Митохондрии являются основным местом производства АТФ посредством процесса окислительного фосфорилирования (OXPHOS).¹ Система OXPHOS состоит из пяти многосубъединичных белковых комплексов (комплексы I-V), расположенных на внутренней митохондриальной мембране.² Однако роль митохондрий выходит за рамки простого производства энергии, поскольку они являются местом многих других метаболических и сигнальных путей. К ним относятся метаболизм одного углерода,³ биогенез железо-серных кластеров,⁴ производство реактивных форм кислорода, которые необходимы для многих биологических процессов, включая антиоксидантную защиту⁵ и активацию апоптоза.⁶ Промежуточные продукты, образующиеся в митохондриях, также необходимы для биосинтеза пуринов и пиримидинов.⁷ Считается, что около 1500 белков имеют митохондриальную локализацию и функцию.^{8, 9} Большинство из них кодируются ядерным геномом, поскольку митохондриальная ДНК (мтДНК), расположенная внутри митохондрий, представляет собой циклическую молекулу размером ~16,5 Кб, содержащую всего 37 генов, кодирующих 13 полипептидов, 22 тРНК и 2 рРНК.¹⁰ За исключением комплекса II, который полностью кодируется ядерной ДНК,¹¹ комплексы OXPHOS зависят от мтДНК, которая кодирует субъединицы, расположенные в комплексах I, III, IV и V.¹⁰

Первичные митохондриальные нарушения PMDs - это моногенные заболевания, возникающие в результате унаследованных или de novo патогенных вариантов генов, которые приводят к нарушениям OXPHOS, структуры или функции митохондрий.¹² По отдельности они встречаются редко, но в совокупности - часто, их частота составляет 1: 4300.¹³ Генетика митохондриальных заболеваний сложна, поскольку они могут быть результатом патогенных вариантов как в мтДНК, так и в ядерных генах. В то время как наследование вариантов ядерных генов может быть аутосомно-доминантным,¹⁴ рецессивным или Х-сцепленным,^15,16 мтДНК наследуется исключительно по материнской линии.¹⁷ Кроме того, каждая клетка содержит несколько сотен копий молекулы мтДНК, что приводит к появлению понятий "гетероплазмия мтДНК" (наличие как нормальной, так и мутировавшей мтДНК в одной клетке), "пороги гетероплазмии" (процент гетероплазмии патогенного варианта, необходимый для возникновения митохондриальной дисфункции) и "гомоплазмия" (наличие однородной популяции мтДНК в клетке). В настоящее время считается, что существует ~400 генов ядерной и мтДНК, связанных с PMDs и с появлением секвенирования нового поколения это число продолжает расти.¹⁸ Такая генетическая гетерогенность создает значительные проблемы не только для диагностики, но и для разработки методов лечения.

В настоящее время для большинства PMDs не существует одобренных методов лечения, изменяющих течение болезни. Некоторые заболевания положительно реагируют на специфические витамины или ко-факторы, включая дефицит SLC19A3, который реагирует на добавки биотина и тиамина,¹⁹ дефициты ACAD9, FLAD1 и транспортера рибофлавина, которые реагируют на рибофлавин^{20, 21} и дефициты COQ₂, COQ₆ и COQ_8B, которые реагируют на добавки коэнзима CoQ₁₀ (CoQ₁₀) в высоких дозах.²² Кроме того, несколько экспериментальных низкомолекулярных препаратов проходят испытания на пациентах с PMDs хотя ни один из них не направлен на устранение основной генетической причины. Из них только idebenone, окислительно-восстановительный модулятор и аналог CoQ₁₀, был одобрен в Европе для лечения Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON)²³ , а omaveloxolone (Skyclarys), который действует через комбинацию активации Nrf2 и ингибирования NF-κB, недавно получил одобрение FDA для лечения Friedreich Ataxia.

Генотерапия может быть определена как лечение, которое исправляет основную генетическую аномалию в пораженных клетках или у людей с моногенным расстройством. Тип генной терапии, применимой к PMDs зависит от того, где находится генетический дефект - в ядерной ДНК или в мтДНК.

При дефектах ядерных генов традиционные методы "замены генов" предусматривают доставку "правильной" (дикого типа [WT]) копии мутировавшего гена (интересующего гена/трансгена) в ядро клеток-мишеней. Затем ген WT восстанавливает нормальную функцию белка. Этот подход применим к рецессивным заболеваниям, поскольку эффект патогенных вариантов с усиленной функцией не будет отменен экспрессией WT-копии гена. Другой тип генотерапии - терапия на основе РНК. Вместо трансгена в виде ДНК может быть предоставлена РНК-версия той же терапевтической последовательности. РНК-терапия может функционировать так же, как и восстановление генов, или может быть сконструирована таким образом, чтобы "отключать" или "выключать" экспрессию других генов, например, с помощью малых интерферирующих РНК (siRNAs) или увеличивать экспрессию с помощью малых активирующих РНК. Третья форма генотерапии - редактирование генов, которое направлено на исправление патогенных вариантов существующих генов в клетках без введения новых полноразмерных копий целевого гена. Сюда входит редактирование генов с помощью CRISPR-Cas9 для разрезания и рекомбинации ДНК и редактирования оснований.

Для лечения PMDs вызванных патогенными вариантами мтДНК, также могут применяться подходы к восстановлению генов, при этом трансген экспрессируется в ядре, транслируется цитозольными рибосомами, а белковый продукт модифицируется, чтобы содержать митохондриальную таргетную последовательность (MTS) для обеспечения импорта в митохондрии; этот подход известен как "аллотопическая экспрессия". Однако следует отметить, что импорт в митохондрии и правильная сборка в комплексы OXPHOS аллотопически экспрессированных с помощью мтДНК-кодированных белков требует дальнейшего экспериментального подтверждения. Другой метод - использование сконструированных ферментов, таких как нуклеазы с цинковыми пальчиками (ZFN), нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALEN), и мегануклеазы, для специфического распознавания и введения двуцепочечных (ds) разрывов в ДНК, содержащей патогенные варианты. Хотя индукция разрывов dsДНК в сочетании с гомологичной рекомбинацией (HR) правильной копии гена в принципе может быть применена к ядерной ДНК в контексте лечения PMDs до сих пор этот подход использовался только для нацеливания и разрушения молекул мтДНК, содержащих патогенные варианты, что приводит к сдвигу гетероплазмии в сторону WT-молекул. Однако этот метод не может быть применен к гомоплазматическим вариантам, поскольку это приведет к истощению мтДНК. В то время как редактирование генов CRISPR-Cas9 еще не было адаптировано к вариантам мтДНК, связанным с PMDs из-за неэффективного импорта РНК в митохондрии человека, новые технологии редактирования оснований без CRISPR позволяют редактировать отдельные основания мтДНК без необходимости импорта направляющих РНК через мембраны митохондрий.

Существуют два различных метода доставки генов. Она может осуществляться in vivo, когда гены вводятся непосредственно больному человеку, или ex vivo, когда соответствующие клетки, например гемопоэтические стволовые клетки, берутся у пациента, подвергаются генной терапии и затем вводятся обратно человеку.²⁴ Для переноса генов in vivo могут использоваться различные пути введения в зависимости от того, на какой орган направлено воздействие. Например, для периферических органов, таких как печень, предпочтительно использовать внутривенный (IV) путь, для заболеваний глаз и ушей - внутриглазной или внутрикохлеарный пути, соответственно, а для воздействия на определенные области центральной нервной системы (ЦНС) - внутривенный, внутричерепной или интратекальный пути.²⁵ Таким образом, выбор способа доставки зависит от характера заболевания, подлежащего лечению, в том числе от того, какие органы должны быть объектом воздействия.

Обоснование применения генной терапии при PMDs обусловлено тем, что эти заболевания обычно являются клеточно-автономными, поэтому отсутствующий продукт гена не является секретируемым белком/ферментом, а болезнь не связана с накоплением вредного субстрата. Замена недостающего белка в циркуляции вряд ли приведет к коррекции заболевания в тканях, поэтому эти расстройства вряд ли поддадутся заместительной ферментной терапии или трансплантации костного мозга. Исключением является митохондриальная нейрогастроинтестинальная энцефаломиопатия (MNGIE), вызванная биаллельными патогенными вариантами TYMP, где болезнь частично обусловлена вредным накоплением тимидина (Thd), которое может быть устранено путем замены недостающего фермента тимидинфосфорилазы (TP) с помощью аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток²⁶. Кроме того, при некоторых PMDs например, дефиците DGUOK,²⁷ дефиците TYMP,²⁸ и дефиците ETHE1,²⁹ трансплантация печени имеет определенный успех, но не исправляет болезнь в мозге.³⁰ Генотерапия имеет возможность воздействовать одновременно на несколько органов, включая ЦНС, что делает ее привлекательной, поскольку PMDs обычно затрагивают несколько различных систем органов.

2 METHODS...

Невирусные подходы включают физические методы бомбардировки клеточных мембран (гидродинамическая инъекция ДНК, biolistic методы),^{31, 32} химические методы (мицеллы катионных surfactants, родаминовые наночастицы, липосомы)^32-34 и использование эндогенного механизма импорта через MTS-опосредованный импорт через транслокатор комплексов внешней/внутренней мембраны в митохондрии.³⁵ Многие из не вирусных методов находятся на предварительных стадиях in vitro и ограничены низкой эффективностью трансфекции, слабой специфичностью для митохондрий или неудачей из-за цитотоксичности.³⁶ Поэтому ни одна из этих стратегий не продвинулась дальше в трансляционной линии для PMDs.

Вирусные векторы более эффективны в достижении трансдукции клеток, чем не вирусные методы. Вирусные векторы сконструированы таким образом, что сохраняют основу естественного вируса, заменяя эндогенный вирусный геном на интересующий ген, но сохраняя способность вируса эффективно инфицировать клетки. Наиболее перспективными векторами генотерапии в настоящее время являются рекомбинантные адено-ассоциированные вирусы (rAAV). Естественно встречающиеся AAV принадлежат к семейству парвовирусов и обычно не вызывают заболеваний у людей. Они требуют одновременной инфекции другим компетентным к репликации вирусом, таким как аденовирус³⁷ , без которой они переходят в состояние латентности, либо интегрируя свои геномы в определенную область хромосомы 19³⁸, либо оставаясь эписомальными в ядре.³⁹ Жизненный цикл естественно возникающих AAV показан на рисунке 1A. Естественные AAV встречаются в ~12 различных серотипах, каждый из которых отражает уникальный паттерн тканевого тропизма (нацеливания).^{40, 41} Сравнение IV биораспределения AAV1-9 у взрослых мышей показало перекрывающийся тканевый тропизм различных серотипов.⁴⁰ Существует также несколько новых серотипов инженерных AAV с превосходной способностью трансдуцировать определенные ткани.^{42, 43} Тканевой тропизм rAAVs показан на рисунке 1B.



FIGURE 1 (A) Life cycle of AAVs. AAVs transduce cells by binding glycosylated cell surface receptors which enable them to be endocytosed. There they fuse with endosomes whose low pH or proteases are thought to activate specific viral proteins which enable breach of the endosomal membrane, endosomal rupture and virion escape into the cytosol as nuclear pore entry. Viral uncoating then occurs. Naturally occurring AAVs contain single stranded (ss) genomes which first require second strand synthesis to yield a closed dsDNA molecule followed by integration into the host genome. Replication only occurs in the presence of co-infection with a helper virus and recruitment of various host cell replication factors (not shown). Viral genomes may also exist extra-chromosomally as circular monomers/dimers/concatemers. Self-complementary (sc) AAVs are a type of ss rAAV which possess a palindromic structure that enables the genome to form a dsDNA structure without requiring second strand synthesis. B: Recombinant AAV (rAAV) genome structure, serotypes and tissue tropism. In AAV vector production, the gene of interest is contained in a plasmid with intact AAV2-derived inverted tandem repeat (ITR) sequences flanking on either side. In two-plasmid AAV vector production systems, a packaging plasmid containing the Rep and Cap genes is used to generate rAAVs. Differences in the Cap genes used results in production of classical serotypes (e.g., AAV2/1-9), which have different capsids resulting in an ability to transduce different target tissues. Novel caspids have been developed in a similar manner.

TALENs - это нуклеазы, которые специфически расщепляют ДНК целевой последовательности. ДНК-связывающие домены TALE, используемые в TALEN, происходят от бактерий Xanthomonas, которые вторгаются в клетки растений и активируют промоторы хозяина для эффективного заражения и распространения.⁹⁵ Специфическое связывание последовательности ДНК TALEN обеспечивается модулями длиной 34 аа. Каждый из этих модулей связывает сайт длиной 1 п.н. через repeat variable diresidues (RVDs). Изменяя RVD в каждом модуле и соединяя несколько модулей в длинный массив, можно добиться новой специфичности ДНК. TALEN представляют собой гетеродимерные белки: каждый мономер предназначен для связывания определенной целевой последовательности ДНК и присоединен к не зависящему от последовательности эндонуклеазному домену из фермента IIS типа FokI (рис. 2A). Успешное связывание TALEN и димеризация FokI приводят к расщеплению ДНК. Это используется для использования отсутствия механизмов репарации разрывов dsДНК в мтДНК, что приводит к быстрой деградации расщепленных молекул мтДНК.⁹⁶ Таким образом, цель состоит в том, чтобы вызвать сдвиг гетероплазмии мтДНК в сторону мтДНК WT.



FIGURE 2 (A) The architecture of a dimeric mitochondrially targeted transcription activator-like effector (TALE) nuclease (mitoTALEN). This programmable nuclease contain the MTS from superoxide dismutase 2 (SOD2) and/or the COX8 subunit of complex IV plus subunit 9 of Neurospora crassa ATPase 9 (COX8–Sub9) and obligatory heterodimeric, ELD(-) and KKR(+), FokI nuclease domains of Type IIS restriction enzyme. (B) Schematic structure of the dimeric mitochondrial zinc-finger nuclease (mtZFN) architecture. Mitochondrial targeting of mtZFNs is facilitated by a 49-amino-acid MTS from subunit F1Я of human mitochondrial ATP synthase. Similarly to mitoTALENs, mtZFN encompass obligatory heterodimeric FokI nuclease domains (ELD(-) and KKR(+)). NES, nuclear export signal; ZFP, zinc-finger peptide. (C) The schematic structure of mitochondrial maganuclease (mitoARCUS). The ARCUS programmable nuclease for mtDNA editing is based upon the Chlamydomonas reinhardtii chloroplast homodimeric homing endonuclease I-CreI. Native I-CreI is a homodimeric enzyme that cuts DNA by binding to a 22-bp double-stranded DNA sequence. ARCUS meganucleases have been engineered to operate as monomers, with novel sequence specificity being achieved through directed evolution and in silico design. mitoARCUS contains a mitochondrial targeting sequence (MTS) from the nuclear gene encoding the COX8 subunit of complex IV.

Bacman et al.⁹⁷ разработали митохондриально нацеленные TALEN (mitoTALEN), которые можно использовать для нацеливания на молекулы мтДНК, содержащие точечные мутации или крупномасштабные делеции мтДНК. Чтобы нацелиться на точечную мутацию m.14459G>A в гетероплазматических культивируемых клетках, был разработан специфичный для мутации мономер mitoTALEN, распознающий сайт мутации. Когда этот мономер димеризуется с мономером-компаньоном, связывающим мтДНК на противоположной нити, образуется разрыв dsДНК. Мономеры не разрезают мтДНК WT, поскольку она не распознается специфичным для мутации мономером, предотвращающим димеризацию. В другом случае мономеры mitoTALEN были сконструированы таким образом, чтобы связывать ДНК WT, фланкирующую по обе стороны от делеции 5 Кб (общая делеция, m.8483_13459del4977).⁹⁷ Таким образом, домены FokI находились в достаточной близости, чтобы димеризоваться друг с другом в присутствии делеции в 5 Кб, расщепляя мтДНК с делецией и оставляя нормальные молекулы мтДНК нетронутыми. Экспрессия MitoTALEN в cybrid клетках остеосаркомы человека 143B, гетероплазматических по делеции 5 Кб, привела к снижению процента молекул мтДНК, содержащих делецию, и соответствующему увеличению процента нормальной мтДНК, хотя также наблюдалось преходящее снижение (истощение) общего количества мтДНК.

Reddy et al.⁹⁸ исследовали использование mitoTALEN в клетках, гетероплазмичных для LHON с дистонией (LHOND) и синдрома нейропатии, атаксии, пигментного ретинита (NARP). Исследователи использовали цибридные ооциты, созданные в результате слияния мышиных ооцитов с фибробластами пациентов. Затем эти клетки были слиты с цибридными клетками остеосаркомы 143B, гетероплазматическими по m.14459G>A. В полученные клетки вводили мРНК, кодирующую mitoTALEN, который нацелен на вариант m.14459G>A. Анализ клеток показал уменьшение количества мтДНК, содержащей вариант LHOND. Аналогичный подход был использован для воздействия на цибридные ооциты и иммортализованную линию клеток с мутацией m.9176T>C, связанной с NARP. Использование mitoTALENs, нацеленных на m.9176T>C, показало сдвиг гетероплазмии в сторону мтДНК WT через 72 часа после трансфекции.

Pereira et al. показали, что mitoTALENs могут быть усовершенствованы путем использования альтернативной мономерной нуклеазы меньшего размера (I-TevI), которая может быть сконструирована для распознавания специфических вариантов мтДНК (mitoTev-TALEs). Эта методология была использована для сдвига гетероплазмии в сторону WT мтДНК и устранения дефицита OXPHOS в цибридах, полученных от пациентов, гетероплазмированных по m.8344A>G, и которая ассоциируется с миоклонической эпилепсией с лохматыми красными волокнами.⁹⁹

mitoTALEN также был успешно применен in vivo для спасения мышиной модели митохондриальной кардиомиопатии m.5024C>T. Вариант m.5024C>T дестабилизирует митохондриальную tRNA^Ala, что влияет на митохондриальную трансляцию.¹⁰⁰ У мышей с вариантом m.5024C>T снижается общая масса тела, развивается кардиомиопатия и дефицит COX в скелетных мышцах и толстой кишке. Bacman et al.¹⁰¹ использовали векторы AAV9 для одновременной экспрессии двух мономеров mitoTALEN, один из которых распознает патогенный вариант, а затем димеризуется со вторым мономером, вызывая расщепление мтДНК ниже по течению от локуса варианта. Внутримышечное введение каждого вектора AAV9 в концентрации 1,0-1,5 [ 10¹² vg/мышь приводило к восстановлению мтДНК WT, а также экспрессии tRNA^Ala. Внутривенное введение векторов AAV9 ювенильным мышам в возрасте 2-3 недель и внутрибрюшинное введение неонатальным мышам в той же дозе на мышь приводило к хорошей трансдукции тканей скелетных мышц и сердца, что приводило к сдвигу гетероплазмии в сторону WT мтДНК, не вызывая истощения мтДНК в этих органах.

ZFNs - это еще один тип нуклеаз, которые использовались для расщепления мутантных молекул мтДНК. ZFNs состоят из модульных и преобразуемых, специфичных для последовательности ДНК-связывающих пептидов с цинковыми пальцами, соединенных с доменом FokI. Для создания в ДНК DSBs два мономера ZFNs должны находиться в непосредственной близости, что позволяет FokI димеризоваться (рис. 2B). Minczuk et al.¹⁰² сообщили о версии митохондриального ZFN, оснащенной MTS, - mtZFNs. Подобно mitoTALENs, димерная архитектура mtZFNs позволяет нацеливаться как на точечные мутации, так и на делеции мтДНК. В соответствии с этим mtZFNs были использованы для сдвига гетероплазмии мтДНК в клетках с точечной мутацией m.8993 T>G и общей делецией 5 Кб (m.8483 ^{103, 104} В этих экспериментах клетки, стабильно или транзиторно трансфицированные mtZFNs, демонстрировали существенный сдвиг гетероплазмии в сторону мтДНК WT, за которым следовало восстановление числа копий мтДНК, причем изменения в уровне мутантов были стабильными с течением времени и приводили к улучшению функции митохондрий.

После обширных экспериментов in vitro Gammage et al.¹⁰⁵ исследовали mtZFNs in vivo, используя установленную модель мыши m.5024C>T с помощью AAV. Таким образом, потребовалась совместная экспрессия обоих мономеров, каждый из которых был представлен отдельным вектором AAV9.⁴⁵ (кардиотрофический серотип). Была создана библиотека из 24 возможных ZFN, нацеленных на патогенный вариант. На основе данных in vitro была выбрана лучшая пара мономеров для исследований in vivo. Затем были сконструированы AAV, содержащие две различные кассеты: по одной для каждого мономера, под контролем промотора CMV. AAV вводили мышам внутривенно в дозе 5 x 10¹² векторных геномов (vg)/мышь и затем следили за животными до 65 дней после инъекции. Это привело к специфическому снижению количества мутированных мтДНК в сердце животных по сравнению с фибробластами кожи, взятыми из ушных вырезов до инъекций. Сравнение уровней гетероплазмии в коже и сердце стало возможным благодаря тому, что модель имеет сходные уровни гетероплазмии мутантной мтДНК в этих тканях. У обработанных животных наблюдалось восстановление стабильности митохондриальной тРНКа в сердце, повышение уровня лактата, пирувата и аспартата в тканях. Более высокие дозы 1 x 10¹³ vg/мышь приводили к индукции истощения мтДНК, это означает, что тщательный подбор дозы будет иметь важное значение для клинического перевода. Важно отметить, что не наблюдалось никаких внецелевых эффектов на ядерный геном.

Zekonyte et al.¹⁰⁶ использовали мегануклеазу, направленную на мтДНК, под названием mitoARCUS для борьбы с вариантом m.5042C>T у мышей, используя метод доставки вектора AAV9. Мегануклеаза базируется на гомодимере бактериальной эндонуклеазы, который может быть сконструирован для создания сайт-специфических разрывов dsДНК (рис. 2C). Как и в случае с ZFNs и TALENs, создание сайт-специфических разрывов dsДНК позволяет удалять мутантные молекулы мтДНК и сдвигать гетероплазмию мтДНК в пользу молекул мтДНК WT. Первые исследования in vitro с использованием mitoARCUS в эмбриональных фибробластах мыши, несущих вариант m.5042C>T, показали значительное снижение содержания мутантной мтДНК. Однако общая мтДНК также значительно истощилась и восстановилась до нормального уровня только через 21 день. Далее векторы AAV9, содержащие кодирующую последовательность mitoARCUS, вводили внутривенно ювенильным мутантным мышам в возрасте 2,5 недель и взрослым мутантным мышам в возрасте 6 недель. У ювенильных мышей наблюдалось прогрессирующее снижение содержания мутантной мтДНК в сердце, скелетных мышцах, почках и печени, при этом значительного общего истощения мтДНК в течение 6 месяцев наблюдения не наблюдалось. У взрослых инъецированных мышей более сильная экспрессия кассеты наблюдалась в сердце и печени и почти полное уничтожение мутантной мтДНК в печени, которое сохранялось и в последующем. Элиминация мутантных молекул мтДНК ассоциировалась со значительным улучшением экспрессии мт-тРНКа в печени по сравнению с мышами, которым вводили контрольный AAV9-GFP. Эти данные свидетельствуют о том, что данная методика перспективна и требует дальнейшего развития.

Редактирование генов с помощью CRISPR-Cas9 позволило редактировать гены, кодируемые ядерной системой. Редактирование генов, кодируемых мтДНК, пока невозможно из-за невозможности эффективного импорта компонентов редактирования, в частности направляющей РНК (sgRNA), через обе мембраны митохондрий.^{107, 108}

CRISPR-Cas9 редактирование генов было применено к модели iPSC модели OPA1-доминантной атрофии зрительного нерва.¹⁰⁹ iPSC были получены из фибробластов пациента, содержащих патогенный вариант c.1334G>A; p.Arg445His в OPA1. sgRNA были сконструированы для обеспечения Cas9-опосредованных разрывов dsДНК проксимальнее и дистальнее позиции c.1334, а шаблоны ssDNA, содержащие последовательность WT, были введены путем трансфекции в iPSCs. Исправление варианта было подтверждено секвенированием по методу Сэнгера, и клоны культивировали для оценки функциональных показателей. Это включало восстановление морфологии митохондриальной сети и скорости потребления кислорода клетками, а также восстановление апоптоза, вызванного staurosporine, и числа копий мтДНК до контрольных уровней WT.

Было проведено испытание ^{in vivo} метода редактирования генов CRISPR-Cas9¹¹⁰ для интеграции hTYMP в интрон либо эндогенного гена Tymp в мышиной модели, либо гена, кодирующего альбумин (Alb), тем самым помещая трансген под прямой контроль промоторов эндогенных локусов Tymp и Alb соответственно. Это было достигнуто путем доставки кДНК hTYMP в векторе AAV8 и доставки CRISPR/Cas9 либо в виде мРНК, содержащейся в липидных наночастицах, либо в виде ДНК через другой вектор AAV8. У обработанных мышей наблюдалось длительное восстановление активности TP в крови и снижение уровней Thd и dUrd до нормальных значений, причем наибольшая эффективность наблюдалась при использовании метода доставки мРНК CRISPR/Cas9 в виде липидных наночастиц. Эти данные расширяют возможные методы, с помощью которых AAV и более новые системы доставки могут обеспечить долгосрочную экспрессию трансгенов в печени при митохондриальных заболеваниях.

CRISPR-Cas9 геннотерапия в контексте PMDs все-ещё наранней стадии. Множество работ in vivo нуждаются в использовании существующих хорошо охарактеризованных преклинических моделях для создания терапии PMDs, вызываемых патогенетическими вариантами ядерных генов. Как было установлено ранее, это непригодно для использования к нарушениям, вызываемым точковыми мутациями и крупномасштабными делециями и перестройками mtDNA из-за затруднений с импортом направляющей РНК через митохонриальные мембраны. Редактирование вне мишени также остается рискованным.

Еще одна перспективная технология - цитидиндеаминаза, которая позволяет редактировать основания dsДНК без CRISPR.¹¹¹ DddA - это цитидиндеаминаза, которая превращает цитозин в урацил в dsДНК, что приводит к изменению оснований C>T. В природе она входит в состав секретируемого бактериального токсина, производимого Burkholderia cepacia для индуцирования мутагенеза в соседних бактериях. Доставка интактного белка в клетки HEK293T вызывала токсичность in vitro, но когда DddA расщепляется на две неактивные части, она становится менее токсичной, чем при доставке в клетки в его естественном состоянии. Первые экспериментальные работы in vitro показали, что такая методология экспрессии с расщеплением может вызывать редактирование оснований остатков цитозина, следующих за тимином. Чтобы добиться редактирования митохондриальных генов, половинки DddA были соединены с белками массива TALE, содержащими MTS. Эти редакторы оснований DddA были названы DddA-derived cytosine base editors (DdCBEs). (Рисунок 3). Это позволило осуществить сайт-специфическое редактирование мтДНК нескольких генов in vitro, включая MT-ND1, MT-ND2, MT-ND4, MT-ND5 и MT-ATP8 с эффективностью до 40%.

>

FIGURE 3 (A) The chemistry of cytosine editing. Cytosine deamination generates uracil in DNA which base pairs as thymidine. R = 2'-deoxyribose in DNA. (B) The architecture of DddA-derived cytosine base editors (DdCBEs). The DdCBE architecture comprises a pair of MTS–TALE or, in the case of ZF-DdCBE, MTS–zinc finger arrays linked to one DddAtox (DddA) half. DddA can be split at various positions (e.g., G1333 or G1397). DdCBE also contain a uracil glycosylase inhibitor (UGI) and the MTS from SOD2 and the cytochrome c oxidase subunit 8A (COX8A). (C) The chemistry of adenine editing. Adenosine deamination leads to inosine, which can base pair with guanosine in a DNA polymerase active site. R = 2'-deoxyribose in DNA. (D) The architecture of transcription activator-like effector adenine deaminases (TALEDs). The main TALED architectures comprise a pair (dimeric) or a single MTS–TALE array (monomeric) linked to a catalytically inactive version of DddAtox (DddAFullDead), which is believed to unwind DNA, and the TadA adenosine deaminase.

Дальнейшая разработка технологии DdCBE Silva-Pinheiro et al.¹¹² показала, ч индуцировать варианты de novo в специально предназначенных локусах в mtDNA in vivo в соматических тканях. Это было достигнуто с использованием AAV9.⁴⁵ векторов, кодирующих мономеры DdCBE, чтобы целенаправленно воздействовать на сердце новорожденных и взрослых мышей посредством доставки IV. В завершение, как новорожденные, так и взрослые мыши обнаруживали высокие уровни отредактированных молекул mtDNA в сердечной ткани мышей с более высокой эффективностью у новорожденных инъецированных мышей. Однако, наблюдалось высокое редактирование вне мишени в mtDNA, особенно у новорожденных по сравнению со взрослыми инъецированными мышами, поэтому необходимы дальнейшие усовершенствования этой технологии для улучшения специфичности.

После первоначального подтверждения концепции редактирования мтДНК в мышиных эмбрионах с помощью специально разработанных DdCBEs¹¹³ , Lee et al. использовали DdCBEs для базового редактирования гена mt-Nd5 на одноклеточной эмбриональной стадии и создания трансгенных мышей, несущих вариант m.12918 G>A114 (аналогичный варианту m.13513A>G у человека, который ассоциирован с митохондриальной энцефаломиопатией, молочнокислым ацидозом и инсультоподобными эпизодами [MELAS] и синдромами Leigh). Кроме того, совместное введение mitoTALENs для деградации всех нередактированных молекул мтДНК увеличивало % гетероплазмии для индуцированного патогенного варианта. У мутантных мышей наблюдалась потеря веса, ультраструктурные аномалии митохондрий при электронной микроскопии и гистологические аномалии в мозге, включая вентрикуломегалию и атрофию гиппокампа.

Инъекция DdCBE одноклеточному эмбриону также использовалась Silva-Pinheiro et al.¹¹⁵ для введения нонсенс-варианта m.8069G>A для инактивации гена Mt-Atp6 мыши. Эта работа была частью усилий по созданию библиотеки DdCBEs - MitoKO, оптимизированной для точной абляции каждого белок-кодирующего гена мтДНК в митохондриальном геноме мыши.

Mok et al.¹¹⁶ усовершенствовали дизайн DdCBEs, чтобы расширить контекст последовательности для редактирования оснований, а также повысить эффективность редактирования. Эти новые варианты DdCBE были способны редактировать остатки C, следующие за любым нуклеотидом, а не только за T. Группа продемонстрировала, что новые DdCBE могут быть использованы в мутагенезе для создания вариантов мтДНК в клетках человека в гене MT-ND4, которые ассоциированы с LHON например m.11696G>A, который находится в контексте последовательности AC.

Дальнейшая работа с DdCBEs привела к созданию DdCBEs с цинковыми пальчиками (ZF-DdCBEs)117 и последующему улучшению их эффективности редактирования за счет инженерии их архитектуры, определения улучшенных ZF-каркасов и приобретения мутаций, повышающих активность DddA¹¹⁸. Используя небольшой размер ZF-DdCBEs, Willis et al.¹¹⁸ использовали один вектор AAV9 (вместо двух векторов, необходимых для доставки DdCBEs на основе TALE) для внедрения патогенных вариантов путем редактирования оснований в сердце, печени и скелетных мышцах постнатальных мышей.

Cho et al.¹¹⁹ расширили подход еще больше, разработав (TALE)-связанные деаминазы, которые связываются с аденин-деаминазой, а не с цитидин-деаминазой (рис. 3). Аденин-деаминазы преобразуют остатки аденина в инозин, который соединяется с цитозином, обеспечивая преобразования A-to-G в мтДНК в клетках человека. Таким образом, это позволило бы осуществлять мутагенез гораздо большего числа известных патогенных вариантов мтДНК, для которых изменения оснований A>G часто наблюдаются у пациентов.

DdCBE еще не использовались для исправления патогенных вариантов мтДНК ни in vitro, ни in vivo. Например, активность цитидиндезаминазы, обеспечивающая C>T-переходы на антисмысловой нити, могла бы обеспечить G>A-переходы на смысловой нити, что было бы терапевтически эффективно для исправления патогенных A>G-вариантов. Однако, как обсуждалось выше, усовершенствование этой технологии с целью повышения специфичности, обеспечения возможности доставки in vivo и нацеливания на органы, а также использования различных нуклеотидных деаминаз расширило терапевтический потенциал этой технологии. Остается выяснить, будет ли этого достаточно для спасения большинства мутантных молекул мтДНК в клетках нужных тканей, чтобы добиться длительной эффективности. Кроме того, теоретически возможно вне-целевое редактирование оснований в мтДНК или ядерной ДНК, что необходимо изучить в ходе будущих доклинических исследований.

Некоторые из проблем, которые необходимо учитывать при клиническом применении генотерапии, включают достижение адекватной трансдукции органов, безопасное дозирование, дизайн клинических испытаний, определение показателей результатов и набор участников испытаний.

PMDs часто вызывают мультисистемное поражение. С точки зрения генотерапии, это создает необходимость одновременного воздействия на несколько различных органов/тканей. Висцеральные органы могут быть направлены на внутривенное введение, но вовлечение ЦНС является важным моментом, поскольку многие PMDs затрагивают мозг.

Достижения в подходах к восстановлению генов AAV позволили разработать серотипы, которые улучшили трансдукцию в ЦНС при внутривенном введении. Ранние исследования Foust et al. с использованием scAAV показали, что с помощью внутривенного введения AAV9 можно воздействовать на мозг новорожденных мышей.⁴⁶ Иммуногистохимические результаты этого исследования продемонстрировали высокую экспрессию GFP в мозге после внутривенного введения генов новорожденным и взрослым. Однако Gray et al.¹²⁰ показали, что перенос генов взрослым животным с помощью внутривенного введения scAAV у NHP привел к низкой трансдукции в мозге по сравнению с мышами при аналогичных дозах/кг, что означает, что дальнейший клинический перевод с использованием данного типа конструкции и способа воздействия на мозг, вероятно, будет проблематичным. Устранение фенотипа заболевания у мышей с дефицитом SMN¹²¹ обеспечило уверенность в использовании внутривенной генотерапии AAV9 для воздействия на спинной мозг, что привело к успешным клиническим испытаниям при SMA 1 типа.¹²² Однако доклинические исследования^{46, 121} также показали, что нацеливание на головной мозг уступает нацеливанию на спинной мозг с помощью внутривенного введения. Как уже говорилось ранее, генотерапия на основе AAV применялась и в других мышиных моделях PMDs. Неонатальные внутривенные инъекции AAV9 не смогли устранить неврологический фенотип модели синдрома Leigh с дефицитом NDUFS4.⁴⁵ Таким образом, эти исследования не подтверждают пригодность использования внутривенных инъекций AAV9 для воздействия на мозг. Необходимо рассмотреть альтернативные подходы.

Недавно с помощью библиотек капсидов были получены новые синтетические рекомбинантные серотипы AAV путем отбора векторов с улучшенной трансдукцией в ЦНС. AAV PHP.B показал более высокую трансдукцию в мозг по сравнению с AAV9 при внутривенном введении мышам C57/BL6.123 Он также устранил аномалии мозга у мышей с дефицитом NDUFS4.¹²⁴ Однако результаты биораспределения не были воспроизведены в других штаммах мышей и NHP, что означает, что клиническое применение этого подхода маловероятно.^{125, 126} Другой новый серотип, AAV-F, продемонстрировал лучшую нацеленность на мозг после переноса генов взрослым IV мышам по сравнению с AAV9.⁴³ Это включало усиленную трансдукцию нейронов и астроцитов. Пока что эти результаты не подтверждены у NHPs, хотя данные недавнего исследования, в котором сравнивались AAV9 и AAV-F при интратекальной доставке при NHPs, не выявили существенных различий в биораспределении в мозге между двумя серотипами.¹²⁷

Недавно были описаны два новых перспективных серотипа AAV, AAV.CAP-B10 и AAV.CAP-B22.128 AAV.CAP-B10 продемонстрировал усиленную трансдукцию мозга (в частности, нейронов) после внутривенного переноса генов у 3-недельных мышей. IV исследования на NHP (мармозетках) показали, что и AAV.CAP-B10, и AAV.CAP-B22 имели более высокую экспрессию трансгенов в мозге, чем AAV9, в коре, стриатуме и стволе мозга среди других областей. Кроме того, AAV.CAP-B22 преимущественно трансдуцировал астроциты. Эти новые серотипы AAV дают надежду на то, что можно добиться достаточной трансдукции мозга после внутривенного введения вектора.

На сегодняшний день FDA не лицензировало ни одного препарата для внутривенной генотерапии in vivo, нацеленного на мозг, несмотря на многочисленные клинические исследования этого подхода.¹²⁹ В большинстве клинических исследований вместо этого используется внутричерепной путь.¹³⁰ Преимущества этого подхода заключаются в том, что он обходит гематоэнцефалический барьер, обеспечивая лучшую трансдукцию. Мозг является иммунопривилегированным местом, что означает меньшую вероятность вызвать иммунный ответ или повлиять на трансдукцию нейтрализующими анти-ААВ антителами.¹³¹

Возможные пути внутричерепного введения - интратекальный (интрацистернальный, поясничный интратекальный), интрацеребровентрикулярный и интрапаренхимальный. Интратекальная доставка предполагает введение в спинномозговую жидкость либо на уровне cisterna magna, либо поясничную интратекальную доставку. Было показано, что интратекальный способ обеспечивает достаточно хорошее биораспределение в мозге и эффективен для улучшения неврологических заболеваний у собак с болезнью Sanfilippo.^{132, 133} Основным недостатком является высокий риск повреждения продолговатого мозга у людей.¹³⁴ Интратекальное введение AAV9 в поясничную область позволило устранить митохондриальную дисфункцию мозга при дефиците SURF1 у мышей, однако исследования биораспределения у NHP дали противоречивые результаты,^{50, 132, 135} поэтому неясно, может ли этот подход быть использован у людей.

Интрацеребровентрикулярный путь является инвазивным, поскольку требует доступа к желудочковой системе. Интрацеребровентрикулярные инъекции AAV9 показали отличное биораспределение по всему мозгу,¹³³ включая трансдукцию как нейронов, так и глии.^{132, 136} Этот подход улучшил неврологический фенотип в крупных животных моделях болезни Sly¹³² и болезни Batten CLN5,¹³⁷ что делает его жизнеспособным вариантом для трансдукции мозга.

Интрапаренхимальный способ предполагает прямые инъекции в мозг, что обеспечивает локальную доставку и снижает нейротоксичность вне мишени.¹³⁸ Клинические испытания интрапаренхимальной генной терапии в мозге проводятся для лечения дефицита AADC и болезни Sanfilippo, а также продемонстрировали эффективность при болезни Batten.^{130, 139} Трудность с PMDs когда поражены несколько областей мозга, заключается в том, что, вероятно, потребуется большое количество инъекций, что снижает осуществимость этого подхода.

Недостатками внутричерепных путей являются необходимость нейрохирургического вмешательства, что может повлечь за собой около-операционные осложнения, а также возможность местных иммунных реакций.¹⁴⁰ Кроме того, для многих PMDs при которых также присутствует висцеральное поражение, вероятно, потребуется внутривенная доставка для воздействия на эти органы.

Необходимы дальнейшие доклинические исследования с использованием новых серотипов векторов и/или комбинированных способов доставки для совершенствования существующих подходов к генной терапии при PMDs.

Из недавних клинических испытаний AAV многое стало известно о дозировке, токсичности и иммуногенности AAV. Токсичность высоких доз AAV у людей вызвала обеспокоенность в последние несколько лет.¹⁴¹ Высокодозная генотерапия IV AAV9 была связана с тяжелой печеночной недостаточностью у двух пациентов со спинальной мышечной атрофией 1 типа при дозах 1,1 х 10¹⁴ vg/кг,¹⁴² а также с тромботической микроангиопатией (тромбоцитопения, анемия, активация комплемента) и острым нарушением функции почек у двух пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна при дозах =5 [ 10¹³ vg/кг.143 Высокая доза AAV8 в дозе =1 [ 10¹⁴ vg/кг, введенная пациентам с Х-сцепленной миотубулярной миопатией, была связана с желудочно-кишечной инфекцией, печеночной недостаточностью, сепсисом, повышением сердечного тропонина и смертью в двух случаях, хотя эти токсические эффекты не наблюдались после введения сравнимых доз у мышей и c NHP.¹⁴⁴ Увеличение дозы, необходимое для перехода между доклиническими и клиническими исследованиями, не является простым и требует исследовательского повышения дозы для определения минимальной эффективной дозы.

Предшествующий гуморальный и опосредованный Т-клетками иммунитет является общепризнанной проблемой, поскольку большой процент здорового населения демонстрирует серопозитивность к естественным ААВ и ответы Т-клеток памяти в несколько меньшей степени.^{145, 146} Испытания обычно исключают пациентов с выявляемыми антителами как часть критериев отбора¹⁴⁷ , поскольку это связано с потерей трансдукции. Это уменьшит число пациентов, которые потенциально могут получить пользу от лечения.

Клинические испытания новых методов лечения редких заболеваний часто не контролируются плацебо и не проводятся вслепую, поэтому использование данных когорты пациентов с естественной историей болезни может оказаться полезным.¹⁴⁸ Участники испытаний также могут выступать в качестве собственного "контроля",¹⁴⁹ особенно если до переноса генов у них уже были симптомы. Выявление существующих пациентов с помощью реестров пациентов с митохондриальными заболеваниями, например, когорты пациентов с митохондриальными заболеваниями Великобритании¹⁵⁰ или ее международных аналогов, вероятно, будет полезным. Введение вектора генотерапии здоровым добровольцам для оценки безопасности (исследование фазы I) не предполагается.¹⁵¹ Вместо этого часто проводится совместное исследование безопасности и эффективности на небольшом количестве пациентов, что позволяет достичь целей фазы I и II.

Показатели исхода можно определить как "элементы, измеряющие изменения в состоянии здоровья или качестве жизни".¹⁵² Необходимо рассмотреть, какие биохимические, молекулярные и клинические показатели исхода могут быть использованы при разработке клинических испытаний в зависимости от фенотипа заболевания. Например, на одном международном семинаре по методу Дельфи, направленном на определение готовности к клиническим испытаниям первичных митохондриальных миопатий, клинические эксперты по PMDs согласились с необходимостью использования стандартизированных, валидированных и воспроизводимых показателей результатов в клинических испытаниях, набирающих взрослых и детей с митохондриальными миопатиями.¹⁵³ Это включало достижение консенсуса относительно того, какие клинические шкалы, функциональные тесты, показатели результатов деятельности, показатели результатов по отзывам пациентов, включая показатели качества жизни, и биомаркеры должны использоваться в будущих испытаниях.

Необходимы биомаркеры крови, достоверно отражающие тяжесть заболевания, тем более что молекулярные и биохимические анализы тканей, которые используются во многих доклинических исследованиях генотерапии для демонстрации эффективности, вряд ли могут быть использованы в условиях клинических испытаний из-за инвазивности биопсий. В последние годы изучалась возможность использования FGF21 и GDF15154 , однако ни один из них не является специфичным для PMDs и уж тем более не относится к какому-либо конкретному генетическому дефекту. Необходимо провести дополнительные исследования биомаркеров, и в этом может помочь использование доклинических моделей животных и мультиомических подходов.¹²

В клинических испытаниях генотерапии при LHON например, в качестве показателей результатов использовались острота зрения с лучшей коррекцией и оптическая когерентная томография. Неврологический осмотр и результаты развития можно отслеживать с помощью валидированных шкал, таких как Ньюкаслская шкала педиатрических митохондриальных заболеваний.¹⁵⁵ Хотя некоторые из этих систем оценки были разработаны не для митохондриальных расстройств, они все же могут точно отражать неврологические особенности, но в идеале должны быть валидированы для данной когорты пациентов. В клиническом исследовании idebenone при MELAS в качестве показателей исхода использовался балл по Шкале тяжести усталости, а также венозный и церебральный лактат (по данным МР-спектроскопии) (NCT00887562). Наконец, можно было бы использовать данные естественной истории болезни ввиду вероятного отсутствия контрольной группы в будущих испытаниях, но это, вероятно, будет полезно только при условии проспективного сбора данных у пациентов, сопоставимых по возрасту и тяжести заболевания.¹⁴⁸

Для проведения клинического испытания генотерапии необходимо выявить подходящих пациентов. Многие PMDs проявляются классическими клиническими фенотипами, для которых дифференциальный диагноз может включать несколько различных генетических причин, лежащих в основе заболевания. Фенотипы могут перекрываться с не митохондриальными заболеваниями, что делает генетический диагноз необходимым для определения пригодности к генотерапии. В последние годы это стало возможным благодаря секвенированию следующего поколения, которое является предпочтительным методом диагностики.

PMDs встречаются крайне редко, поэтому количество пациентов, которых можно привлечь к участию в клинических испытаниях генной терапии, будет невелико. Поэтому для набора пациентов потребуется международное сотрудничество, чтобы набрать как можно больше пациентов через международные реестры пациентов. Необходимо будет согласовать критерии включения в исследование. В будущем, если геномный скрининг новорожденных станет доступным, это может привести к раннему выявлению большего числа людей, которым может помочь генная терапия.

В будущем, несмотря на то что различные продукты генотерапии будут иметь общие элементы конструкции, наличие различных терапевтических трансгенов или элементов последовательности потребует отдельных региональных разрешений регулирующих органов для каждого продукта генотерапии. Это связано с тем, что каждый из них потенциально может иметь различный токсикологический профиль, а достоинства различных пакетов данных о доклинической эффективности необходимо будет оценивать индивидуально. Это, вероятно, приведет к задержкам в утверждении, но является важным этапом регуляции. К другим проблемам клинического перевода относится необходимость привлечения адекватных инвестиций со стороны фармацевтических компаний. Для некоторых редких заболеваний это является реальной проблемой, особенно если учесть, что пациентов, которым может помочь терапия, может быть немного из-за низкой распространенности заболевания и высокой смертности в раннем детском возрасте, характерной для многих PMDs. Также вызывает озабоченность доступность лицензированных препаратов генотерапии для бюджетов глобального здравоохранения и справедливый доступ к терапии для тех, кто в ней нуждается, особенно в странах с большим социально-экономическим неравенством.

Достижения в области разработки генотерапии привели к бурному развитию доклинических подходов к восстановлению генов на основе AAV в доклинических моделях PMDs. Это также стало возможным благодаря созданию более широкого спектра моделей заболеваний, особенно мышиных моделей, которые способны повторять фенотипы заболеваний человека. Тем не менее, трансляционное узкое место очевидно, поскольку только одна из этих генных терапий вошла в клинические испытания, а именно генотерапия AAV2 для лечения LHON Проблемы, связанные с токсичностью вектора AAV при высоких дозах внутривенного введения, препятствовали клиническим испытаниям других метаболических и неврологических расстройств и указывали на необходимость соблюдать осторожность. Поскольку многие PMDs затрагивают ЦНС, необходимо рассмотреть возможность воздействия на ЦНС с помощью других способов доставки. Введение AAV внутричерепным путем создает дополнительные сложности, поскольку эти процедуры сопряжены со значительным риском для человека. Подходы к редактированию генов в настоящее время находятся на очень ранних стадиях разработки. Редактирование генов на основе CRISPR-Cas9 и новые редакторы оснований без РНК пока имеют ограниченное терапевтическое применение, и необходимо также учитывать возможность внецелевого редактирования оснований. Нуклеазы, вносящие разрывы dsДНК в мтДНК, также находятся на ранних стадиях разработки. При переводе на клиническую основу необходимо будет решить вопросы безопасности индукции истощения мтДНК, даже если она временная, вопросы внецелевой активности нуклеаз и того, будут ли терапевтические сдвиги в гетероплазмии мтДНК устойчивыми в долгосрочной перспективе.

В будущем, учитывая редкость большинства PMDs любые предстоящие клинические испытания потребуют многонационального сотрудничества. Необходимо будет продумать набор участников, сроки переноса генов и выбор релевантных и доступных показателей результатов, чему будет способствовать глубокое понимание естественной истории болезни и перспективная характеристика соответствующих когорт пациентов. Уточнение трансляционных линий принесет пользу научному сообществу и вдохновит на проведение исследований генной терапии при других PMDs для которых очень нужны эффективные методы лечения, модифицирующие болезнь.