¹⁰⁵ Затем они объединили эту цвиттерионную концепцию с ранее открытой триазоловой модификацией для дальнейшего улучшения способности альгинатных микрокапсул противостоять фиброзу, а также повысить их механическую стабильность.¹⁰⁶ Эти исследования с использованием модифицированных альгинатных химикатов указывают на интересный сдвиг в мышлении, при котором биоматериал рассматривается не только как физический барьер, препятствующий проникновению иммунных клеток, но и скорее как источник обучающих сигналов, вызывающих местную иммунную толерантности, либо за счет высвобождения молекул в качестве системы доставки лекарств, либо за счет наличия биофункциональной иммуномодулирующей поверхности⁵³. Направленные только на область, непосредственно окружающую имплантата, эти стратегии могут повысить эффективность желаемой иммунной модуляции, одновременно избегая системных побочных эффектов. Например, альгинатные микрокапсулы, изготовленные для высвобождения иммуномодулирующего хемокина CXCL12, улучшили выживаемость инкапсулированных SCs-островков и уменьшили фиброзную реакцию у мышей.¹⁰⁷

Аналогичным образом, альгинатные микрокапсулы, созданные для высвобождения экзосом, полученных из мезенхимных SCs пуповины, вызывают местную иммунную толерантность, изменяя сигналы неcrольких иммунных клеток.¹⁰⁸ Включение ингибитора CSF1R GW2580 в кристаллизованной форме в альгинатные микрокапсулы позволило контролировать его высвобождение в течение длительного времени, что привело к долгосрочному уменьшению фиброза и значительному улучшению результатов трансплантации островков у мышей, даже в подкожном пространстве.¹⁰⁹ В альтернативном подходе иммуномодулирующие белки, такие как лиганд программируемой гибели 1 (PD-L1) или лиганд Fas (FasL), могут быть иммобилизованы на поверхности биоматериалов, для подавления местного адаптивного иммунного ответа Т-клеток. Оба эти белка играют важную роль в иммунной толерантности, поскольку связывание PD-L1 с PD-1 на эффекторных Т-клетках снижает их пролиферацию и выработку цитокинов, а связывание FasL с рецептором Fas вызывает апоптоз Т-клеток. С этой целью PD-L1¹¹⁰ или белки FasL^111,112 были иммобилизованы на поверхности поли-этиленгликолевых микрогелей, которые затем смешивали с аллогенными островками и совместно трансплантировали мышам^110,111 или не-человеческим приматам.¹¹² В сочетании с преходящим рапамицином, эти функционализированные микрогели значительно улучшили выживаемость островков без необходимости длительной иммуносупрессии или инкапсуляции.

Эта концепция индуцирования местного иммунитета может быть продолжена еще дальше, создав инженерию, позволяющую самим пересаженным клеткам скрываться от иммунной системы. Отказ от использования биоматериалов полностью устраняет диффузионные барьеры, присущие системам инкапсуляции, а также позволяет обойти индуцированную биоматериалами фиброзную реакцию. Например, изолированные мышиные островки были сконструированы таким образом, чтобы транзиторно отображать FasL на своей поверхности^113,114 Аллотрансплантаты могли выживать неограниченно долго, если в течение первых 15 дней их также лечили рапамицином, в то время как трансплантаты без FasL отторгались в течение 30 дней. Они продемонстрировали, что FasL индуцирует местную иммунную толерантность, вызывая апоптоз в аллореактивных Т-клетках, а также способствуя развитию регуляторных Т-клеток (Tregs) для долгосрочного поддержания толерантности. Системная иммунная толерантность была дополнительно подчеркнута трансплантацией второго набора не-модифицированных, соответствующих донору клеток, которые выжили при пересадке в исходное место трансплантации, но были отторгнуты при трансплантации в другую почку той же мыши. В другом примере мезенхимные стромальные клетки были сконструированы с использованием лентивирусного вектора для избыточной экспрессии PD-L1 и иммуноглобулина 4, антигена цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4-Ig). Эти измененные генами клетки были ко-трансплантированы с аллогенными островками мыши, что позволило подавлять диабет значительно дольше, чем без генетических модификаций¹¹⁵. Эти вспомогательные мезенхимные стромальные клетки уменьшали инфильтрацию CD4+ и CD8+ эффекторных Т-клеток и увеличили количество Tregs, чтобы вызвать местную иммунную толерантность. Эта стратегия PD-L1 была продвинута еще дальше путем прямой избыточной экспрессии PD-L1 в островок-подобных органоидах, созданных из hiPSCs с помощью лентивирусной системы.⁶¹ Было обнаружено, что эти сконструированные клетки обходят иммунную систему как у иммунокомпетентных мышей, так и в гуманизированной мышиной модели. Иммунный ответ на аллогенный материал, приводящий к отторжению трансплантата является сложным, так как в нем участвуют многочисленные типы клеток и путей. Основной причиной отторжения при аллогенной трансплантации является распознавание Т-клетками антигенов лейкоцитов человека (HLA). Молекулы HLA I класса A, B и C присутствуют на всех нуклеиновых клетках и представляют антигены для цитотоксических Т-клеток CD8+, в то время как белки HLA класса II активируют хелперные Т-клетки CD4+. Таким образом, одна из успешных стратегией устранения опосредованного Т-клетками адаптивного иммунного ответа против аллогенного материала является это удаление HLAs из трансплантированных клеток, чтобы они не могли активировать Т-клетки хозяина. Удаление HLA из клеток, однако, приводит к тому, что они становятся мишенью для клеток врожденной иммунной системы, таких как естественные клетки-киллеры (NK) и макрофаги. Поэтому существуют различные стратегии для одновременного устранения как адаптивных так и врожденных иммунных реакций. Например, недавно было сообщено, что одного PD-L1 недостаточно для защиты от ксено- и аллореакции в трансплантированных островках SCs-клеток.⁵⁴ Вместо этого было сообщено, что истощение HLA способствовало улучшению выживаемости клеток. Чтобы еще больше повысить выживаемость этих трансплантированных клеток, SCs-островки были сконструированы таким образом, чтобы выделять несколько факторов, вызывающих местную иммунную толерантность, включая IL-2, мутеин для содействия экспансии Treg, а также IL-10 и TGF-β, способствующие иммуносупрессивной функции Tregs. Эти клетки обратили вспять диабет и сохраняли жизнеспособность в течение как минимум 8 недель в мышиной модели аутоиммунного диабета. Избыточная экспрессия CD47 также была успешно применена для смягчения врожденных иммунных реакций после удаления HLA.¹¹⁷ С помощью системы CRISPR-Cas9 в iPSCs человека были удалены гены b2-микроглобулина (B2M) и CIITA, чтобы удалить молекулы HLA I и II классов, соответственно, а лентивирусный вектор использовался для индукции избыточной экспрессии CD47. Эти отредактированные генами iPSC могли дифференцироваться в эндотелиальные клетки и кардиомиоциты, которые продемонстрировали длительное выживание в гуманизированных мышиных моделях без какой-либо иммуносупрессии.

В рамках другой стратегии система CRISPR-Cas9 была использована для избирательного удаления HLA-A, B и C в hPSCs, а молекулы HLA класса II были удалены путем нацеливания на ген CIITA¹¹⁸. Параллельно с этим CRISPR-Cas9 использовали для избыточной экспрессии PDL1 для дальнейшего подавления Т-клеток, HLA-G для модуляции NK-клеток и CD47 для подавления макрофагов. Эти клетки могли быть дифференцированы в эндотелиальные клетки или сосудистые гладкомышечные клетки и демонстрировали повышенную выживаемость в совместных культурах с Т-клетками, NK-клетками и макрофагами. Аналогично, система CRISPR-Cas9 была использована для удаления всех генов HLA-A, B и C в hPSCs, за исключением HLA-A2, что помогло сохранить экспрессию HLA-E.⁵⁵ Важно отметить, что экспрессия HLA-E в hPSCs подавляет уничтожение с помощью NK-клеток.¹¹⁹ Кроме того, молекулы HLA класса II также были элиминированы путем удаления гена CIITA. Эти hPSCs могли дифференцироваться в SCs-островки, которые демонстрировали защиту от Т-клеточного отторжения и снижение иммунного ответа NK аллогенных гуманизированных мышей.⁵⁵ И наконец, в рамках уникального подхода, scRNA-seq и CRISPR скрининга SCs-клеток, трансплантированных в гуманизированную мышиную модель, показали, что SCs-островки повышали регуляцию генов интерферона (IFN) во время отторжения трансплантата.¹²⁰ Нокаут CXCL10, который индуцируется сигналом IFN, как оказалось, необходим для раннего IFN-запуска нокаута CXCL10 и, как оказалось, необходим для раннего IFN-триггерного иммунного ответа в трансплантированных SCs-островках, и улучшал выживаемость при аллогенной трансплантации у гуманизированных мышей.

Ранние исследования первичной трансплантации островков человека⁵⁶ и исследования на животных^121,122 показали, что 50% или более островкового трансплантата теряется в течение первых нескольких дней после трансплантации. Из-за такой значительной потери клеток сразу после трансплантации, была использована большая масса островков от нескольких доноров органов и нескольких вливаний.¹²³ Кроме того, первичные островки часто демонстрировали прогрессирующее функциональное снижение в течение нескольких лет после трансплантации, что вынуждало пациентов возобновлять инъекции экзогенного инсулина. Достижения в области методологии выделения островков, иммунотерапии и методов трансплантации улучшили результаты трансплантации островков в последние годы, улучшив показатели 5-летней инсулин-независимости до 50%-80%.²³ В частности, количество островковой массы, которая теряется сразу после трансплантации, сократился ближе к 25%, и, таким образом, для достижения инсулиновой независимости требуется меньшее количество островков.^79,124 Поиск новых способов дальнейшего решения проблемы острых стрессовых факторов, испытываемых островками сразу после трансплантации, может еще больше снизить степень потери и дисфункции β-клеток, которые препятствуют долгосрочному восстановлению нормогликемии.¹²⁵

В связи с высокими метаболическими требованиями, связанными с выработкой и секрецией инсулина, β-клетки особенно восприимчивы к стрессу. Нарушения нормального метаболизма и условий окружающей среды могут вызывать стресс эндоплазматического ретикулума (ER) и инициировать unfolded protein response (UPR).¹²⁶ Хотя этот путь направлен на восстановление гомеостаза белков в условиях легкого стресса, он будет вызывать апоптоз, если стресс будет более серьезным. Воспалительные цитокины, гипоксия и гипергликемия могут вызывать ER стрессовую реакцию в β-клетках, которая приводит к клеточной дисфункции и апоптозу.^126-128 Считается, что этот стрессовый ответ участвует в прогрессировании как T1D, так и диабета 2 типа (T2D).¹²⁹ Гипоксические условия и окислительный стресс могут также индуцировать другие стрессовые пути, которые приводят к функциональной недостаточности и β-клеток и к апоптозу.^130-133 Стресс, вызванный высоким содержанием глюкозы, может вызвать снижение регуляции ключевых островковых генов и снижение функции островков человека¹³⁴ и животных моделей,¹²² это указывает на то, что адекватный контроль глюкозы важен для здоровья островковых β-клеток сразу после трансплантации. Кроме того, хотя SCs-островки, как правило, более устойчивы к стрессу, чем изолированные первичные островки¹³⁵ , они, тем не менее, реагируют на воспалительные цитокины с помощью аналогичных путей стрессовой реакции¹³⁶, что подчеркивает необходимость смягчения воздействия воспаления во время трансплантации. Родные островки сильно васкуляризированы в поджелудочной железе и получают необходимые питательные вещества и большое количество кислорода, что необходимо для производства и секреции большого количества инсулина. Поэтому при первичной трансплантации островков используют воротную вену для введения островков, чтобы обеспечить адекватное начальное кровоснабжение. Одним из последствий такого прямого контакта с кровью является иммунный ответ, называемый мгновенной опосредованной кровью воспалительной реакцией (IBMIR).^137-139 В течение 15 минут после контакта с кровью хозяина островки оказываются инкапсулированными в слое тромбоцитов, что уменьшает диффузию питательных веществ. Кроме того, лейкоциты проникают в островки в течение часа, это приводит к гибели клеток. Считается, что одной из основных причин гибели островков, наблюдаемой сразу же после инфузии островков в портальную вену, является IBMIR. Эта начальная клеточная гибель трансплантированных клеток может также вызвать высвобождение молекул, которые инициируют другие иммунные реакции, что еще больше усугубляет проблему, заставляя другие трансплантированные клетки проявлять стрессовые реакции.^140,141

Успешная стратегия трансплантации SCs-клеток должна адекватно реагировать на эти стрессовые факторы, особенно на те, которые связанны с гипоксией, недостатком питательных веществ и воспалением сразу после процедуры трансплантации. Как и при первичной инфузии островков, трансплантация SCs-клеток мышам продемонстрировала, что значительная часть клеток может погибнуть вcrоре после трансплантации из-за синергетического эффекта лишения питательных веществ и гипоксии.¹⁴² Соответственно, многие попытки решить эту проблему были направлены на модуляцию среды трансплантата путем оптимизации места трансплантации и стимулирования васкуляризации. У людей было предложено несколько альтернативных мест в печени для трансплантации¹⁴³ , включая подкожное пространство¹⁴⁴ , внутримышечное пространство¹⁴⁵ и сальник.^146,147 Эти места требуют менее инвазивной процедуры трансплантации и обеспечивают более легкий доступ к трансплантату, что позволяет наблюдать за ним и, возможно, удалять его в случае возникновения проблем. Эти альтернативные места также потенциально могут обойти интенсивную реакцию IBMIRР, которая наблюдается при инфузии в воротную вену.¹⁴⁸ Однако на сегодняшний день эти альтернативные места еще не привели к улучшению результатов трансплантации по сравнению с инфузией в воротную вену у людей.¹⁴⁸

При трансплантации SCs-клеток, как было показано, влияют место и доза на эффективность лечения у мышей, причем расположение под высоко васкуляризированная капсулой почки дает гораздо лучшие результаты, чем при подкожных введениях.^142,149 Аналогичным образом, у мышей результаты трансплантации SCs-клеток в микрокапсулах во внутрибрюшинную полость были более благоприятными, чем в подкожном пространстве из-за гораздо меньшей фиброзной реакции.¹⁰¹ У не-человекообразных приматов трансплантация SCs-клеток между прямой мышцей живота в брюшной полости и окружающей ее оболочкой продемонстрировала лучшую выживаемость клеток , чем при внутримышечном или подкожном расположении.⁴⁶ Кроме того, такое расположение способствовало мощной васкуляризации к 12-й неделе и способствовало созданию среды, благоприятной для созревания SCs-клеток. После того как выбрано оптимальное место пересадки, чтобы минимизировать первоначальную потерю клеток, можно применить другие стратегии для дальнейшего усиления васкуляризации и транспорта питательных веществ. Например, имплантация устройства в подкожное пространство за 1 месяц до трансплантации клеток, предварительно васкуляризировав место трансплантации и избежав задержки в несколько недель, требуемых для васкуляризации.^144,150 Включение фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в подобную стратегию предварительной васкуляризации или трансплантация островков в гидрогели, высвобождающие VEGF¹⁵², как было показано, еще больше улучшает формирование сосудов. Кроме того, островки, помещенные в субмиллиметровые коллагеновые цилиндры, покрытые эндотелиальными клетками¹⁵³, или островки, объединенные с фрагментами микрососудов¹⁵⁴, как было продемонстрировано, быстро васкуляризируются и соединяются с сосудистой сетью хозяина при трансплантации грызунам. Трансплантация островков с периваскулярными клетками пуповины человека¹⁵⁵ или амниотическими эпителиальными клетками¹⁵⁶ также улучшали приживление и васкуляризацию островков. Чтобы специально повысить уровень кислорода в месте трансплантации, кислородные материалы, генерирующие кислород, были введены рядом с островковым трансплантата,^95,97,98 в то время как другая стратегия напрямую закачивает кислород в инкапсулирующее устройство.^91,96

В отличие от модуляции среды трансплантации, сами SCs-островки могут быть изменены, чтобы сделать их более устойчивыми к различным стрессовым факторам. Например, для повышения устойчивости SCs-клеток к низким уровням кислорода после трансплантации, SCs дифференцировали в гипоксических условиях.¹⁴² Трансплантация этих предварительно кондиционированных SCs-клеток в сочетании с дополнительными аминокислотами для смягчения последствий питательной депривации резко улучшила выживаемость SCs-клеток в течение первых нескольких недель, подчеркивая, как вмешательства, направленные на клетки, могут улучшить результаты трансплантации. Один из уникальных подходов заключается в генетической инженерии SCs-клеток, развивающих устойчивость к различным стрессовым факторам, которая до недавнего времени была практически не изучена в контексте SCs-клеток. Например, SCs-островки, дифференцированные из iPSCs, полученных от пациента с синдромом Вольфрама, который характеризуется ER-стрессом, демонстрировали плохую функцию и повышенные стрессовые реакции.⁴⁰ Исправление этого патогенного варианта, вызывающего стресс, с помощью CRISPR-Cas9, однако, позволило этой линии iPSC генерировать высоко функциональные SCs-клетки, которые были способны быстро обратить вспять тяжелый диабет у мышей, демонстрируя, что стратегии редактирования генов могут быть использованы для смягчения стрессовых реакций. Кроме того, в одном из недавних исследований нормальные стрессовые реакции в SCs-островках были изменены, чтобы сделать их более устойчивыми к условиям трансплантации¹³⁵. В частности, SCs-островки демонстрировали дисфункцию, апоптоз и повышенную экспрессию генов, связанных со стрессом и иммунным взаимодействием, при воздействии различных стрессовых факторов, включая смесь цитокинов, имитирующих воспалительный стресс, тапсигаргин, вызывающий стресс ER и высокий уровень глюкозы, воспроизводящий метаболический стресс. Лентивирусный нокдаун shRNA XBP1, CDKN1A, NLRC5 и B2M снижал уровень апоптоза в островках SCs при обработке этими стрессорами, а также снижал экспрессию генов, связанных со стрессовыми реакциями и иммунным взаимодействием. Кроме того, нокдаун этих генов снижал уровень активации Т-клеток и Т-клетками индуцированного апоптоза при совместном культивировании SCs-клеток с мононуклеарными клетками периферической крови.

Дифференцировка hPSCs до SCs-клеток создает потенциальные проблемы для обеспечения их безопасности после трансплантации. Хотя оптимизированные протоколы, используемые на исследовательских клеточных линиях, часто позволяют избежать этих проблем на животных моделях, особая осторожность требуется при преобразовании протоколов и клеточных линий для клинического использования у людей. В частности, не все линии SCs дифференцируются с одинаковой эффективностью при использовании современного поколения протоколов дифференцировки SCs-клеток.⁵⁷ Углубленная характеристика состава и геномной гетерогенности особенно важна, в частности, для выявления субпопуляций, которые могут неконтролируемо пролиферировать. Учитывая плюрипотентную природу этих SCs и сложность процесса дифференцировки, существует риск того, что клетки могут дифференцироваться в непредусмотренные или опасные типы клеток, не являющиеся целевыми. В контексте дифференцировки в SCs и клетки островков SCs-EC являются одной из наиболее распространенных "не-целевых" клеток. К счастью, хотя они могут негативно влиять на потенцию SCs-клеток⁴⁷, о проблемах безопасности не сообщалось. Клетки печени, мезенхимы и поджелудочной железы, экзокринные клетки поджелудочной железы также являются возможными внеклеточными мишенями, о которых сообщалось при дифференцировке SCs-клеток.^47,51,75 Наибольшую озабоченность вызывает возможность высоко пролиферативных не-детерминированных предшественников или остаточных hPSCs, которые могут образовывать опухоли.^157-159 Было показано, что обеспечение экспрессии в популяции предшественников поджелудочной железы гликопротеина GP2, предотвращает образование опухоли после трансплантации, что позволяет предположить, что опасные популяции клеток в конечном клеточном продукте потенциально могут быть выявлены на более ранних стадиях дифференцировки.¹⁶⁰ Дополнительные усовершенствования в методике дифференцировки могут помочь исключить выделение таких клеток. Дополнительные усовершенствования методологии дифференцировки могут помочь устранить спецификацию этих не-целевых типов клеток в клеточных линиях клинического класса. Кроме того, тщательная характеристика конечного клеточного продукта SCs-островков с помощью проточной цитометрии и технологий секвенирования одиночных клеток может выявить дифференцировочные партии, которые генерируют потенциально опасные не-целевые типы клеток, такие как не фиксированные или высоко пролиферативные клетки, чтобы гарантировать, что эти проблемные популяции клеток не будут пересаженыь пациентам.

Накопление небезопасных генетических вариаций, в частности онкогенных мутаций, в конечном клеточном лекарственном продукте может представлять значительный риcr для безопасности трансплантации SCs-клеток. Например, клиническое исследование в Японии по лечению макулярной дегенерации было приостановлено из-за генетических вариаций.¹⁶¹ Вариации могут быть получены в результате стандартного культивирования клеток и их перепрограммирования.¹⁶² Утрата функции белка р53 характерна для большинства видов рака,¹⁶³ а шесть специфических вариантов TP53 были идентифицированы в нескольких линиях hPSCs.¹⁶⁴ Кроме того, в hPSCs наблюдаются многочисленные кариотипические аномалии.¹⁶⁵ Значительные геномные вариации также наблюдались в hiPSCs,¹⁶⁶ особенно в отношении мутаций BCOR, которые вовлечены во многие виды рака. ¹⁶⁷ Еще больше усложняет эту проблему то, что перепрограммирование и генная инженерия сами по себе также были связаны с увеличением геномных вариаций.^168-170 Поэтому очень важно проверить геномный статус клеток критических этапах разработки продукта, например, после перепрограммирования, генетического редактирования, создания банка мастер-клеток и создания конечного клеточного продукта. Дополнительной мерой предосторожности при терапии SCs-островками является введение предохранительного выключателя для уничтожения трансплантата в случае неблагоприятного исхода. Часто они принимают форму индуцибельного гена, кодирующего белок, который убивает клетку, например, индуцибельная каспаза-9171 или конструкции, индуцирующие пролиферацию.¹⁷² Это позволяет точно контролировать время и продолжительность терапевтического эффекта для повышения безопасности и эффективности. Такие переключатели безопасности скорее всего, будут особенно важны при разработке стратегий гипоиммунных SCs-клеток, поскольку клетки специально разработаны так, чтобы скрываться от иммунной системы и и не могут быть легко извлечены.

Разработка крупномасштабной и экономически эффективной методики производства дифференцированных SCs-клеток будет необходима для того, чтобы сделать эту терапию доступной для значительного числа пациентов.¹⁷³ В то время как 2-5 х10⁶ SCs-клеток достаточно, чтобы обратить вспять гипергликемию у мышей,¹⁴⁹ необходимая доза для людей в настоящее время неизвестна и и зависит от качества SCs-клеток. Если предположить, что доза будет такой же, как человеческих островков от умерших доноров,^174,175, то потребуется порядка 10⁹ клеток на одного пациента. Даже относительно скромное количество пациентов (около 1000) потребует порядка триллиона клеток. Современные подходы к дифференцировке столкнутся с трудностями в достижении таких объемов производства. Протоколы дифференцировки SCs-клеток, которые полностью выполняются в суспензионной культуре³⁶ , выигрывают за счет естественного трехмерного масштабирования этих систем. Крупномасштабные (более 1 000 л) биореакторы для культуры клеток млекопитающих в биотехнологической промышленности используются уже несколько десятилетий.¹⁷⁶ Примечательно, что такие биореакторы позволяют в режиме реального времени отслеживать критические параметры процесса, такие как растворенный кислород, что очень важно для контроля качества при крупномасштабном производстве. Однако до сих пор такие крупные масштабы не были распространены для hPSCs, и самая крупная дифференцировка SCs и островков, о которой сообщалось в литературе, была проведена в 500-мл магнитных колбах.³⁶ Фундаментальная проблема масштабирования дифференцировки hPSCs в суспензионной культуре заключается в конвекции жидкости в суспензионной культуре, которая необходимая для дифференцировки hPSCs, для чего требуются либо микроносители, либо культура в агрегатах.¹⁷⁷ Очень важно, что PSCs чувствительны к механическим воздействиям,^178,179 и изменениям напряжения сдвига, связанным с увеличением объема реактора, а также скорости и размера, которые потребуют тщательной оптимизации. Изменения этих механических сил могут изменить важнейшие решения в судьбе клеток в определенные моменты протокола дифференцировки, когда клетки очень чувствительны к внешним сигнальным возмущениям. В качестве альтернативы в некоторых вариантах протоколов SCs-излечения используется гибридный подход, который использует традиционную планарную культуру частично или полностью для всего процесса дифференцировки и только на более поздних этапах он объединяет клетки в кластеры. Например, в одной из популярных методик используется планарная культура для получения PDX1+ /NKX6-1+ предшественников поджелудочной железы, а затем объединяет клетки в кластеры на границе воздух-жидкость для индукции эндокринной активности и созревания β-клеток.³⁷ Хотя этот протокол способен надежно генерировать функциональные SCs-островки в лабораторных условиях, эту систему культуры с воздушно-жидкостным интерфейсом будет трудно адаптировать к крупномасштабному производству. В отличие от этого другой подход позволяет полностью дифференцировать SCs-клеток в плоcrой культуре. ^39,57 Эндокринные клетки затем рассеиваются по одной клетке с поверхности культуры и объединяются в островок-образные кластеры в суспензионной культуре. Эта гибридная методология может столкнуться с меньшими проблемами с оптимизацией, чем при использовании иcrлючительно суспензионной культуры при масштабировании. В частности, было показано, что этот подход к дифференцировке островков в SCs пропорционален площади площади поверхности культуры,⁵⁷ и потенциально может быть увеличен еще больше, используя стеки клеток или гиперфляжные установки. Важно отметить, что такие параметры, как напряжение сдвига, которые могут влиять на клеточную сигнализацию на ранних стадиях дифференцировки, не изменяются в планарной культуре при увеличении площади поверхности. Как только клетки дифференцируются, то после превращения в эндокринные клетки они становятся менее восприимчивыми к механическим индуцированным сигнальным изменениям, что облегчает переход к суспензионной культуре для финального этапа агрегации. Было показано, что данная методология позволяет получить больше клеток на единицу объема среды, чем при использовании полностью суспензионного метода⁵⁷ , это является важным поскольку многие факторы дифференцировки являются дорогостоящими. Кроме того, было показано, что этот подход более удобен для дифференцировки широкого спектра линий SCs,⁵⁷ что может оказаться важным при адаптации данного протокола к клеточным линиям клинического уровня. Хотя эта гибридная методология, по-видимому, имеет ряд преимуществ, на практике еще предстоит выяснить, будет ли гибридный или полностью суспензионный протокол наиболее эффективным для получения триллионов SCs-клеток. Все хорошо зарекомендовавшие себя протоколы требуют примерно 1 месяца культивирования для получения функциональных SCs-клеток, а также дополнительное время, необходимое для созревания SCs-клеток. Однако несколько исследований продемонстрировали возможность размножения панкреатической популяцию предшественников поджелудочной железы, которая образуется в средней части^180,181 В частности, недавно было сообщено о том, что определенные культуральные среды, содержащие ингибитор пути TGF-β SB431542182 или ингибитор ацетил-лизиновых бромодомен-содержащих белков IBET^151,60, способствовали расширению популяции PDX1+/NKX6-1+ предшественников поджелудочной железы человека. Стабильная и надежная экспансия полученных из hPSC предшественников поджелудочной железы, которые могут эффективно дифференцироваться в функциональные SCs-островки, сократит время и стоимость производства. Кроме того, эта популяция может быть хорошо охарактеризована и может способствовать созданию банка мастер-клеток высококачественных предшественников поджелудочной железы. Важно, что такая система может уменьшить вариации в эффективности дифференцировки SCs-клеток между партиями, по сравнению с началом производства SCs для каждой дифференцировки.

После того как SC-розетки будут изготовлены, необходимо будет разработать систему для их эффективного распространения. Привлекательной идеей является криоконсервация SCs-клеток, чтобы их можно было использовать как готовый продукт. Однако на сегодняшний день замораживание целых островков сталкивается с трудностями.¹⁸³ Улучшение жизнеспособности и функции после размораживания были достигнуты путем диспергирования островков на отдельные клетки, а затем их повторной агрегации в кластеры после оттаивания.^184,185 Подобный метод дисперсионного замораживания был успешно использован в контексте трансплантации SCs-клеток не-человекообразным приматам.^45,46 Недавно также был разработан оптимизированный процесс витрификации для успешного замораживания целых SCs-островков,¹⁸⁶ но масштабирование этого процесса для количества клеток, необходимого для терапевтического использования, может быть затруднено. Будущие работа должна быть направлена на расширение масштабов этих методов криоконсервации при одновременном снижении потери клеток после размораживания. Кроме того, другие вопросы, требующие решения, связаны с тем, как клетки будут доставлены в клинику. Например, SCs-островки, замороженные в виде отдельных клеток, необходимо будет объединить в кластеры в течение нескольких дней перед трансплантацией. Этот процесс может происходить на месте производства, а SCs-островки могут в живом виде за ночь доставляются к месту трансплантации. Кроме того, возможно, что перед трансплантацией может потребоваться восстановительный период культуры на месте перед трансплантацией, чтобы максимизировать выживаемость и эффективность SCs-клеток.

С момента открытия надежной генерации дефинитивной эндодермы из hPSCs в 2005 году¹⁸⁷ благодаря весомому вкладу многих исследовательских групп были разработаны протоколы, позволяющие провести эти дефинитивные клетки эндодермы через несколько промежуточных этапов, кульминацией которых является получение поколения чувствительных к глюкозе β-клеток. Дальнейшее усовершенствование этих стратегий дифференцировки вызвало дальнейшее функциональное созревание SCs-клеток, способствуя приобретению двухфазной кинетики секреции инсулина, аналогичной той, что наблюдается в первичных островках человека. Эти клетки способны быстро излечивать мышей с тяжелой формой диабета и улучшать гликемический контроль у не-человекообразных приматов, а постоянный прогресс в этой области позволил сузить круг критически важных качественных характеристик этих клеток.

Рисунок 3.

Как уже говорилось в данном обзоре, последние разработки в области генерации SCs-клеток и иммунной защиты обнаруживают потенциал для повышения эффективности и безопасности конечного клеточного продукта. Например, технологии секвенирования одной клетки позволили получить беспрецедентные характеристики SCs-клеток, обеспечивая понимание идентичности и состояния созревания клеток, полученных с помощью этих протоколов дифференцировки. Эти данные о транскрипционном и хроматиновом ландшафте SCs-клеток могут послужить основой для разработки следующего поколения протоколов для совершенствования производства SCs-клеток в попытке увеличить секрецию инсулина и устранения не-целевых типов клеток. Также был достигнут прогресс в области иммунопротекторных стратегий, включая специально разработанные биоматериалы, вызывающие местную иммунную толерантность, а также генетически сконструированные клетки, избегающие иммунной системы. Эти подходы позволяют избежать применения иммуносупрессивных мер и тем самым расширить возможности применения данной клеточной терапии. Наконец, дальнейшие генно-инженерные подходы к улучшению устойчивости SCs-клеток к стрессовым факторам, с которыми они сталкиваются сразу после трансплантации, вероятно, станут ключевыми для повышения жизнеспособности трансплантата и снижения количества клеток, необходимых для обеспечения инсулиновой независимости.