Новые инструменты для редактирования генов могут стать революционными для генной терапии, но ученым необходимо разработать новые подходы, сдерживающие нежелательные мутации. Система Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Reats (CRISPR)-Cas9 - один из таких подверженных ошибкам инструментов редактирования, который ученые впоследствии модифицировали, чтобы ограничить его мутационное бремя.¹ Однако пока неясно, как адаптированные методы, называемые редактированием оснований и праймеров, противостоят оригинальной системе CRISPR-Cas9.² В журнале Nature Biotechnology исследователи из Научного института Сан-Раффаэле обнаружили, что базовое и праймерное редактирование приводит к большему количеству мутаций, чем предполагалось ранее, но при этом они возникают реже, чем при CRISPR-Cas9.³

Редактирование генов CRISPR-Cas9 основано на использовании направляющей РНК, которая связывается с нужной последовательностью ДНК, и фермента Cas9, который разрезает обе нити ДНК в этом месте, создавая двухцепочечный разрыв. Ученые редактируют последовательности на обрезанных концах, а затем используют различные подходы к восстановлению. Однако в ядре часто встречаются дополнительные последовательности ДНК с тупыми концами, которые могут случайно перепутаться с обрезанными концами во время репарации, что приведет к мутациям. Поэтому исследователи адаптировали технику CRISPR-Cas9, чтобы вырезать основание из одной нити, оставляя нетронутой комплементарную нить, и тем самым предотвратить случайное соединение тупых и обрезанных концов, которое приводит к мутациям.²

Luigi Naldini, исследователь в области генотерапии и соавтор исследования, на протяжении всей своей карьеры проводил анализ затрат и выгод инструментов редактирования генов.^4,5 Он сказал: "Для нас было очевидно, что мы должны аналогичным образом изучить, действительно ли редактирование оснований дает преимущества по сравнению с предыдущей технологией редактирования". Он предположил, что когда в процессе репликации зазубренная нить отсоединяется от неповрежденной комплементарной нити, она может служить шаблоном для создания второй зазубренной нити. В результате образуется двойная спираль ДНК с тупым концом, который может случайно соединиться с другим тупым концом, что делает ДНК уязвимой для мутаций.

См. также “A CRISPR Alternative for Correcting Mutations That Sensitize Cells to DNA Damage” .

Чтобы выяснить, действительно ли редакторы оснований менее подвержены ошибкам, чем инструменты CRISPR-Cas9, команда сравнила их эффективность редактирования ДНК. Они выбрали ген β2-микроглобулина, поскольку он кодирует белок клеточной поверхности, который легко обнаружить и количественно определить с помощью антител. Используя обе технологии, они модифицировали ген в гемопоэтических стволовых клетках (HSC) - распространенной мишени генотерапии заболеваний крови.⁶ Оба инструмента удаляли ген со сравнительно высокой эффективностью (примерно 80-90 процентов), но редакторы оснований производили гораздо меньше нежелательных мутаций, чем инструмент CRISPR-Cas9. Как и предполагал Luigi Naldini, команда обнаружила мутации, возникающие в результате двухцепочечных разрывов в клетках, отредактированных редакторами оснований, хотя и на более низком уровне, чем в клетках, отредактированных CRISPR-Cas9. Эти мутации возникали в месте зазубрины (разреза одиночной нити), что позволяет предположить, что она трансформировалась в случайный двунитевой разрыв во время репликации. "Неправильно говорить, что эта технология не приводи к разрывам", - говорит Налдини.

Команда также исследовала, вызывают ли системы редактирования нежелательные клеточные реакции. Оказалось, что инструмент CRISPR-Cas9 активирует путь восстановления ДНК, управляемый p53 - белком, известным как "страж генома "⁷ . Это было ожидаемо для инструмента редактирования, который намеренно генерирует двунитевые разрывы; однако они также обнаружили активацию p53 на пониженном уровне для определенного редактора оснований, который преобразует цитозин в тимин.

CRISPR-Cas9 превосходит базовые редакторы в одном отношении: Он не запускал врожденный иммунитет. Редакторы оснований используют длинные направляющие РНК, которые воспринимаются клеткой как чужеродные и вызывают иммунный ответ.⁸

Эти реакции вызывают беспокойство, поскольку выход отредактированных HSC, полученных для генной терапии, никогда не бывает стопроцентным. Со временем отредактированные клетки могут погибнуть, если их количество будет превышать количество неотредактированных клеток, не подверженных стрессовым реакциям, что снизит долговечность терапии. "Вероятно, это негативный отбор тех клеток, которые испытали на себе наибольшее бремя вредных реакций и последствий", - предположил Samuele Ferrari, биотехнолог и соавтор исследования.

"Вероятно, главное послание - это безопасность новой технологии", - сказала Annarita Miccio, молекулярный биолог из Института Имаджин, которая не принимала участия в работе. Ее коллега Megane Brusson, которая также не принимала участия в исследовании, добавила: "Действительно, генотоксические риски при использовании базовых и прайм-редакторов меньше, но, как показано в этой работе, все же есть некоторые опасения, которые мы должны учитывать при разработке генотерапии или стратегий редактирования генома для терапевтических подходов".

К счастью, исследователи нашли способ снизить большинство генотоксических эффектов редакторов оснований до необнаруживаемого уровня, сначала оптимизировав направляющие РНК, а затем снизив их дозировку. Чтобы продлить срок жизни РНК, они добавили такие элементы, как 5-праймовый колпачок, который предотвращает их разрушение в клетке.⁹ Однако оптимизация не позволила полностью избавиться от всех нежелательных эффектов. Редакторы оснований по-прежнему вызывали мутации в случайных местах генома за пределами целевого участка.

Наконец, команда исследовала прайминг-редактирование - другую технику nicking. Вместо того чтобы изменять одну пару оснований, она удаляет несколько оснований из одной нити гена и вставляет на их место новые.² "Это самый последний продукт на рынке среди всех инструментов редактирования", - говорит Феррари, добавляя, что из-за своего младенчества "праймовое редактирование еще не было протестировано в клинических условиях".

Смотрите также статью “Prime Editing Comes of Age”.

Как и редактирование оснований, редактирование праймера приводило к мутациям в месте засечки (разреза), это означало случайное образование двунитевых разрывов и запускало путь репарации ДНК p53 плюс иммунный сигнал. Как и в случае с редактированием оснований, инструмент необходимо оптимизировать, чтобы избежать этих нежелательных клеточных реакций.

Редактирование оснований и праймеров также порождает нежелательные эффекты, которые можно заметить только при тщательном скрининге. "В этой области мы не слишком много знаем о данных клинических испытаний, касающихся, например, делеций большой протяженности", - отметил Феррари.

Бруссон сказал: "В будущем нам понадобятся более мощные технологии, чтобы лучше охарактеризовать генотоксические эффекты технологий редактирования оснований и праймеров".

Miccio и ее команда изучают редактирование эпигенома как альтернативный инструмент для модулирования генов в терапии.¹⁰ Эти инструменты активируют или подавляют гены, изменяя структуру хроматина, и не вносят мутации в геном. "Теоретически это самая лучшая и безопасная стратегия, которая позволит избежать всех этих генотоксических эффектов, поскольку в ней нет фермента, изменяющего ДНК", - говорит она.

Британские регулирующие органы недавно одобрили CRISPR-Cas9 для лечения серповидно-клеточной болезни и β-талассемии, а исследователи уже использовали клетки с редактированием оснований для лечения лейкемии у 13-летней девочки в Великобритании.¹¹ Хотя эти инструменты редактирования имеют потенциал для спасения жизней, данное исследование показывает, что, возможно, стоит продолжить изучение их генотоксических рисков.

Doudna JA & Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.

Kantor A, et al. CRISPR-Cas9 DNA base-editing and prime-editing. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6240.

Fiumara M, et al. Genotoxic effects of base and prime editing in human hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 2023;s41587-023-01915-4.

Gabriel R, et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 2011;29:816-823.

Ferrari S, et al. Efficient gene editing of human long-term hematopoietic stem cells validated by clonal tracking. Nat Biotechnol. 2020;38(4):1298-1308.

Antoniou P, et al. Base and prime editing technologies for blood disorders. Front Genome Ed. 2021;3:61846.

Feroz W & Sheikh AMA. Exploring the multiple roles of guardian of the genome: P53. Egypt J Med Hum Genet. 2020;21(49):s43042-020-00089-x.

Schubert MS, et al. Chemical modification of CRISPR gRNAs eliminate type I Interferon responses in human peripheral blood mononuclear cells. J Cytokine Biol. 2018;3(21):121.

Gerstel B, et al. The effects of 5'-capping, 3'-polyadenylation and leader composition upon the translation and stability of mRNA in a cell-free extract derived from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol. 1992;6(16):2339-2348.

Syding LM, et al. CRISPR/Cas9 epigenome editing potential for rare imprinting diseases: A review. Cells. 2020;9(4):993.

Chiesa R, et al. Base-edited CAR7 T cells for relapsed T-cell acute lymphoblastic leukemia. NEJM. 2023;389:899-910.