Некоторые наследственные метаболические заболевания являются показанием для ортотопической трансплантации печени (OLT), при которой тысячи ферментов печени заменяются на ферменты донора, чтобы исправить дефект одного фермента. Наследственные метаболические заболевания, корректируемые с помощью OLT, также являются мишенью для направленной на печень генной терапии, которая с помощью точного и не-инвазивного подхода исправляет единственный дефект гена, вызывающий заболевание.

В последние два десятилетия для таргетной терапии печени использовались векторы адено-ассоциированного вируса (AAV), доклинические и клинические данные которых подтверждают их эффективность без значительной токсичности. Были разработаны и другие подходы с использованием вирусных и не вирусных векторов. В этом обзоре мы рассмотрим подходы, которые были исследованы для направленной генотерапии печени, векторы и мишени заболевания, проиллюстрируем успехи и ограничения в контексте наследственных метаболических заболеваний.

Генотерапия печени проводится как ex vivo, так и in vivo. Генотерапия ex vivo проводится в сочетании с трансплантацией гепатоцитов, когда больные клетки печени пациента, генетически скорректированные вне организма, повторно вводятся тому же пациенту (аутологичная трансплантация клеток). В отличие от этого, генотерапия in vivo, направленная на печень, основана в основном на внутривенных инъекциях, хотя в некоторых старых клинических испытаниях проводились инъекции через печеночную артерию. Передача генов ex vivo эффективна при заболеваниях, при которых экспрессия терапевтического гена обеспечивает потенциальное селективное преимущество в росте по сравнению с не корректированными клетками.¹ Однако результаты генной терапии печени ex vivo были неутешительными из-за ограниченного и непродолжительного приживления генетически модифицированных гепатоцитов и отсутствия пролиферативного преимущества корректированных гепатоцитов при большинстве наследственных метаболических заболеваний печени. Кроме того, применение ex vivo методов генотерапии печени осложняется необходимостью повторного удаления печеночной ткани для получения гепатоцитов и реинфузии генетически модифицированных клеток через воротную вену, а также ограниченной жизнеспособностью культивированных первичных гепатоцитов². Эти ограничения стали причиной неудачного исхода генотерапии гепатоцитов ex vivo в клиническом исследовании, проведенном почти 30 лет назад для лечения семейной гиперхолестеринемии, обусловленной гомозиготными мутациями LDLR.² Исходя из этих соображений, генотерапия наследственных метаболических заболеваний печени опирается на подходы in vivo. Наибольший клинический успех в генотерапии печени in vivo на сегодняшний день продемонстрировали векторы AAV. Механизм трансдукции клеток векторами AAV до конца не изучен, но, вероятно, происходит через рецептор-опосредованный эндоцитоз, после чего AAV способны покинуть эндосомы. AAV неэффективны при интеграции в геном клетки-хозяина, поэтому трансген экспрессируется через "эписомы", т.е. вне-хромосомные молекулы ДНК, которые неэффективно передаются дочерним клеткам после деления.

Векторы AAV могут вмещать последовательности размером до 4,5-5 кб, в то время как включение последовательностей более 5 кб значительно снижает их эффективность in vivo.³ Такая ограниченная грузоподъемность векторов AAV была основным препятствием для гемофилии А, мышечной дистрофии Дюшенна и болезни Штаргардта, но за редким исключением (например, карбамоилфосфатсинтетаза 1 [CPS1]) большинство наследственных метаболических заболеваний обусловлены дефектами генов, которые могут быть вмещены AAV. Многолетняя экспрессия терапевтического гена наблюдается после однократного введения вектора AAV в постмитотические или медленно реплицирующиеся ткани взрослого человека.⁴

Субъектами клинических испытаний генотерапии, направленной на печень, в большинстве случаев были взрослые люди с полностью выросшей печенью. В этом случае эффективная AAV-опосредованная трансдукция гепатоцитов не теряется из-за митотически активной и растущей печени. Напротив, введение вектора в животных моделях с растущей печенью сопровождалось потерей экспрессии трансгена, что указывает на то, что полные геномы вектора AAV не интегрируются в значительную часть клеток хозяина, и экспрессия трансгена теряется в активно реплицирующихся клетках.⁵ Хотя однократного введения вектора AAV может быть достаточно для достижения пожизненной коррекции при заболеваниях с низким терапевтическим порогом, таких как гемофилия, разведение вектора является ограничением при некоторых наследственных метаболических заболеваниях, требующих более высокого процента трансдукции гепатоцитов или вмешательства в раннем детстве.⁶

Несмотря на морфологическое сходство, гепатоциты различаются по своим метаболическим функциям вдоль порто-центральной оси. Эти различия включают дифференциальную экспрессию ферментов, участвующих в метаболизме углеводов, аминокислот, аммиака, липидов и образовании желчи.⁷ Поскольку зонирование печени играет важную роль в ее метаболических функциях, такое смещение трансдукции может иметь значение для генотерапии наследственных метаболических заболеваний. В то время как в печени мыши и собаки она происходит преимущественно в около-центральных областях, в печени не-человекообразных приматов трансдукция AAV происходит в основном в перипортальных областях печени⁸ , а у человека она неизвестна (рис. 1).

Fig. 1 Основные векторы и цели генной терапии, направленной на печень. AAV - аденоассоциированный вирус; CV - центральная вена; LNP - липидная наночастица; LV - лентивирусный вектор; PT - портальный тракт. Создано с помощью программы biorender.com.

Хотя лентивирусные векторы (LVs), защищенные от фагоцитоза, применяемые in vivo путем внутривенного введения, в основном используются для генотерапии ex vivo, было установлено, что они эффективны для переноса генов печени нечеловеческих приматов (NHP) без признаков токсичности или клональной экспансии трансдуцированных клеток⁹. Этот подход позволяет преодолеть ограничения, связанные с повышенной иммуногенностью и низким уровнем экспрессии трансгенов в не-экранированных LV-векторах.¹⁰ Более того, эффективная геномная интеграция LV-векторов дает им преимущество перед AAV-векторами при работе с растущей печенью. Кроме того, меньшая распространенность антител к ВИЧ среди населения делает LV привлекательными векторами для более широкой популяции пациентов. Однако векторы LV никогда не применялись in vivo у людей, и риски системных инъекций полностью неизвестны. Более того, риски, связанные с инсерционным мутагенезом при таком способе введения, также неизвестны.

Растущее число доклинических и клинических исследований показало, что мРНК, инкапсулированные в липидные наночастицы (LNPs) и вводимые системно, могут эффективно воздействовать на печень.11 В отличие от вирусных векторов, LNPs слабо доставляют ДНК в ядра гепатоцитов, но по сравнению с ДНК-генотерапией, мРНК не требуют транзита в ядро, что снижает риск генотоксичности. LNPs защищают мРНК от деградации, опосредованной нуклеазой, и ограждают ее от иммунной системы. LNPs интернализуются в гепатоциты и, попадая в эндосому, ионизируемые липиды вызывают выход эндосомы и высвобождение груза мРНК в цитоплазму. Однако мРНК обеспечивает преходящую экспрессию белка, зависящую от периода полужизни, и поэтому требует многократного пожизненного введения¹¹ (рис. 1).

Замена гена или увеличение гена основывается на добавлении нормальной копии мутировавшего гена. Редактирование генов подразумевает коррекцию генов, при которой патогенный вариант может быть отредактирован и, таким образом, "исправлен", или вставку генов, которая позволяет вставить весь терапевтический ген или кассету экспрессии в нужный локус в геноме хозяина. Коррекция генов - это технология, специфичная для мутаций, в то время как вставка генов не зависит от мутаций. Коррекция генов может быть достигнута с помощью различных нуклеазно-опосредованных подходов, которые основаны на геномном сайт-специфическом распознавании. Наиболее распространенная технология основана на использовании Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR-Cas9), соединенного с направляющей РНК, которая создает двунитевой разрыв (DSB) в нужном локусе.¹² DSB исправляется с помощью ДНК-шаблона, содержащего последовательность ДНК дикого типа, посредством процесса гомологически-направленной репарации (HDR), который ограничивается делящимися клетками. В отсутствие ДНК-шаблона механизм репарации ДНК основан на негомологичном концевом соединении (NHEJ), которое генерирует вставки и делеции (indels) для инактивации генов.¹³ Редактирование оснований использует редактор цитозиновых оснований (CBE) или редактор адениновых оснований (ABE)¹⁴ , которые представляют собой деаминазы, связанные с никазазой Cas9 и направляющей РНК CRISPR для модификации пары оснований в определенном локусе. CBE преобразует цитидин в урацил и, в конечном итоге, C-G в T-A. Редактирование, опосредованное ABE, преобразует пару оснований A-T в G-C. Прайм-редактирование объединяет сконструированную обратную транскриптазу, никазу Cas9 и направляющую РНК прайм-редактирования. Эта технология позволяет исправлять небольшие делеции, вставки или миссенс-мутации без создания DSB, которые чреваты ошибками.¹⁵ Программируемое добавление с помощью сайт-специфических таргетных элементов (PASTE) объединяет обратную транскриптазу, никаза Cas9 и сериновую интегразу. Эта технология позволяет вводить большие полезные нагрузки в делящиеся и не-делящиеся клетки.¹⁶ CRISPR-Cas9-редактирование, редактирование оснований и прайм-редактирование продемонстрировали доказательства эффективности в доклинических моделях наследственных метаболических заболеваний печени. Например, CRISPR-Cas9-редактирование было использовано для исправления миссенс-патогенного варианта в орнитин-транскарбамилазе (OTC)-дефицитных (Spf^ASH) мышах с помощью HDR, восстанавливая выживаемость и уреагенез.¹⁷ Кроме того, CRISPR-Cas9 была использована для инактивации несущественных печеночных генов путем NHEJ, действуя как субстрат-редуцирующая терапия при заболеваниях, связанных с накоплением токсичных метаболитов, таких как первичная гипероксалурия I типа.¹⁸ Более того, эта стратегия показала клиническую пользу для пациентов, страдающих транстиретиновым амилоидозом из-за накопления неправильно сформованного белка транстиретина, кодируемого мутировавшим геном TTR. Направляющие РНК и мРНК CRISPR-Cas9, нацеленные на TTR, доставленные с помощью LNP и введенные внутривенно, привели к значительному снижению концентрации TTR в плазме крови у взрослых пациентов, предотвратив тем самым синтез токсичного транстиретина.¹⁹ Редактирование оснований и праймирование продемонстрировали доказательство концепции в доклинической модели фенилкетонурии (PKU).^{20, 21}

Интеграция генов может быть достигнута путем гомологичной рекомбинации без участия нуклеазы, но с очень низкой скоростью, и коррекция фенотипа заболевания может быть получена только в том случае, если селективное преимущество приводит к репопуляции печени гепатоцитами с интегрированным терапевтическим геном. Гомологичные плечи фланкируют трансген, тем самым обеспечивая интеграцию в выбранный локус. Другой подход заключается в использовании гомологичной рекомбинации с нуклеазой для создания DSB, что значительно увеличивает скорость интеграции. Эти нуклеазы могут быть сайт-специфичными, используя направляющую РНК Cas9, или неспецифичными, разрезая по более простому мотиву, как, например, piggyback transposase. Все стратегии интеграции генов показали свою эффективность в доклинических моделях наследственных метаболических заболеваний печени.^22-24

Несколько наследственных метаболических заболеваний были рассмотрены в качестве мишеней для генотерапии, направленной на печень. Наиболее привлекательными мишенями являются заболевания, тяжесть которых оправдывает риски новых методов лечения и которые имеют высокую распространенность. Кроме того, привлекательными кандидатами являются заболевания, которые могут быть полностью скорректированы путем переноса генов печени и требуют небольшого процента коррекции гепатоцитов для достижения клинического эффекта. Объем коррекции в конечном итоге зависит от величины метаболического потока через биохимический путь на клеточном и органном уровне.

Поскольку трансплантация печени остается единственным методом лечения, несколько нарушений цикла мочевины были предложены в качестве кандидатов для генотерапии, направленной на печень. Для лечения дефицита CPS1 размер гена CPS1 и ограниченные возможности упаковки AAV потребовали применения раздельного подхода с использованием двух векторов AAV.²⁵ Тем не менее, в доклинических исследованиях дефицита CPS1, а также других нарушений цикла мочевины, AAV продемонстрировали коррекцию фенотипа с увеличением выживаемости, улучшением роста, нормализацией концентрации аммиака и аминокислот в плазме (обзор Duff et al.26). Доклинические исследования дефицита OTC привели к первому клиническому испытанию I/II фазы генной терапии AAV8 на людях для взрослых с поздним развитием дефицита OTC, спонсируемому компанией Ultragenyx (NCT02991144), в котором семь пациентов из 11 были признаны ответившими на лечение. В настоящее время идет набор участников в исследование III фазы (NCT05345171). Кроме того, еще одно клиническое исследование, направленное на борьбу с дефицитом ОТС у детей, с использованием гепатотропного вектора AAV-LK03, спонсируемое Университетским колледжем Лондона (NCT05092685), находится на стадии набора участников после того, как оно показало безопасность в NHP²⁷ и снижение серораспространенности капсида AAV-LK03.²⁸ При сравнении концентрации FVIII в плазме крови в клинических испытаниях при гемофилии А с использованием сопоставимых доз вектора,^{29, 30} оказалось, что AAV-LK03 трансдуцирует гепатоциты человека на порядок лучше, чем AAV8, что соответствует наблюдениям, сделанным в других исследованиях.^31-33

Ограничения генотерапии AAV проявились при лечении нарушений цикла мочевины на неонатальных животных моделях.³⁴ Недостаточная эффективность повторных введений AAV из-за иммунного ответа против AAV³⁵ способствовала необходимости разработки новых стратегий, основанных на редактировании генома или доставке с помощью не-вирусных векторов. Генная коррекция была успешно проведена у мышей с дефицитом OTC путем CRISPR-Cas9-редактирования единственной миссенс-мутации, что позволило исправить гипераммонемию.³⁶ Однако из-за отсутствия общих мутаций при нарушениях цикла мочевины подходы, ориентированные на редактирование мутаций, принесут пользу лишь небольшому числу пациентов. Чтобы преодолеть эту проблему, была разработана стратегия интеграции целых трансгенов. Опосредованная нуклеазой широкая интеграция в геном хозяина с использованием транспозазы piggyback привела к фенотипической коррекции у мышей с цитруллинемией и OTC-дефицитом.²³ В качестве альтернативы интеграция трансгена может быть осуществлена в определенный локус генома хозяина путем опосредованной нуклеазой интеграции с гомологичными рекомбинационными последовательностями, картирующими локус интеграции и фланкирующими оба конца трансгена. Это было успешно осуществлено на мышах с дефицитом OTC.^{17, 24}

Не-вирусная генотерапия с использованием повторных системных инъекций LNPs, содержащих мРНК, показала эффективное нацеливание на печень и фенотипическую коррекцию мышиных моделей дефицита OTC,^{37, 38} дефицита аргининосукцинат-лиазы^{39, 40} и дефицита аргиназы.^{41, 42}

Синдром Криглера-Наджара, обусловленный дефицитом фермента уридиндифосфоглюкуронат-глюкуронозилтрансферазы 1А1 (UGT1A1), долгое время считался отличной мишенью для генотерапии, направленной на печень. Отсутствие UGT1A1 приводит к тяжелой не-конъюгированной гипербилирубинемии, которая может стать причиной необратимых неврологических повреждений и смерти. Длительная ежедневная фототерапия частично контролирует желтуху, но единственным окончательным лечением является трансплантация печени. Недавние результаты эскалации дозы в исследовании I/II фазы генотерапии на основе AAV8 показали устойчивую концентрацию билирубина в сыворотке ниже токсического порога, позволяющую прекратить фототерапию в когорте с высокой дозой.⁴³ Те же проблемы, что и при дефиците OTC, возникли и при направленной на печень генотерапии синдрома Криглера-Наджара у новорожденных/педиатрических пациентов, поскольку прогрессирующая потеря эписомных вирусных геномов AAV со временем, вследствие пролиферации гепатоцитов, приводит к снижению как экспрессии трансгенов, так и эффективности лечения. Для преодоления этих препятствий и достижения долгосрочной эффективности, как и в случае с дефицитом ОТС, вставка UGT1A1 после промотора альбумина с помощью CRISPR/SaCas9 привела к долгосрочной коррекции.⁴⁴ Этот подход позволяет (i) увеличить скорость нацеливания на ген; (ii) повысить уровень экспрессии трансгена; (iii) постоянно модифицировать геном с терапевтической эффективностью на протяжении всей жизни; (iv) использовать мутационно-независимый подход, поскольку векторы AAV можно использовать для всех вызывающих болезнь мутаций UGT1A1. Однако существуют и ограничения, такие как необходимость использования двух независимых AAV-векторов, один из которых доставляет Cas9 и направляющую РНК, а другой содержит UGT1A1 без промотора, фланкированный областями гомологии альбумина. Несмотря на огромный потенциал, CRISPR/Cas9 все еще имеет ряд проблем с безопасностью и эффективностью, ограничивающих клиническую разработку. Вне-целевые эффекты - одна из главных проблем, которая привела к разработке более точных Cas9 и улучшению дизайна gRNA.⁴⁵ Тем не менее, неожиданные вне-целевые эффекты все еще могут возникать, и их трудно предсказать, используя эталонную последовательность генома человека, которая не учитывает разнообразие генома человека.⁴⁶ Редактирование генома с помощью CRISPR/Cas9 ингибируется опухолевым супрессором p53 и усиливается при мутации p53.^47-49 Эти данные вызвали опасения, что CRISPR/Cas9 может привести к распространению p53-инактивирующих мутаций в исправленных клетках и, в конечном итоге, к раку.

Дополнительным препятствием является уже существующий иммунитет против Cas9, поскольку недавние исследования выявили циркулирующие антитела против SpCas9 и SaCas9 и Т-клеток памяти против SpCas9 у большинства взрослых людей.^{50, 51} Хотя это не удивительно, учитывая, что бактериальные штаммы, экспрессирующие эти Cas9, часто заражают людей, уже существующий иммунитет может ограничить применение in vivo доставленных AAV Cas9, вызывая цитотоксический Т-клеточный ответ против Cas9-экспрессирующих гепатоцитов и потерю отредактированных клеток.⁵² Потенциальные решения, позволяющие избежать иммунного ответа на CRISPR-Cas9, включают использование CRISPR-Cas систем, с которыми человек ранее не сталкивался⁵³, или преходящую доставку мРНК или белка Cas9 с помощью химически модифицированных LNPs.^{54, 55}

Органические ацидемии, особенно метилмалоновая (ММА) и пропионовая ацидемии (PA), были объектами нескольких доклинических исследований по генной заместительной терапии, и недавно они были рассмотрены Chandler and Venditti⁵⁶. Интеграция целого трансгена была успешно осуществлена с помощью вектора AAV без промотора и без нуклеазы с использованием гомологичной рекомбинации в локус альбумина генома хозяина. Такая фенотипическая коррекция наблюдалась как в неонатальной, так и в ювенильной модели мыши ММА.^{22, 57} Хотя процент исправленных гепатоцитов был низким, селективное преимущество показало частичную прогрессивную репопуляцию родной печени ММА отредактированными гепатоцитами, от 2% до 15% за 15 месяцев. Фенотип не был полностью исправлен с сохранением сильно нарушенного роста. Эта доклиническая работа привела к клиническим испытаниям I/II фазы, спонсируемым компанией Alexion Pharmaceuticals, с использованием капсида AAV-LK03 (NCT04581785). В ходе этого испытания у двух пациентов развилась тромботическая микроангиопатия (ТМА), не предсказанная доклиническими исследованиями на мышах, которая разрешилась при поддерживающем лечении. Клиническое исследование было временно приостановлено FDA, а затем прекращено.

Терапия LNP-мРНК была успешно проведена в неонатальной летальной⁵⁸ и ювенильной⁵⁹ моделях мышей с ММА. Фармакокинетика показала недельное сохранение экспрессии белка MMUT после системного введения, а еженедельные повторные введения в течение 5 недель привели к фенотипической коррекции без проблем с безопасностью. Эти исследования привели к клиническому испытанию I/II фазы, спонсируемому компанией Moderna Therapeutics, в настоящее время набирающей пациентов с педиатрическим ММА (NCT04899310). Та же терапевтическая платформа продемонстрировала доказательство концепции на фибробластах пациентов с PA⁶⁰ и гипоморфных мышах с PA.⁶¹ Интересно, что в этом подходе использовалась двойная мРНК, когда мРНК PCCA и PCCB были заключены в биодеградируемые LNPs для лечения фенотипа PA, обусловленного двумя генными дефектами, приводящими к PA. Эта работа привела к переводу на другие языки: в настоящее время проводится клиническое испытание I/II фазы, спонсируемое компанией Moderna Therapeutics, в котором участвуют пациенты с педиатрическим PA (NCT04159103).

Болезнь Вильсона, обусловленная дефектами в гене ATP7B, лечится хелаторами меди и солями цинка, которые имеют побочные эффекты и не нормализуют метаболизм меди. Генотерапия AAV с использованием AAV8, кодирующего полную длину человеческого гена ATP7B, была протестирована на взрослых мышах с болезнью Вильсона и позволила восстановить физиологическое выделение меди с желчью в ответ на перегрузку медью и отсутствие гистологических изменений в печени.^{62, 63} Поскольку ген ATP7B имеет размер 5,2 кб и достигает максимальной емкости упаковки AAV, ген miniATP7B, в котором четыре из шести металл-связывающих доменов были удалены из кодирующей последовательности ATP7B дикого типа, был упакован в разработанный гепатотропный капсид AAV-Anc80 и успешно протестирован на взрослых мышах с болезнью Вильсона с аналогичной эффективностью в повышении выживаемости, восстановлении гомеостаза меди и предотвращении повреждения печени.^{64, 65} Разделенный подход с использованием двух векторов AAV, кодирующих каждую половину трансгена дикого типа, со стратегией гомологичной рекомбинации для получения белка ATP7B полной длины также был успешно испытан на мышах с болезнью Вильсона.⁶⁶

Эти доклинические исследования проложили путь к клиническим испытаниям AAV, направленных на печень и направленных на болезнь Вильсона. В настоящее время в двух исследованиях участвуют взрослые пациенты с болезнью Вильсона со стабильным заболеванием печени: i) исследование GATEWAY, спонсором которого является компания Vivet Therapeutics, оценивает безопасность и эффективность VTX-801, капсида AAV-Anc80, кодирующего ген miniATP7B, в клинических испытаниях фазы I/II (NCT04537377); ii) клиническое исследование Cyprus2+, спонсором которого является компания Ultragenyx, оценивает безопасность и эффективность UX701, вектора AAV9, кодирующего ген miniATP7B (NCT04884815). Интересно, что недавние доклинические данные показали, что AAV-опосредованное редактирование генома печени без нуклеаз, направленное на интеграцию miniATP7B без промотора в локус альбумина, привело к обширной репопуляции печени в результате пролиферативного преимущества перед клетками, не подвергшимися редактированию.⁶⁷

С ростом доказательств безопасности и эффективности клинической генотерапии, опосредованной AAV, число заболеваний-мишеней для генотерапии быстро увеличивается, включая заболевания с доступными, но все еще громоздкими методами лечения, такие как болезнь хранения гликогена типа Ia (GSDIa), болезнь мочи с запахом кленового сиропа (MSUD) и PKU. GSDIa обычно лечится с помощью диетотерапии, чтобы поддерживать нормальную концентрацию глюкозы в крови, предотвращать гипогликемию и обеспечивать оптимальное питание для роста и развития. Направленная в печень AAV-опосредованная доставка гена, кодирующего глюкозо-6-фосфатазу (G6PC), дефектную при GSDIa, предотвращала гипогликемию в мышиной и собачьей моделях GSDIa, даже при низком уровне экспрессии (3-5 % от активности дикого типа). Однако из-за потери генома вектора в результате регенерации печени, необходимости одновременного воздействия на печень и почки и неизвестные долгосрочные печеночные осложнения (например, опухоли печени) вызывают опасения в отношении AAV-опосредованной генотерапии. Тем не менее, предварительные данные текущего клинического испытания фазы 1/2 (NCT03517085) свидетельствуют о некоторой степени эффективности при увеличении толерантности к голоданию. Генотерапия этих расстройств была недавно рассмотрена в этом журнале Koeberl et al.⁶⁸ Не-вирусная мРНК-терапия также продемонстрировала доказательство этой концепции при GSDIa,⁶⁹ что открывает путь для клинического испытания фазы 1/2, проводимого компанией Moderna (NCT05095727), в настоящее время набирающей взрослых и педиатрических пациентов, страдающих GSDIa.

MSUD обусловлен дефицитом дегидрогеназы 2-кетокислот с разветвленной цепью, представляющей собой мультимерный ферментный комплекс, состоящий из четырех компонентов: E1α и E1β, субъединицы дигидролипоилтрансацилазы (E2) и дигидролипоамиддегидрогеназы (E3). При классической тяжелой форме MSUD, когда остаточная активность фермента составляет менее 3%, накопление лейцина приводит к коме и отеку мозга вскоре после рождения и ранней смерти при отсутствии агрессивного и своевременного лечения. Однократное введение вектора AAV неонатальным мышам с MSUD, имеющим дефекты E1α или E1β, привело к длительному выживанию животных и устранению фенотипа заболевания.^{70, 71} Ограниченный печенью перенос генов с помощью специфического для печени промотора обеспечил частичную коррекцию фенотипа MSUD, предполагая, что для достижения полной терапевтической эффективности необходима внепеченочная экспрессия фермента. При использовании вездесущего промотора было достигнуто долгосрочное избавление от болезни, что согласуется с окислением аминокислот с разветвленной цепью, которое происходит в нескольких тканях, особенно в мышцах.

Различные подходы к генной терапии PKU были рассмотрены Martinez et al.⁷² В доклинических моделях наблюдалась устойчивая фенотипическая коррекция.

Для решения проблемы быстрой эписомной потери AAV-опосредованной экспрессии трансгенов в растущей печени были разработаны интегративные стратегии с лентивирусной генотерапией in vivo, обеспечивающей селективное преимущество трансдуцированных гепатоцитов за счет ингибирования ферментативной системы Cypor, участвующей в защите от токсичности, связанной с парацетамолом. Ингибирование Cypor в условиях повторного воздействия парацетамола обеспечило положительный отбор трансдуцированных гепатоцитов для репопуляции родной печени и коррекцию фенотипа у мышей с PKU⁷³.

Подход к редактированию генов с использованием двойной системы AAV8 показал эффективность исправления миссенс-мутации, переносимой мышью Pahenu2/enu2, с помощью Cas9 и HDR, но при этом обеспечил низкую частоту редактирования гепатоцитов (от 1% до 13%), что позволило лишь частично снизить системную концентрацию фенилаланина⁷⁴. Редактирование оснований с помощью CBE, доставленного вектором AAV8, позволило исправить миссенс-мутацию у мышей PKU в более 20% гепатоцитов с полной коррекцией фенотипа и нормализацией уровня фенилаланина.²¹ Аналогичный результат был достигнут с помощью редактора оснований, доставленного в виде LNP-инкапсулированной мРНК.⁷⁵ Редактирование оснований позволило вылечить неонатальных мышей PKU с 11% исправленных гепатоцитов, однако с использованием высокоиммуногенного аденовирусного вектора в высоких дозах, что ограничивает его трансляцию с этим вектором.²⁰

Не-вирусная стратегия с использованием LNP-мРНК, требующая повторного системного введения, продемонстрировала доказательство концепции на мышах с PKU.^{76, 77}