Мышцы человеческого тела лежат в основе многих основных функций, таких как передвижение, дыхание и работа сердца. Мышцы являются тканями с высоким энергопотреблением и требуют специализированного и хорошо контролируемого клеточного гомеостаза для обеспечения эффективной и долговечной работы. Скелетные мышцы тела лежат в основе локомоции и дыхания человека; при чрезмерном использовании они способны восстанавливаться. В отличие от этого, сердце - это двойной циркуляционный насос, который постоянно используется, и кардиомиоциты, из которых состоит сердце, не могут существенно регенерировать или эндогенно восполняться - на это открытие ушло 20 лет. Терапевтическая регенерация до сих пор остается одной из терапевтических целей в этой области (He et al., 2020). Существует множество заболеваний, которые в первую очередь поражают ткани за пределами сердца и скелетных мышц, но при этом вызывают смесь первичных и вторичных миопатий, поскольку процессы, поддерживающие гомеостаз в этих различных тканях, дублируются (Lynch & Farmer, 2021; Terman et al., 2008). Редкие миопатии часто напрямую затрагивают белки, которые экспрессируются как в сердечной, так и в скелетной мышце. Эти заболевания имеют тенденцию к прогрессирующей дебилизации, влияют на качество жизни и могут стать смертельными из-за поражения сердца или диафрагмы (Loboda & Dulak, 2020). По мере того как прогрессирует лечение первичных патологий этих заболеваний и люди живут дольше, вторичные сердечные патологии становятся все более выраженными (Loboda & Dulak, 2020). Возможности для разработки новых целевых методов лечения ускорились в последние десятилетия по мере выявления генетических причин этих заболеваний. Мы рассмотрим общие парадигмы этих редких мультисистемных заболеваний с вторичным поражением сердца, чтобы выделить общие и разнообразные пути развития болезни и описать новые генные таргетные методы лечения.

Миоциты - сложные клетки, работающие под жестким гомеостатическим контролем. Дисрегуляция тонких процессов, которые являются неотъемлемой частью поддержания основной сократительной функции миоцитов, приводит к возникновению патологии (рис. 1). Сокращение - это энергетически затратный процесс, регулируемый преходящими потоками Ca²⁺, которые распространяются через связь возбуждения и сокращения и индуцированное кальцием высвобождение кальция. Эти процессы приводят к синхронному высвобождению кальция из внутриклеточных запасов кальция, что позволяет образовывать поперечные мостики и производить силу за счет силового удара, зависящего от АТФазы миозина, которая затем передается по миофибриллам в соседние клетки. Этот процесс повторяется примерно 70 раз в минуту в сердце взрослого человека, потребляющего 6 кг АТФ ежедневно (Neubauer, 2007).

FIGURE 1

Обзор биологии кардиомиоцитов с указанием путей, изменяющихся при заболеваниях. Натрий-кальциевый обменник и натрий-калиевая АТФаза опосредуют поступление ионов, деполяризуя клетку и вызывая вход Ca2+ через вольтаж-генерируемые кальциевые каналы L-типа. Это провоцирует индуцированный кальцием выброс кальция из саркоплазматического ретикулума. Затем цитоплазматический кальций связывает тропониновый комплекс, обеспечивая образование поперечных мостиков и силовой удар миозина под действием АТФазы. АТФ, используемая для этих процессов, поставляется плотной решеткой митохондрий, упакованных между саркомерами. Функционирование митохондрий поддерживается frataxin в комплексах I-III, α-глюкозидаза способствует снабжению глюкозой для производства АТФ, а дистрофин является неотъемлемой частью крепления миофибрилл к сарколемме, обеспечивая эффективную передачу силы между клетками.

Многие гомеостатические процессы в миоците, которые являются неотъемлемой частью поддержания сокращения, являются общими для различных типов клеток. Это совпадение особенно очевидно при миопатиях, поскольку многие высоко экспрессируемые гены перекрываются в сердечной, скелетной и гладкой мускулатуре. Поэтому редкие варианты этих перекрывающихся генов часто могут влиять на несколько тканей. В этом контексте мы обсуждаем подгруппу заболеваний, которые имеют сердечные проявления и развиваются параллельно с патологиями других тканей. Многие из этих заболеваний имеют хорошо изученные или новые генетические механизмы, которые открывают возможности для разработки целевых генетических терапий для мультитканевых заболеваний, которые они вызывают. Существует несколько препятствий, которые необходимо преодолеть, чтобы создать работающую генотерапию, которая может быть эффективно доставлена в пораженные ткани. В последнее десятилетие был разработан целый ряд новых инструментов для манипулирования генами, которые могут быть использованы для создания терапии. К ним относятся системы прямой доставки генов, упаковывающие мРНК, методы редактирования генома, такие как редактирование оснований (Dunbar et al, 2018; Rees & Liu, 2018) и редактирование праймеров (Scholefield & Harrison, 2021), CRISPR-регулирование в виде активации CRISPR (CRISPRa) или ингибирования (CRISPRi) (Kan & Doudna, 2022), антисмысловые олигонуклеотиды для изменения трансляции, короткие интерферирующие РНК (siRNA) и микроРНК (miRNA) для специфического нокдауна генов (Dana et al., 2017). Мы обсуждаем эти разнообразные терапевтические стратегии применительно к трем конкретным заболеваниям, которые имеют различные генетические причины, но все приводят к потере генного продукта. Это мышечная дистрофия Дюшенна (DMD), при которой изменяется экспрессия дистрофина, атаксия Фридриха (FA), редкое нервно-мышечное заболевание, при котором снижается экспрессия фратаксина, и болезнь Помпе, лизосомное заболевание, обусловленное дефицитом кислой α-глюкозидазы.

DMD - тяжелое прогрессирующее Х-сцепленное аутосомно-рецессивное заболевание, встречающееся у 1 из 3500-10 000 человек (Mah et al., 2014). DMD характеризуется прогрессирующей мышечной слабостью в раннем детстве. Кардиомиопатия обычно проявляется в середине подросткового возраста прогрессирующим фиброзом, дисфункцией левого желудочка, дилатацией и сердечной недостаточностью (Kaspar et al., 2009). С кардиомиопатией DMD связана значительная смертность: 41,9 % носителей умирают от сердечных осложнений в среднем в возрасте 26 лет, при этом ощущается явная нехватка целевых методов лечения, способных остановить или обратить вспять сердечные осложнения у этих пациентов (Wahlgren et al., 2022).

Генетически DMD обусловлен мутациями в генах Dp71 и Dp427, которые кодируют сердечный и скелетный дистрофин. Шестьдесят четыре процента случаев DMD вызваны делециями, 11 процентов - дупликациями и 23 процента - заменами (точечными мутациями, вставками и небольшими делециями), причем до 30 процентов этих вариантов возникают de novo, как сообщается в Лейденской открытой базе данных вариаций (https://databases.lovd.nl/shared/genes/DMD). Мутации группируются в экзонах 2-10 и 45-55, заканчивая белок на F-актин-связывающем домене или цистеин-богатом домене, соответственно, что приводит к образованию усеченных белков, которые нарушают связь между цитоскелетом и внеклеточным матриксом (Ankala et al., 2012; White et al., 2006).

Дистрофин локализуется в сарколемме и опосредует прикрепление к внеклеточному матриксу через взаимодействие с цитоскелетными элементами, ионными каналами и сигнальными белками, образуя дистрофин-ассоциированный белковый комплекс (DAPC) (рис. 2). Сердечный дистрофин связывается с α-актинином и взаимодействует с кардиопротекторами AHNAK1, Cavin-1, α-кристаллином B-цепи (CRYAB) и Cypher (Johnson et al., 2012). При DMD частичная или полная потеря дистрофина приводит к разборке DAPC, что нарушает крепление сократительного аппарата к клеточной мембране. Это нарушает обработку механического напряжения на сарколемме, делая ее восприимчивой к повреждениям во время сокращения (Dudley et al., 2006). Существует еще несколько клеточных процессов, подверженных влиянию, которые кратко описаны на рисунке 2b.

FIGURE 2 Dystrophin, Duchenne muscle dystrophy and therapeutic opportunities. (a) Physiological expression of dystrophin maintains cellular homeostasis and ion exchange by mechanical association of the dystrophin-associated protein complex (DAPC), which includes the dystroglycan and sarcoglycan complexes, to the mechanical apparatus via cytoskeletal actin. This in turn links to the mitogen-activated protein kinase (MAPK) and protein kinase A (PKA) pathways and nitric oxide synthase (NOS) signalling, enabling downstream signalling, correct localisation of neuronal NOS (nNOS) and subsequent secretion of vasodilative nitric oxide (NO). (b) Loss of dystrophin disrupts myofibril mechanical linkage to the sarcolemma, causing the DAPC to disassemble causing membrane damage. Loss of dystrophin-mediated anchoring of cytoskeletal components interrupts PKA and MAPK signalling and causes myofibril disarray. Contractile processes activate Rac1 signalling, resulting in reactive oxygen species (ROS) damage. Loss of NOS signalling results in localised ischaemia due to mislocalisation of nNOS and a subsequent lack of NO secretion in the local vasculature. (c) Current therapeutic approaches include antisense oligonucleotides and gene editing strategies to generate spliced dystrophin. Others include supplementing expression of the dystrophin analogue utrophin, antioxidants to ameliorate ROS damage, or delivery of NO precursors to partially recover dystrophin function to ameliorate cell damage. Created using BioRender.com.

Существующие нецелевые методы лечения показали хорошие результаты в лечении кардиомиопатии, связанной с DMD. Они неспецифически блокируют провоспалительные гены, ингибируя ядерный фактор-?B (NF-kB) (Finkel et al., 2021) или простагландин D-синтазу гемопоэтического типа (HPGDS) (Mohri et al., 2009) (NCT02246478, NCT02752048). Подавление патологического медиатора гипертрофии и фиброза TRPC6 (transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 6) с помощью BI749327 показало эффективность в уменьшении сердечного фиброза и повышении мышечной функции, подавляя профибротический ответ у мышей с DMD и значительно повышая выживаемость (Lin et al., 2022).

Генетическое устранение дефицита дистрофина при DMD является привлекательной терапевтической целью для предотвращения последующих последствий заболевания, исключающей необходимость применения нескольких тандемных методов лечения. Увеличение экспрессии дистрофина становится методологически достижимым благодаря развитию биологических препаратов в качестве доставляемых терапевтических средств (Kupatt et al., 2021). Разнообразная генетическая этиология DMD затрудняет использование генетических коррекций, специфичных для конкретного пациента. К сожалению, полноразмерный дистрофин слишком велик, чтобы его можно было упаковать в существующие векторы для прямой доставки (Pichavant et al., 2011), но было показано, что более короткий, сплайсированный функциональный дистрофин предотвращает фиброз и повышает функцию мышц у mdx-мышей (Potter et al., 2021). Редактирование генов с помощью адено-ассоциированного вируса (AAV) с доставкой CRISPR-Cas9 оказалось эффективным у мышей, где удаление раннего терминирующего кодона дистрофина в модели DMD показало частичную коррекцию экспрессии дистрофина, восстанавливая фенотип в сердечной и скелетной мышцах (Long et al., 2016). Пропуск экзонов может быть использован для частичного обхода внекадровых мутаций, которые снижают экспрессию дистрофина, облегчая фенотип (Aartsma-Rus et al., 2009). Аналогичным образом, антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) могут использоваться для пропуска экзонов с преждевременными остановками и повышения уровня дистрофина (NCT00844597, NTR1241) (табл. 1). В качестве альтернативы, повышение уровня урофина, высоко гомологичного аналога дистрофина, привело к повышению устойчивости к физическим нагрузкам и уменьшению повреждения мышц (Tinsley et al., 2011); однако противоречивые данные показали недостаточную эффективность этого подхода (Muntoni et al., 2017). Было показано, что небольшая молекула ataluren, способствующая считыванию преждевременных терминирующих кодонов, частично восстанавливает экспрессию дистрофина (Welch et al., 2007). К сожалению, ataluren действует только на мутации ранней терминации трансляции, вызванные миссенс-вариантами, что ограничивает его применение небольшим подмножеством пациентов. Этот же принцип применим к методам редактирования генов, направленным на конкретные экзоны, поскольку разнообразие генных мутаций, вызывающих DMD, велико. Таким образом, каждый подход, направленный на редактирование, обеспечит терапию только для подмножества пациентов с DMD. (Aartsma-Rus et al., 2009).

Аналогичным образом, антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) могут использоваться для пропуска экзонов с преждевременными остановками и повышения уровня дистрофина (NCT00844597, NTR1241) (табл. 1). В качестве альтернативы, повышение уровня utrophin, высоко гомологичного аналога дистрофина, привело к повышению устойчивости к физическим нагрузкам и уменьшению повреждения мышц (Tinsley et al., 2011); однако противоречивые данные показали недостаточную эффективность этого подхода (Muntoni et al., 2017). Было показано, что небольшая молекула ataluren, способствующая считыванию преждевременных терминирующих кодонов, частично восстанавливает экспрессию дистрофина (Welch et al., 2007). К сожалению, ataluren действует только на мутации ранней терминации трансляции, вызванные миссенс-вариантами, что ограничивает его применение небольшим подмножеством пациентов. Этот же принцип применим к методам редактирования генов, направленным на конкретные экзоны, поскольку разнообразие генных мутаций, вызывающих DMD, велико. Таким образом, каждый подход, направленный на редактирование, обеспечит терапию только для подмножества пациентов с DMD.

TABLE 1. Completed and ongoing clinical trials for Duchenne muscular dystrophy.

FA - самая распространенная наследственная атаксия, встречающаяся у одного из 25 000-50 000 человек. Обычно она проявляется в возрасте от 5 до 15 лет, когда прогрессирующая атаксия приводит к снижению и окончательной потере подвижности. Хотя FA - это прежде всего нервно-мышечное заболевание, характеризующееся мышечной слабостью (Fichera et al., 2022), оно также приводит к развитию тяжелой кардиомиопатии (Fichera et al., 2022; Weidemann et al., 2012). FA - аутосомно-рецессивное заболевание, вызванное экспансией тринуклеотидного повторяющегося элемента GAA в интроне 1 гена frataxin (FXN) (Campuzano et al., 1996). Экспансия варьирует от 66 до 1700 повторов и снижает экспрессию гена FXN, при этом более длинные повторные элементы коррелируют со снижением экспрессии FXN и увеличением тяжести заболевания (Dьrr et al., 1996; Schцls et al., 1997). В 96 % случаев FA уровень белка составляет 4-29 % от обычного (Campuzano et al., 1997).

Фратаксин в изобилии содержится в митохондриях (Gakh et al., 2010) и высоко экспрессируется в центральной нервной системе (ЦНС), поджелудочной железе, сердце, печени и скелетных мышцах, что отражает тканевую пенетрантность патологии FA. Считается, что он необходим для сборки Fe-S кластеров в митохондриях (Fox et al., 2019), которые участвуют в митохондриальном дыхании через комплексы I, II и III и являются кофакторами для aconitase в цикле Кребса; таким образом, потеря фратаксина снижает производство АТФ (Рисунок 3). Фратаксин также участвует в метаболизме, транспорте и хранении железа, а также в биогенезе митохондрий (Llorens et al., 2019). Снижение уровня клеточного фратаксина приводит к накоплению железа в митохондриях и истощению его запасов в цитозоле в дрожжевых моделях (Babcock et al., 1997), что обратимо при реэкспрессии фратаксина (Radisky et al., 1999). Фратаксин также участвует в апоптозе через дерегуляцию железа (Wong, 1999) и защите от окислительного стресса (Shoichet et al., 2002).



РИСУНОК 3 The role of frataxin in healthy and FA cardiomyocyte, highlighting opportunities for therapeutic intervention. (a) Expression of frataxin supports mitochondrial function by mediating iron–sulphur cluster formation, which is a key component of respiratory chain complexes I, II and III, a cofactor to aconitase, essential in the Krebs cycle, and contributes to haem formation and iron storage. (b) Decreased frataxin expression interferes with ATP production by reducing aconitase activity causing the interruption of the respiratory chain complexes I–III. Deregulation in iron metabolism results in iron accumulation, decreased haem production and ROS damage. (c) Therapeutic strategies include antioxidants against ROS damage, re-purposing of FDA approved drugs that increase frataxin expression, iron chelation to counter iron accumulation, and supplementation with nicotinamide riboside to boost NAD+ and protect against the metabolic vacuum in FA cardiomyopathy. Gene therapy approaches aim to target and cleave the expanded GAA repeat with the aim of increasing FXN expression. Created using Biorender.com.

Кардиомиопатия FA имеет гетерогенную картину и может проявляться в виде гипертрофии межжелудочковой перегородки, левого желудочка (LV) или концентрической гипертрофии (Meyer et al., 2007). Известно, что стенка LV теряет массу, что приводит к прогрессирующему фиброзу, аритмиям и в конечном итоге к сердечной недостаточности (Weidemann et al., 2015). Механизм развития заболевания при кардиомиопатии FA до конца не изучен, однако она демонстрирует многие отличительные признаки наследственных кардиомиопатий, включая нерегулярные митохондрии, удлиненные потенциалы действия, а также систолическую и диастолическую недостаточность (Hick et al., 2013; Wong et al., 2019). От других кардиомиопатий FA отличает накопление железа в миокарде, миокардит (Koeppen et al., 2015) и энергетическое истощение, обусловленное снижением выработки АТФ (Lodi et al., 2001). Это отличается от гипертрофической кардиомиопатии (ГКМ), при которой энергетическое истощение обусловлено чрезмерной активностью миозина, истощающего АТФ (Ashrafian et al., 2003; Margara et al., 2022; Schmid & Toepfer, 2021; Toepfer et al., 2020). Примечательно, что состояния митохондриального дефицита фенотипически имитируют HCM, что позволяет предположить, что энергетическое истощение является центральным игроком в кардиомиопатии FA (Ashrafian et al., 2003).

Терапия при FA многогранна, что отражает ее мультисистемное вовлечение, и варьирует от физических упражнений и физиотерапии (Widener et al., 2020) до использования скоб или хирургической коррекции, мышечных релаксантов при мышечных спазмах, инсулинотерапии при диабете, а также мероприятий по борьбе с потерей зрения и слуха (Corben et al., 2014). Кардиологические симптомы обычно лечатся ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента и бета-блокаторами, а в тяжелых случаях иногда требуется имплантация cardioverter. При мерцательной аритмии используются антиаритмические препараты, а при сердечной недостаточности в конечной стадии может потребоваться трансплантация (Corben et al., 2014). Исследуемые методы лечения (табл. 2) направлены на последствия патологии FA путем спасения функции митохондрий, повышения экспрессии фратаксина, усиления хелатирования железа (Kakhlon et al., 2008; Velasco-Sbnchez et al., 2011) или антиоксидантной терапии для ограничения повреждений (Qureshi et al., 2021). На сегодняшний день в США одобрен один препарат (omaveloxolone), который показал улучшение показателей по модифицированной шкале оценки атаксии Фридриха (Lynch et al., 2021). Преимущества в неврологической функции были показаны при использовании никотинамида (Libri et al., 2014); в настоящее время изучается возможность его сочетания с лечебной физкультурой для компенсации метаболического дефицита при FA. Также изучается агонист пероксисомных рецепторов пролифератора-активатора leriglitazone, который восстанавливает мембранный потенциал митохондрий, улучшая митохондриальный дефицит, наблюдаемый в моделях FA (Rodrnguez-Pascau et al., 2021). Было показано, что calcitriol повышает экспрессию фратаксина и восстанавливает мембранный потенциал митохондрий в нейронах, кардиомиоцитах и лимфобластоидных клетках пациентов с FA (Britti et al., 2021). Etravirine, противовирусное средство, одобренное FDA для лечения ВИЧ, усиливает экспрессию фратаксина в клетках, полученных от пациентов, что послужило поводом для проведения клинических испытаний II фазы на пациентах (Alfedi et al., 2019). Erythropoietin, еще один препарат, одобренный FDA, также увеличивает экспрессию фратаксина в нейронах, лимфоцитах и кардиомиоцитах (Sturm et al., 2005).

TABLE 2. Completed and ongoing clinical trials for Friedreich ataxia.

Терапевтические стратегии, направленные на увеличение экспрессии фратаксина, непосредственно нацелены на потерю клеточного фратаксина, которая приводит к патологии FA. Известно, что снижение уровня клеточного фратаксина приводит к изменению транскриптома, которое не полностью преодолевается при реэкспрессии (Li et al., 2015), что свидетельствует о дефиците развития FA, который может сохраняться при лечении во взрослом возрасте. Реэкспрессия фратаксина осложняется еще и тем, что сверхнормальные уровни фратаксина могут приводить к патологии сердца (Belbellaa et al., 2020), что усложняет использование прямой доставки генов из-за потенциальной клеточно-специфической избыточной экспрессии, приводящей к токсичности. Поэтому генетическая коррекция аллеля FXN является особенно привлекательной, поскольку экспрессия FXN будет оставаться под контролем эндогенных генных регуляторных элементов. Обнадеживающая доклиническая работа показала, что трансплантация CRISPR/Cas-9-корректированных предшественников и гемопоэтических стволовых клеток FA корректирует экспрессию фратаксина хозяина (Rocca et al., 2020). Эта работа подчеркивает потенциал как аутологичной трансплантации клеток с исправленным геном, так и вырезания in vivo расширенных элементов повтора GAA с помощью CRISPR/Cas-9 в эндогенных клетках. Одним из осложнений такой терапии является доставка препарата как в ЦНС, так и в сердце. В двух недавних клинических исследованиях (NCT05445323 и NCT05302271), проведенных в соответствии с этой концепцией, кардиомиопатия при FA была поставлена на поток путем доставки гена FXN с помощью вектора AAVrh10, обладающего специфическим тропизмом к мышцам.

Болезнь Помпе - это аутосомно-рецессивное заболевание, встречающееся примерно у 1 из 40 000 человек. Это лизосомное заболевание, поражающее скелетные мышцы и сердце. Обычно болезнь проявляется в двух формах: раннее «классическое» начало, которое возникает в течение нескольких недель жизни и характеризуется аномалиями развития, прогрессирующей мышечной слабостью, низкой рельефностью мышц и значительным поражением сердца (van den Hout et al., 2003), и позднее начало болезни, характеризующееся мышечными симптомами и менее распространенной кардиомиопатией (Boentert et al., 2016).

Болезнь Помпе вызывается мутациями в гене GAA, которые приводят к полному или частичному дефициту его генного продукта - кислой α-глюкозидазы, лизосомного фермента, катализирующего гидролиз гликогена, основной молекулы для хранения глюкозы. На сегодняшний день в GAA идентифицировано более 580 мутаций; полный дефицит приводит к раннему началу заболевания, а частичный - к менее тяжелому позднему (Peruzzo et al., 2019). Мутации GAA могут приводить к неправильному сплайсингу, пропуску экзонов или ранней терминации, укорачивающей генный продукт. Это связано с накоплением гликогена в лизосомах, которые становятся увеличенными (Canibano-Fraile et al., 2023). Фагосомы не могут слиться с лизосомами, что приводит к накоплению аутофагического материала (рис. 4) (Raben et al., 2012). В результате цитозольного выброса лизосомного содержимого, метаболического инсульта и ингибирования аутофагии происходит повреждение клеток. Аутофагия играет важную роль в снижении окислительного стресса, удаляя скомпрометированные митохондрии для поддержания эффективного производства АТФ (Ju et al., 2016). Считается, что сердечный фенотип б. Помпе обусловлен изменениями в метаболизме жирных кислот (Yang et al., 2019), а также общим дефицитом клеточной энергии (Ashrafian et al., 2003), что приводит к фенокопии HCM.

FIGURE 4 Роль кислой α-глюкозидазы в болезни Помпе и терапевтические стратегии. (a) При физиологическом уровне экспрессии кислая α-глюкозидаза локализуется в лизосомах и гидролизует гликоген до глюкозы для дыхания. (b) Дефицит кислой α-глюкозидазы в клетке, вызванный мутациями в GAA, приводит к накоплению лизосомного гликогена и неспособности слияния лизосом с фагосомами, что вызывает накопление аутофагического материала, отсутствие клиренса органелл, метаболический дефицит и потерю саркомеров. (c) Терапевтические подходы включают заместительную ферментную терапию для восполнения недостатка функциональной кислотной α-глюкозидазы, доставку шаперонов для стабилизации нативной и доставленной кислотной α-глюкозидазы, а также вирусную доставку гена GAA дикого типа или предшественника кислотной α-глюкозидазы. Альтернативные варианты включают сверхэкспрессию TFE3 и EB, чтобы вызвать секрецию лизосомного содержимого, и РНК-интерференцию гликогенсинтазы 1 (GS1) и гликогенина (GNN), чтобы ограничить производство гликогена. Создано с помощью программы BioRender.com.

Единственным утвержденным в настоящее время методом лечения болезни Помпе является заместительная ферментная терапия (ERT), при которой рекомбинантная кислая α-глюкозидаза доставляется для гидролиза гликогена и обратного его накопления (Thurberg et al., 2006). Продольные исследования показали, что долгосрочная клиническая эффективность ERT варьируется в зависимости от формы заболевания. У пациентов с поздней стадией заболевания отмечается незначительное поражение сердца, и было установлено, что у таких пациентов ERT стабилизирует дыхательную функцию и мышечную силу, а также ослабляет мышечный фенотип (Sarah et al., 2022). При инфантильном начале Помпе, которое характеризуется выраженной кардиомиопатией, наблюдаются долгосрочные улучшения, включая ослабление гипертрофического ремоделирования сердца и нормализацию сердечной функции (Scheffers et al., 2023). Улучшение кардиологических проявлений заболевания означает, что пациенты живут дольше и начинают демонстрировать изменения когнитивных функций, что свидетельствует о неполной коррекции с помощью ERT из-за недостаточной доставки через гематоэнцефалический барьер (van Gelder et al., 2012). Иммунный клиренс и плохая доставка через мышцы ограничивают эффективность ERT (Bronsema et al., 2015). Для решения этой проблемы была разработана новая улучшенная рекомбинантная кислая α-глюкозидаза со стабилизирующими шаперонами, которая показала эффективность на мышах, но не улучшила результаты по сравнению с существующей терапией ERT в клинических испытаниях III фазы (Schoser et al., 2021; Xu et al., 2019).

Подход к лечению болезни Помпе с помощью направленной генотерапии является привлекательным, поскольку восстановление полностью функционального гена GAA устранит гаплонедостаточность, которая приводит к развитию болезни Помпе, и позволит избежать терапевтической резистентности, которая часто наблюдается при использовании терапии ERT. Как доставка генов, так и прямая коррекция генов являются жизнеспособными терапевтическими стратегиями при болезни Помпе. Прямая доставка генов более практична с учетом существующих технологий, поскольку в этой области отсутствует долговременный подход к редактированию генов, который мог бы исправить все мутации болезни Помпе, что является аналогичной проблемой при лечении DMD. Было показано, что вирусная доставка кислой α-глюкозидазы очищает гликоген и увеличивает производство силы в кардиомиоцитах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (Sato et al., 2015). Системная доставка аденовирусной конструкции с предшественником человеческой кислотной α-глюкозидазы также показала, что это жизнеспособная стратегия для индукции выработки кислотной α-глюкозидазы в печени (Han et al., 2017) (NCT04093349) (Таблица 3). Однако и ERT, и доставка генов на основе AAV вызывают иммунный ответ, при котором антитела пациента нейтрализуют значительную часть предшественника кислой α-глюкозидазы (Bronsema et al., 2015). Таким образом, ключевым моментом в продвижении лечения болезни Помпе является длительная доставка терапии в одной дозе и предотвращение резистентности к повторной доставке.

TABLE 3. Completed and ongoing clinical trials for Pompe disease.

Отдельные миопатии встречаются редко, но как группа заболеваний они поражают ~ 1 из 1500-3000 человек. Они представляют собой прогрессирующие многотканевые патологии с различными генетическими факторами, а их сердечные фенотипы разнообразны, но часто проявляются фиброзом, гибелью клеток и сердечной недостаточностью. Терапия малыми молекулами может быть полезной для лечения этих состояний, поскольку они могут быть доставлены системно и часто являются биодоступными в различных пораженных болезнью тканях. Это происходит за счет неразборчивого связывания малых молекул, что может вызывать побочные эффекты, ограничивающие терапевтическое окно и приверженность. Кроме того, они противопоказаны определенным группам пациентов. Именно поэтому биологические методы лечения, направленные непосредственно на генетические патомеханизмы, могут быть использованы для расширения возможностей точного лечения. Современное генетическое понимание миопатий и доступность генетических инструментов позволяют разрабатывать новые целевые биологические терапии. Эти биологические методы лечения направлены на предотвращение и обращение вспять прогрессирования заболевания. Мы обсуждаем возможности и препятствия, которые необходимо преодолеть, чтобы обеспечить генотерапию при миопатиях с различными генетическими факторами.

При разработке генотерапии необходимо учитывать ряд методологических соображений. Например, болезнь Помпе вызвана отсутствием функционального белка GAA в клетке, а ген GAA достаточно мал, чтобы упаковать его в AAV, который может быть эффективно направлен в печень. Таким образом, прямая замена генов является приемлемым подходом для лечения болезни Помпе. Замена гена также позволяет избежать необходимости специально исправлять редкие варианты, которые приводят к гаплонедостаточности GAA. В настоящее время проводятся клинические испытания по оценке безопасности и долговечности такого подхода с использованием доставки AAV-GAA в печень на ранних и поздних стадиях болезни Помпе. Первые эксперименты на не-человекообразных приматах (NHP) показали дозозависимую экспрессию GAA в плазме крови при отсутствии аномальных гистопатологических находок после однократного введения AAV-GAA (Armour et al., 2019). Этот вывод позволяет предположить, что конструкция AAV-GAA способна повышать уровень циркулирующего GAA в плазме крови. Будет полезно понять, насколько долговечен ответ на введение GAA, и будет ли этот уровень GAA в плазме способствовать терапевтической эффективности в пораженных тканях. Важно отметить, что в ходе испытаний фазы I/II проверяется безопасность AAV-GAA путем мониторинга иммунного ответа на капсид AAV и трансген GAA. Это делается для того, чтобы понять возможную иммуногенность конструкции в контексте устойчивой экспрессии трансгена. Хотя исследования на NHP показали высокую начальную трансдукцию гепатоцитов, долгосрочная трансдукция наблюдается в менее чем 1% случаев, несмотря на то, что 10% клеток сохраняют векторную ДНК (Greig et al., 2022). Однако первые результаты, полученные на мышах, показали, что прямая доставка AAV-GAA в определенные ткани может катализировать распад гликогена, что свидетельствует об обратимости накопления гликогена, и это обнадеживает. Важно определить окно доставки генов для генотерапии, особенно в случае болезни Помпе, которая приводит к прогрессирующему фиброзу и не может быть обращена только восстановлением уровня GAA. Это относится к более широкому кругу открытых вопросов в данной области, касающихся оптимального интервенционного окна вмештельств для наследственных состояний, которое может либо предотвратить возникновение, либо в достаточной степени обратить вспять патологию, чтобы улучшить результаты лечения пациентов.

В случае с DMD прямая доставка генов затруднена из-за размера дистрофина, который слишком велик, чтобы его можно было упаковать в существующие вирусные векторы. Однако доставки микродистрофинов может быть достаточно для частичного восстановления клеточных функций и лечения заболевания. В ходе экспериментов была проверена эффективность доставки небольшого фрагмента дистрофина, названного микродистрофином 5 (µDys5). µDys5 был упакован в AAV (AAV-µDys5) и введен мышам с DMD в возрасте 4 недель, что позволило предотвратить фиброзные и воспалительные процессы в сердце вплоть до 18-месячного возраста (Piepho et al., 2023). Микродистрофины вряд ли смогут полностью заменить функцию полноразмерного дистрофина внутри клетки DMD, поэтому для лечения DMD может потребоваться увеличить количество полноразмерного или близкого к нему дистрофина. Именно в этой области перспективны ASO, поскольку они могут быть использованы для увеличения экспрессии полноразмерного дистрофина путем пропуска экзонов, вызывающих заболевание DMD. Именно таков механизм действия препарата Exondys 51, одобренного Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) для пациентов с экзоном 51 аллеля DMD. Однако варианты экзона 51 встречаются только у ~13% пациентов с DMD, поэтому для лечения вариантов DMD, не связанных с экзоном 51, потребуются другие генные терапии или дополнительные экзон-специфические ASO.

При разработке и тестировании генозаместительной терапии важно понять, какой уровень реэкспрессии необходим для предотвращения или замедления прогрессирования заболевания в пораженных тканях. Это особенно актуально для DMD, где ре-экспрессия 4-20% полноразмерного дистрофина в диафрагме может облегчить патологию DMD, но для других тканей и групп мышц может потребоваться ре-экспрессия до 70%. Доставка AAV является привлекательным подходом к лечению DMD, поскольку она может обеспечить устойчивую экспрессию в различных пораженных тканях. Однако надежная доставка в сердце все еще остается серьезным препятствием. В настоящее время разрабатываются новые серотипы вирусов, которые могут быть направлены не на печень, где очищается большая часть AAV. Это позволит снизить токсичность печени и уменьшить титры вирусов, которые необходимо будет системно доставлять в ткани, связанные с заболеванием, за пределами печени, что сделает лечение более безопасным. Другой подход к увеличению доставки AAV в сердце заключается в использовании прямой молекулярной кардиохирургии с рециркуляционной доставкой генов (MCARD) (Katz et al., 2010). MCARD - инвазивная процедура, но, возможно, это наиболее подходящий метод доставки в сердце из существующих на сегодняшний день. Будущие разработки в области векторного дизайна направлены на создание терапии DMD, которая будет представлять собой комбинацию системно доставляемых в печень де-таргетированных серотипов AAV со специфическими сердечной или мышечной доставкой. Это позволит осуществлять двойную доставку AAV, эффективно воздействуя на несколько тканей, пораженных болезнью (Davis et al., 2023). Тканеспецифичность доставки также является ключевым препятствием для разработки ASO для DMD, и в настоящее время прилагаются значительные усилия для разработки новых химикатов ASO, обеспечивающих тканеспецифичное поглощение (Roberts et al., 2020). Этот технологический прогресс позволит использовать смеси ASO для обеспечения эффективной доставки в различные ткани, имеющие отношение к заболеванию (Gagliardi & Ashizawa, 2021).

Атаксия Фридриха - сложное мультисистемное заболевание, которое, как и DMD и болезнь Помпе, требует лечения или лечения, направленного на несколько тканей. Теоретически атаксию Фридриха можно было бы лечить прямой доставкой генов, поскольку ген FXN достаточно мал для вирусной упаковки. Однако было показано, что чрезмерная доставка фратаксина может быть потенциально токсичной для клеток (Belbellaa et al., 2020). Еще одним осложнением использования прямой доставки генов в качестве терапии является отсутствие серотипов AAV, способных преодолевать гематоэнцефалический барьер и эффективно инфицировать соответствующие ткани ЦНС (Meseck et al., 2022). Эту проблему можно решить, используя более высокие титры вирусов, но в этом случае более высокая множественность инфекции может привести к токсичности сверхэкспрессии фратаксина. Потенциальным способом преодоления этой проблемы является разработка низко-эффективных промоторов. Эти промоторные элементы могут ограничить экспрессию генов при единичном проникновении вируса в клетку и тем самым снизить вероятность того, что высокая клеточная доставка вируса вызовет значительное повышение уровня фратаксина, которое приведет к патологии.

Другим ключевым подходом, тестируемым для лечения атаксии Фридриха, является доставка геномных инженерных конструкций с использованием CRISPR/Cas-9. В этом случае стратегия редактирования будет направлена на удаление увеличенных повторяющихся элементов в гене FXN для восстановления эндогенной аллельной экспрессии фратаксина. Это позволит избежать риска токсичности сверхэкспрессии, поскольку экспрессия FXN будет контролироваться эндогенными механизмами регуляции генов. До сих пор использование Cas9 в качестве терапии было ограничено из-за беспорядочного вне-целевого расщепления ДНК Cas9, вызывающего двуцепочечные разрывы (DSB), с последующим риском мутагенеза (Rees & Liu, 2018). Однако новые системы редактирования, такие как редакторы оснований и прайм-редакторы, были разработаны для обхода DSB и ограничения вне-целевого мутагенеза. В частности, такие редакторы, как редакторы цитозиновых оснований (CBE) или редакторы адениновых оснований (ABE), используют каталитически неактивную деаминазу, связанную с Cas9, которая катализирует изменение одного основания в целевом окне редактора оснований. Эти CBE и ABE снижают вероятность возникновения DSB, но все еще могут вызывать побочные правки, которые представляют собой изменения одного основания, катализируемые promiscuity комплекса редактирования оснований в окрестностях целевого нуклеотида. Стратегии редактирования оснований могут быть использованы для исправления преждевременных стоп-кодонов при DMD и болезни Помпе. Однако атаксия Фридриха требует удаления расширенного повторяющегося элемента, и именно здесь прайм-редакторы могут обеспечить более приемлемую стратегию редактирования. Это связано с тем, что прайм-редакторы осуществляют без донорского шаблона точное редактирование ДНК, позволяющее получить все возможные переходные и трансверсионные мутации и, что важно, допускающее дискретные небольшие вставки или делеции (Anzalone et al., 2019). Праймерное редактирование также позволяет редактировать основания до 34 пар оснований от соседнего мотива протоспейсера NGG, что расширяет сферу его применения до 90 % генетических заболеваний (Scholefield & Harrison, 2021). Эти редакторы могут оказать значительное влияние на многие генетические заболевания в будущем, когда будет доказана эффективность целевого редактирования с минимальным количеством вне-целевого и побочного редактирования. В совокупности эти подходы к редактированию представляют собой многообещающий набор инструментов для прямого терапевтического воздействия на геном, которое может потребовать лишь однократной доставки «один и готово» (Musunuru et al., 2021).

Терапевтическое использование редакторов генома в конечном итоге все еще ограничено доступными способами доставки, которые могут упаковать модальность редактирования и обеспечить целевую доставку в ткани. Для доставки всех необходимых компонентов редакторов генома могут потребоваться двойные системы AAV, но их инфицируемость сердца по-прежнему низка (~11%) (Davis et al., 2023). Альтернативные варианты, такие как липидные наночастицы, по-прежнему имеют преимущественное печеночное поглощение, что ограничивает доставку в сердце и мышцу, но новые стратегии нацеливания липидных наночастиц могут обеспечить точное тканевое нацеливание, что облегчит доставку в ткани, представляющие интерес при миопатиях. Очевидно, что доставка остается одним из главных практических препятствий, которые необходимо преодолеть, чтобы раскрыть потенциал генотерапий человека. Возможно, в этой области придется более творчески подходить к решению проблемы доставки, как показано в исследовании, в котором использовалась новая биология патогенов для создания настраиваемой и надежной системы доставки для нескольких типов тканей человека (Kreitz et al., 2023).

За 20 лет, прошедших с момента первой одобренной генотерапии, было утверждено 33 генотерапевтических препарата, и в настоящее время проводятся тысячи клинических испытаний новых генетических подходов для лечения широкого спектра заболеваний (Shahryari et al., 2021). Однако сердечно-сосудистые заболевания все еще относительно мало представлены в текущих клинических испытаниях генотерапий. Уроки, полученные в других областях заболеваний, служат основой для развития генотерапии сердечно-сосудистых заболеваний. Есть надежда, что эти уроки позволят снизить риск и ускорить разработку целевых генотерапий при более редких мультисистемных заболеваниях, сопровождающихся сердечными патологиями.