Пользователи:
МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ



Генотерапия

Gene therapy for mitochondrial disorders
Nandaki Keshavan, Michal Minczuk, Carlo Viscomi, Shamima Rahman
Journal of Inherited Metabolic DiseaseVolume 47, Issue 1 p. 145-175

In this review, we detail the current state of application of gene therapy to primary mitochondrial disorders (PMDs). Recombinant adeno-associated virus-based (rAAV) gene replacement approaches for nuclear gene disorders have been undertaken successfully in more than ten preclinical mouse models of PMDs which has been made possible by the development of novel rAAV technologies that achieve more efficient organ targeting. So far, however, the greatest progress has been made for Leber Hereditary Optic Neuropathy, for which phase 3 clinical trials of lenadogene nolparvovec demonstrated efficacy and good tolerability. Other methods of treating mitochondrial DNA (mtDNA) disorders have also had traction, including refinements to nucleases that degrade mtDNA molecules with pathogenic variants, including transcription activator-like effector nucleases, zinc-finger nucleases, and meganucleases (mitoARCUS). rAAV-based approaches have been used successfully to deliver these nucleases in vivo in mice. Exciting developments in CRISPR-Cas9 gene editing technology have achieved in vivo gene editing in mouse models of PMDs due to nuclear gene defects and new CRISPR-free gene editing approaches have shown great potential for therapeutic application in mtDNA disorders. We conclude the review by discussing the challenges of translating gene therapy in patients both from the point of view of achieving adequate organ transduction as well as clinical trial design.
1.1 Mitochondrial function and dysfunction


Митохондрии являются основным местом производства АТФ посредством процесса окислительного фосфорилирования (OXPHOS).1 Система OXPHOS состоит из пяти субъединичных белковых комплексов (комплексы I-V), расположенных во внутренней митохондриальной мембране.2 Однако роль митохондрий выходит за рамки простого производства энергии, поскольку они являются местом многих других метаболических и сигнальных путей. К ним относятся метаболизм углерода,3 биогенез железо-серных кластеров,4 производство реактивных форм кислорода, которые необходимы для многих биологических процессов, включая антиоксидантную защиту5 и активацию апоптоза.6 Промежуточные продукты, образующиеся в митохондриях, также необходимы для биосинтеза пуринов и пиримидинов.7 Считается, что около 1500 белков имеют митохондриальную локализацию и функцию.8, 9 Большинство из них кодируются ядерным геномом, поскольку митохондриальная ДНК (мтДНК), расположенная внутри митохондрий, представляет собой циркулярную молекулу размером ~16,5 Кб, содержащую всего 37 генов, кодирующих 13 полипептидов, 22 тРНК и 2 рРНК.10 За исключением комплекса II, который полностью кодируется ядерной ДНК,11 комплексы OXPHOS зависят от мтДНК, которая кодирует субъединицы, расположенные в комплексах I, III, IV и V.10
1.2 Primary mitochondrial disorders


Первичные митохондриальные нарушения (PMDs) - это моногенные заболевания, возникающие в результате унаследованных или de novo патогенных вариантов генов, которые приводят к нарушениям OXPHOS, структуры или функции митохондрий.12 По отдельности они встречаются редко, но в совокупности - часто, их частота составляет 1: 4300.13 Генетика митохондриальных заболеваний сложна, поскольку они могут быть результатом патогенных вариантов как в мтДНК, так и в ядерных генах. В то время как наследование вариантов ядерных генов может быть аутосомно-доминантным,14 рецессивным или Х-сцепленным,15, 16 мтДНК наследуется исключительно по материнской линии.17 Кроме того, каждая клетка содержит несколько сотен копий молекулы мтДНК, что приводит к появлению понятий «гетероплазмия мтДНК» (наличие как нормальной, так и мутировавшей мтДНК в одной клетке), «пороги гетероплазмии» (процент гетероплазмии патогенного варианта, необходимый для возникновения митохондриальной дисфункции) и «гомоплазмия» (наличие однородной популяции мтДНК в клетке). В настоящее время считается, что существует ~400 генов ядерной и мтДНК, связанных с PMDs и с появлением секвенирования нового поколения это число продолжает расти.18 Такая генетическая гетерогенность создает значительные проблемы не только для диагностики, но и для разработки методов лечения.
В настоящее время для большинства PMDs не существует одобренных методов лечения, изменяющих течение болезни. Некоторые заболевания положительно реагируют на специфические витамины или кофакторы, включая дефицит SLC19A3, который реагирует на добавки биотина и тиамина,19 дефициты ACAD9, FLAD1 и транспортера рибофлавина, которые реагируют на рибофлавин20, 21 и дефициты COQ2, COQ6 и COQ8B, которые реагируют на добавки коэнзима CoQ10 (CoQ10) в высоких дозах.22 Кроме того, несколько экспериментальных низкомолекулярных препаратов проходят испытания на пациентах с PMDs хотя ни один из них не направлен на устранение основной генетической причины. Из них только idebenone, окислительно-восстановительный модулятор и аналог CoQ10, был одобрен в Европе для лечения наследственной зрительной нейропатии Лебера (LHON)23 , а omaveloxolone (Skyclarys), который действует через комбинацию активации Nrf2 и ингибирования NF-κB, недавно получил одобрение FDA для лечения атаксии Фридрейха.
1.3 Genetic therapies


Генотерапия может быть определена как лечение, которое исправляет основную генетическую аномалию в пораженных клетках или у людей с моногенным расстройством. Тип генотерапии, применимой к PMDs зависит от того, где находится генетический дефект - в ядерной ДНК или в мтДНК.
При дефектах ядерных генов традиционные методы «замены генов» предусматривают доставку «правильной» (дикого типа [WT]) копии мутировавшего гена (интересующего гена/трансгена) в ядро клеток-мишеней. Затем ген WT восстанавливает нормальную функцию белка. Этот подход применим к рецессивным заболеваниям, поскольку эффект патогенных вариантов с усиленной функцией не будет отменен экспрессией WT-копии гена. Другой тип генотерапии - терапия на основе РНК. Вместо трансгена в виде ДНК может быть предоставлена РНК-версия той же терапевтической последовательности. РНК-терапия может функционировать так же, как и восстановление генов, или может быть сконструирована таким образом, чтобы «отключать» или «выключать» экспрессию других генов, например, с помощью малых интерферирующих РНК (siRNAs) или увеличивать экспрессию с помощью малых активирующих РНК. Третья форма генотерапии - редактирование генов, которое направлено на исправление патогенных вариантов существующих генов в клетках без введения новых полноразмерных копий целевого гена. Сюда входит редактирование генов с помощью CRISPR-Cas9 для разрезания и рекомбинации ДНК и редактирования оснований.
Для лечения PMDs вызванных патогенными вариантами мтДНК, также могут применяться подходы к восстановлению генов, при этом трансген экспрессируется в ядре, транслируется цитозольными рибосомами, а белковый продукт модифицируется, чтобы содержать митохондриальную таргетную последовательность (MTS) для обеспечения импорта в митохондрии; этот подход известен как «аллотопическая экспрессия». Однако следует отметить, что импорт в митохондрии и правильная сборка в комплексы OXPHOS аллотопически экспрессированных мтДНК-кодированных белков требует дальнейшего экспериментального подтверждения. Другой метод - использование сконструированных ферментов, таких как нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALEN), и мегануклеазы, для специфического распознавания и введения двуцепочечных (ds) разрывов в ДНК, содержащей патогенные варианты. Хотя индукция разрывов dsDNA в сочетании с гомологичной рекомбинацией (HR) правильной копии гена в принципе может быть применена к ядерной ДНК в контексте лечения PMDs до сих пор этот подход использовался только для нацеливания и разрушения молекул мтДНК, содержащих патогенные варианты, что приводит к сдвигу гетероплазмии в сторону WT-молекул. Однако этот метод не может быть применен к гомоплазматическим вариантам, поскольку это приведет к истощению мтДНК. В то время как редактирование генов CRISPR-Cas9 еще не было адаптировано к вариантам мтДНК, связанным с PMDs из-за неэффективного импорта РНК в митохондрии человека, новые технологии редактирования оснований без CRISPR позволяют редактировать отдельные основания мтДНК без необходимости импорта направляющих РНК через мембраны митохондрий.
Существуют два различных метода доставки генов. Она может осуществляться in vivo, когда гены вводятся непосредственно больному человеку, или ex vivo, когда соответствующие клетки, например гемопоэтические стволовые клетки, удаляются у пациента, подвергаются генотерапии и затем вводятся обратно человеку.24 Для переноса генов in vivo могут использоваться различные пути введения в зависимости от того, на какой орган направлено воздействие. Например, для периферических органов, таких как печень, предпочтительно использовать внутривенный (IV) путь, для заболеваний глаз и ушей - внутриглазной или внутрикохлеарный пути, соответственно, а для воздействия на определенные области центральной нервной системы (ЦНС) - внутривенный, внутричерепной или интратекальный пути.25 Таким образом, выбор способа доставки зависит от характера заболевания, подлежащего лечению, в том числе от того, какие органы должны быть объектом воздействия.
Обоснование применения генотерапии при PMDs обусловлено тем, что эти заболевания обычно являются клеточно-автономными, поэтому отсутствующий продукт гена не является секретируемым белком/ферментом, а болезнь не связана с накоплением вредного субстрата. Замена недостающего белка в циркуляции вряд ли приведет к коррекции заболевания в тканях, поэтому эти расстройства вряд ли поддадутся заместительной ферментной терапии или трансплантации костного мозга. Исключением является митохондриальная нейрогастроинтестинальная энцефаломиопатия (MNGIE), вызванная биаллельными патогенными вариантами TYMP, где болезнь частично обусловлена вредным накоплением тимидина (Thd), которое может быть устранено путем замены недостающего фермента тимидинфосфорилазы (TP) с помощью аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток26. Кроме того, при некоторых PMDs например, дефиците DGUOK,27 дефиците TYMP,28 и дефиците ETHE1,29 трансплантация печени имеет определенный успех, но не исправляет болезнь в мозге.30 Генотерапия имеет возможность воздействовать одновременно на несколько органов, включая ЦНС, что делает ее привлекательной, поскольку PMDs обычно затрагивают несколько различных систем органов. 2 МЕТОДЫ...
3 GENE THERAPY APPROACHES


3.1 Non-viral strategies


Невирусные подходы включают физические методы бомбардировки клеточных мембран (гидродинамическая инъекция ДНК, биолистические методы),31, 32 химические методы (мицеллы катионных surfactants, наночастицы родамина, липосомы)32-34 и использование эндогенного механизма импорта через MTS-опосредованное проникновение посредством транслокаторов комплексов внешней и внутренней мембран в митохондрии.35 Многие из невирусных методов находятся на предварительных стадиях in vitro и ограничены низкой эффективностью трансфекции, слабой специфичностью для митохондрий или неудачей из-за цитотоксичности.36 Поэтому ни одна из этих стратегий не продвинулась дальше в трансляционной линии для PMDs.
3.2 AAV strategies for mitochondrial disorders due to nuclear gene defects


Вирусные векторы более эффективны при трансдукции клеток, чем не-вирусные методы. Вирусные векторы сконструированы таким образом, что сохраняют основу естественного вируса, заменяя эндогенный вирусный геном на интересующий ген, но сохраняя способность вируса эффективно инфицировать клетки. Наиболее перспективными векторами генотерапии в настоящее время являются рекомбинантные адено-ассоциированные вирусы (rAAV). Естественно встречающиеся AAV принадлежат к семейству парвовирусов и обычно не вызывают заболеваний у людей. Они требуют совместной инфекции с другим компетентным к репликации вирусом, таким как аденовирус37 , без которой они переходят в состояние латентности, либо интегрируя свои геномы в определенный участок хромосомы 1938, либо оставаясь эписомальными в ядре.39 Жизненный цикл естественно возникающих AAV показан на рисунке 1A. Естественные AAV встречаются в ~12 различных серотипах, каждый из которых отражает уникальный паттерн тканевого тропизма (нацеливания).40, 41 Сравнение IV биораспределения AAV1-9 у взрослых мышей показало перекрывающийся тканевый тропизм различных серотипов.40 Существует также несколько новых инженерных серотипов AAV с превосходной способностью трансдуцировать определенные ткани.42, 43 Тканевой тропизм rAAVs показан на рисунке 1B.



FIGURE 1 (A) Life cycle of AAVs. AAVs transduce cells by binding glycosylated cell surface receptors which enable them to be endocytosed. There they fuse with endosomes whose low pH or proteases are thought to activate specific viral proteins which enable breach of the endosomal membrane, endosomal rupture and virion escape into the cytosol as nuclear pore entry. Viral uncoating then occurs. Naturally occurring AAVs contain single stranded (ss) genomes which first require second strand synthesis to yield a closed dsDNA molecule followed by integration into the host genome. Replication only occurs in the presence of co-infection with a helper virus and recruitment of various host cell replication factors (not shown). Viral genomes may also exist extra-chromosomally as circular monomers/dimers/concatemers. Self-complementary (sc) AAVs are a type of ss rAAV which possess a palindromic structure that enables the genome to form a dsDNA structure without requiring second strand synthesis. B: Recombinant AAV (rAAV) genome structure, serotypes and tissue tropism. In AAV vector production, the gene of interest is contained in a plasmid with intact AAV2-derived inverted tandem repeat (ITR) sequences flanking on either side. In two-plasmid AAV vector production systems, a packaging plasmid containing the Rep and Cap genes is used to generate rAAVs. Differences in the Cap genes used results in production of classical serotypes (e.g., AAV2/1-9), which have different capsids resulting in an ability to transduce different target tissues. Novel caspids have been developed in a similar manner.
rAAV разработаны с целью доставки терапевтического трансгена в экспрессионной кассете вместо оригинального генома AAV и поэтому лишены способности реплицироваться в организме хозяина. rAAV имеют емкость упаковки, ограниченную примерно 4,7 Кб. Последовательности промотора/энхансера, расположенные перед трансгеном, выбирают факторы транскрипции хозяина в ядрах трансдуцированных клеток, определяя тем самым транскрипционную активность в клетках-мишенях. Таким образом, экспрессия трансгена определяется несколькими переменными, включая вид/штамм субъекта,44 способ доставки,45 возраст на момент доставки,46 серотип AAV, промотор47 и дозу. Самокомплементарные AAV (scAAV) обеспечивают более быструю экспрессию трансгена, поскольку кассета содержит трансген и его комплемент в cis-положении, что исключает необходимость синтеза второй нити.48
Генная терапия на основе AAV была использована для лечения мышиных моделей PMDs вызванных патогенными вариантами ядерных генов. К ним относятся дефицит NDUFS3,49 дефицит NDUFS4,45 дефицит SURF1,50 дефицит TYMP,51 дефицит TK2,52 дефицит MPV17,53 OPA1-доминантная атрофия зрительного нерва,54 дефицит AIFM1,55 дефицит ANT1,56 этилмалоновая энцефалопатия,57 дефицит SLC25A46,58 и синдром Барта,59 как показано в таблице 1.



ТАБЛИЦА 1. Обзор исследований генотерапии митохондриальных заболеваний, вызванных дефектами ядерных генов...
Основным преимуществом подхода к восстановлению генов на основе AAV является то, что векторы AAV могут трансдуцировать как делящиеся, так и не-делящиеся клетки, и многие из них способны трансдуцировать широкий спектр различных органов. AAV8 и AAV9 были наиболее часто используемыми серотипами векторов в доклинических исследованиях генотерапии PMDs из-за их относительно широкого тканевого тропизма. IV AAV8 использовался для воздействия на печень при этилмалоновой энцефалопатии,57 MPV17,53 и дефиците TYMP в MNGIE.70 IV AAV9 использовался для воздействия на скелетные мышцы при дефиците NDUFS349 и сердце при синдроме Барта.59 При заболеваниях, для которых необходимо воздействовать на один орган, индивидуальная настройка маршрута или используемого промотора может помочь ограничить экспрессию интересующим органом. Например, при дефиците AIFM155 и атрофии зрительного нерва с дефицитом OPA154 адекватная трансдукция в глаз была достигнута с помощью локализованного способа доставки (интравитреально) для ограничения экспрессии повсеместно экспрессируемого промотора (цитомегаловирус [CMV]). При синдроме Барта использование AAV с кассетами трансгенов, содержащими кардиоспецифические промоторы, позволило добиться специфической экспрессии в сердце.59
Однако до сих пор эти подходы к восстановлению генов не прошли клинические испытания. Возможные объяснения медленного внедрения в клиническую практику следующие. Одним из важных ограничений является то, что фенотипы животных моделей часто отличаются от соответствующих фенотипов заболеваний человека, что ограничивает выводы, которые можно сделать относительно терапевтической эффективности. В качестве примера можно привести модель дефицита MPV17, при которой у мышей не развился цирроз печени или церебральная дисфункция по сравнению с человеческим фенотипом, а также модель мышей с дефицитом SURF1, в которой не наблюдалось снижения выживаемости.50, 71 При дефиците TK2,52 в модели наблюдалась энцефаломиопатия и заболевания спинного мозга, которые не встречаются у пациентов и могут объяснить, почему удалось достичь лишь частичного улучшения фенотипа заболевания. Таким образом, выводы об эффективности сложно сделать при более легком поражении органов, поскольку невозможно предсказать, как лечение будет действовать у человека, а при более тяжелом или грубо отличающемся поражении (например, при поражении органов, не наблюдаемых у человека) это может привести к невозможности выявить терапевтический эффект.
Второе ограничение заключается в том, что может быть трудно добиться устойчивой экспрессии трансгена в нужных тканях/органах. Для модели синдрома Leigh45 с дефицитом NDUFS4 потребовался инвазивный внутричерепной подход для достижения адекватной трансдукции в мозг. Это создает дополнительное препятствие для трансдукции из-за способа доставки. При дефиците SURF150 вместо этого был использован интратекальный способ, хотя возможность использования этого способа для воздействия на мозг у людей с синдромом Leigh еще предстоит продемонстрировать. При дефиците TYMP69 наблюдалось разбавление вектора в печени из-за потери трансдукции при делении печени, несмотря на перенос генов взрослым. Это можно было в достаточной степени преодолеть только путем использования более высокой дозы вектора, что создает другие проблемы, поскольку может привести к токсическим эффектам. Аналогичные соображения применимы к генотерапии, нацеленной на печень, при этилмалоновой энцефалопатии.57 Мультисистемная трансдукция также необходима при большинстве митохондриальных заболеваний, и это оказалось проблематичным в ряде доклинических исследований. При дефиците AIFM155 были устранены только глазные проявления, без попыток лечения неврологических и скелетных мышечных проявлений. При дефиците SLC25A4658 адекватно воздействовали на мозг и периферические нервы, но для этого использовали IV AAV PHP.B, который не может быть применен в клинических условиях, поскольку AAV PHP.B не трансдуцирует нервную систему человека так, как это происходит у мышей.
Третьим ограничением подходов к замене генов является тот факт, что для каждого отдельного заболевания потребуется свой продукт генотерапии, что делает невозможным применение данной стратегии для лечения более 350 митохондриальных заболеваний. Во всех подходах на основе AAV, кроме одного, в качестве трансгена использовалась либо мышиная, либо человеческая кДНК нокаутированного гена. Исключением является доставка вектора, содержащего ген нейроглобина, мышам с дефицитом AIFM1, которая показала терапевтический эффект.62 Нейроглобин - это в митохондриях локализующий белок, экспрессируемый в ЦНС, который, как считается, оказывает нейропротекторное действие, сохраняя функцию митохондрий. Нокдаун нейроглобина вызывает дисфункцию комплексов I и III в сетчатке крыс.72 Сверхэкспрессия нейроглобина у нокаутных мышей Aifm1 привела к улучшению электрофизиологических показателей, уменьшению глиоза и улучшению связи ганглиозных клеток сетчатки (табл. 1). Еще предстоит выяснить, может ли избыточная экспрессия нейроглобина быть полезной при других неврологических заболеваниях. Так как основным недостатком генных терапевтических конвейеров является то, что каждый из них требует разработки индивидуальной терапии, возможность лечения нескольких заболеваний с помощью одного продукта генотерапии, безусловно, требует дальнейшего изучения и независимого подтверждения эффективности. И последнее соображение - емкость упаковки AAVs, которая ограничена всего 4,7 Кб. PMDs, для которых интересующая кДНК имеет большой размер и полезная нагрузка превышает этот предел, не смогут быть упакованы в AAV-вектор.
3.3 AAV strategies for mitochondrial disorders due to mtDNA gene defects


Недавно были проведены клинические испытания генотерапии при LHON. LHON- это PMD вызывающее слепоту, как правило, у мужчин в возрасте от 15 до 35 лет. В нескольких клинических испытаниях принимали участие пациенты с m.11778G>A;p.Arg340His в MT-ND4 и использовали методику «аллотопической» экспрессии (табл. 2). Ген MT-ND4 перекодируется в соответствии с генетическим кодом, используемым ядерными генами, помечается на неродной MTS и затем доставляется с помощью вектора AAV2 через интравитреальный путь введения. После того как ген MT-ND4 попадает в ядро трансдуцированных клеток, он транскрибируется, полученная мРНК транслируется в цитозоле, а полученный белок направляется в митохондриальный компартмент через МТС.

TABLE 2. Summary of gene therapy studies for mitochondrial disorders due to mtDNA gene defects.
Поскольку глаз является иммунопривилегированным, относительно автономным и доступным для интравитреального введения, это позволяет ограничить вне-окулярную трансдукцию, тем самым ограничивая системную токсичность. LHON является подходящей мишенью для генотерапии, поскольку у большинства пациентов поражается только глаз, хотя в редких случаях у них могут развиться дополнительные неврологические признаки (известные как «LHON плюс»). С точки зрения дизайна клинических испытаний, нацеливание на глаз облегчалось прямым интравитреальным путем, а также наличием простых объективных и релевантных заболеванию показателей для оценки ответа на лечение. Наконец, удалось набрать более генетически однородную популяцию, поскольку патогенный вариант m.11778G > A в MT-ND4 ответственен примерно за 60-70% случаев в Северной Европе и ~ 90% случаев в Азии.81
Испытания показали улучшение остроты зрения как в глазах, инъецированных AAV, так и в фиктивных глазах, контралатеральных глазам, инъецированным AAV, в степени, значительно превышающей естественную историю LHON (при которой улучшения остроты зрения у пациентов старше 15 лет на момент начала потери зрения не происходит). Одно из возможных объяснений терапевтического эффекта, наблюдаемого при мнимых инъекциях в контралатеральные глаза, следует из исследований, проведенных на нечеловеческих приматах (NHP)82, в которых геномы AAV2 были обнаружены в зрительном бугре, а также в контралатеральной сетчатке, что предполагает антероградный транспорт векторов в зрительный нерв, перенос через зрительный бугор в контралатеральный зрительный нерв и затем ретроградный транспорт в контралатеральную сетчатку. Однако эти данные вызывают недоумение, поскольку в исследованиях на NHP контралатеральная трансдукция была более низкой и кратковременной по сравнению с ипсилатерально инъецированными глазами, в то время как в клинических испытаниях степень улучшения, наблюдаемая как в глазах, подвергшихся генотерапии, так и в глазах противоположной стороны, была сопоставимой. Уже упоминалось, что данный подход является весьма спорным, поскольку импорт и включение аллотопически экспрессированных белков, кодируемых мтДНК, в функциональные дыхательные комплексы не были убедительно подтверждены доклиническими данными.
В целом, испытания продемонстрировали улучшение остроты зрения у пациентов с LHON несущих патогенный вариант мтДНК m.11778G>A, получавших генную терапию AAV2, превышающее ожидаемое при естественной истории болезни. С точки зрения безопасности, мета-анализ 189 пациентов83 , получавших генотерапию AAV2 (AAV2-CMV-COX10 MTS-hND4, lenadogene nolparvovec) для лечения LHONв четырех различных клинических исследованиях, показал, что лечение в целом хорошо переносится. Хотя внутриглазное воспаление было частым побочным явлением после генотерапии, оно часто разрешалось спонтанно или с помощью глазных кортикостероидных капель. Системные побочные эффекты были редкими и слабыми. Кроме того, в периферической крови обнаруживалась низкая вирусная нагрузка.
3.4 Lentiviral strategies


Ретровирусные векторы были одними из первых векторов, которые были исследованы в генотерапии. Они основаны на оболочечных РНК-вирусах, которые требуют обратной транскрипции своего генома для получения dsDNA после клеточной трансдукции.84 Рекомбинантные версии этих векторов обладают рядом преимуществ, включая большую емкость упаковки для интересующего гена,85 и интеграцию в геном хозяина, что приводит к постоянному сохранению трансгена.86 Лентивирусы имеют преимущество перед более ранними гамма-ретровирусами в том, что они трансдуцируют как делящиеся, так и не-делящиеся (т.е, Терминально дифференцированные) клетки.87 Их геном сохраняет некоторые компоненты генома ВИЧ1, но несколько элементов ВИЧ1 были удалены, что делает их дефектными в плане репликации.88 Как ретровирусы, они сохраняют способность интегрироваться в геном клетки-хозяина, но в местах, удаленных от протоонкогенов, что обеспечивает более безопасный профиль интеграции.89, 90 В 2020 году Libmeldy (atidarsagene autotemcel), лентивирусный продукт генотерапии, был лицензирован в ЕС для лечения метахроматической лейкодистрофии ex vivo. Данные долгосрочного наблюдения, опубликованные в журнале 202291, не выявили признаков клональной пролиферации, что дает столь необходимую уверенность в безопасности лентивирусного подхода к лечению нейрометаболических заболеваний, которые в настоящее время поддаются трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Лентивирусная генотерапия была использована для лечения мышиной модели MNGIE. В экспериментах использовался подход с переносом генов ex vivo92 , при котором клетки костного мозга отрицательной линии от мышей-доноров Tymp-/-Upp1-/- (dKO) трансдуцировались лентивирусными векторами, содержащими hTYMP под управлением промотора фосфоглицерокиназы. Трансдуцированные клетки вводили реципиентам dKO, предварительно подвергнутым облучению всего тела. Это привело к восстановлению уровня TP в крови, снижению уровня Thd в плазме, мозге и висцеральных тканях,93 а также к обращению вспять отека белого вещества на МРТ мозга и губчатых дегенеративных изменений в мозге,94 что свидетельствует об эффективности данного подхода. Однако дефицит TYMP является исключением в PMDs поскольку патофизиология заболевания обусловлена токсическим повышением уровня Thd и дезоксиуридина (dUrd). Это обосновывает использование подхода лентивирусной генотерапии ex vivo для достаточного катаболизма этих метаболитов. Этот подход не применим к другим PMDs затрагивающим мозг, где необходима трансдукция in vivo соответствующих областей мозга.
В целом, преимущества лентивирусного подхода заключаются в большей емкости упаковки по сравнению с AAV и в том, что интеграция вектора позволяет преодолеть разбавление вектора, которое наблюдается при использовании AAV в высоко митотически активных органах. К недостаткам можно отнести то, что использование лентивирусов in vivo не было опробовано в доклинических моделях PMDs и существует теоретический риск инсерционного мутагенеза.
3.5 Destruction of mutant mtDNA to treat mtDNA disorders
3.5.1 Transcription activator-like effector nucleases


TALENs - это нуклеазы, которые специфически расщепляют ДНК целевой последовательности. ДНК-связывающие домены TALE, используемые в TALEN, происходят от бактерий Xanthomonas, которые вторгаются в клетки растений и активируют промоторы хозяина для эффективного заражения и распространения.95 Специфическое связывание последовательности ДНК TALEN обеспечивается модулями длиной 34 аа. Каждый из этих модулей связывает сайт длиной 1 п.н. через повторяющиеся вариабельные diresidues (RVDs). Изменяя RVD в каждом модуле и соединяя несколько модулей в длинный массив, можно добиться новой специфичности ДНК. TALEN представляют собой гетеродимерные белки: каждый мономер предназначен для связывания определенной целевой последовательности ДНК и присоединен к не зависящему от последовательности эндонуклеазному домену из фермента IIS типа FokI (рис. 2A). Успешное связывание TALEN и димеризация FokI приводят к расщеплению ДНК. Это используется для использования отсутствия механизмов репарации разрывов dsDNA в мтДНК, что приводит к быстрой деградации расщепленных молекул мтДНК.96 Таким образом, цель состоит в том, чтобы вызвать сдвиг гетероплазмии мтДНК в сторону мтДНК WT.

FIGURE 2

(A) The architecture of a dimeric mitochondrially targeted transcription activator-like effector (TALE) nuclease (mitoTALEN). This programmable nuclease contain the MTS from superoxide dismutase 2 (SOD2) and/or the COX8 subunit of complex IV plus subunit 9 of Neurospora crassa ATPase 9 (COX8–Sub9) and obligatory heterodimeric, ELD(?) and KKR(+), FokI nuclease domains of Type IIS restriction enzyme. (B) Schematic structure of the dimeric mitochondrial zinc-finger nuclease (mtZFN) architecture. Mitochondrial targeting of mtZFNs is facilitated by a 49-amino-acid MTS from subunit F1? of human mitochondrial ATP synthase. Similarly to mitoTALENs, mtZFN encompass obligatory heterodimeric FokI nuclease domains (ELD(-) and KKR(+)). NES, nuclear export signal; ZFP, zinc-finger peptide. (C) The schematic structure of mitochondrial maganuclease (mitoARCUS). The ARCUS programmable nuclease for mtDNA editing is based upon the Chlamydomonas reinhardtii chloroplast homodimeric homing endonuclease I-CreI. Native I-CreI is a homodimeric enzyme that cuts DNA by binding to a 22-bp double-stranded DNA sequence. ARCUS meganucleases have been engineered to operate as monomers, with novel sequence specificity being achieved through directed evolution and in silico design. mitoARCUS contains a mitochondrial targeting sequence (MTS) from the nuclear gene encoding the COX8 subunit of complex IV.
Bacman и др.97 разработали митохондриально нацеленные TALEN (mitoTALEN), которые можно использовать для нацеливания на молекулы мтДНК, содержащие точечные мутации или крупномасштабные делеции мтДНК. Чтобы нацелиться на точечную мутацию m.14459G>A в гетероплазматических культивируемых клетках, был разработан специфичный для мутации мономер mitoTALEN, распознающий сайт мутации. Когда этот мономер димеризуется с мономером-компаньоном, связывающим мтДНК на противоположной нити, образуется разрыв dsDNA. Мономеры не разрезают мтДНК WT, поскольку она не распознается специфичным для мутации мономером, предотвращающим димеризацию. В другом случае мономеры mitoTALEN были сконструированы таким образом, чтобы связывать ДНК WT, фланкирующую по обе стороны от делеции 5 Кб (общая делеция, m.8483_13459del4977).97 Таким образом, домены FokI находились в достаточной близости, чтобы димеризоваться друг с другом в присутствии делеции 5 Кб, расщепляя мтДНК с делецией и оставляя нормальные молекулы мтДНК нетронутыми. Экспрессия MitoTALEN в цибридных клетках остеосаркомы человека 143B, гетероплазматических по делеции 5 Кб, привела к снижению процента молекул мтДНК, содержащих делецию, и соответствующему увеличению процента нормальной мтДНК, хотя также наблюдалось преходящее снижение (истощение) общего количества мтДНК.
Reddy и др.98 исследовали использование mitoTALEN в клетках, гетероплазмичных для LHONс дистонией (LHON) и синдрома нейропатии, атаксии, пигментного ретинита (NARP). Исследователи использовали цибридные ооциты, созданные в результате слияния мышиных ооцитов с фибробластами пациентов. Затем эти клетки были слиты с цибридными клетками остеосаркомы 143B, гетероплазматическими по m.14459G>A. В полученные клетки вводили мРНК, кодирующую mitoTALEN, который нацелен на вариант m.14459G>A. Анализ клеток показал уменьшение количества мтДНК, содержащей вариант LHOND. Аналогичный подход был использован для воздействия на цибридные ооциты и иммортализованную линию клеток с мутацией m.9176T>C, связанной с NARP. Использование mitoTALEN, нацеленных на m.9176T>C, показало сдвиг гетероплазмии в сторону мтДНК WT через 72 часа после трансфекции.
Pereira и др. показали, что mitoTALENs могут быть усовершенствованы путем использования альтернативной мономерной нуклеазы меньшего размера (I-TevI), которая может быть сконструирована для распознавания специфических вариантов мтДНК (mitoTev-TALEs). Эта методология была использована для сдвига гетероплазмии в сторону WT мтДНК и устранения дефицита OXPHOS в цибридах, полученных от пациентов, гетероплазмированных по m.8344A>G, который ассоциируется с миоклонической эпилепсией с лохматыми красными волокнами.99
mitoTALEN также был успешно применен in vivo для спасения мышиной модели митохондриальной кардиомиопатии m.5024C>T. Вариант m.5024C>T дестабилизирует митохондриальную tRNAAla, что влияет на митохондриальную трансляцию.100 У мышей с вариантом m.5024C>T снижается общая масса тела, развивается кардиомиопатия и дефицит COX в скелетных мышцах и толстой кишке. Bacman et al.101 использовали векторы AAV9 для одновременной экспрессии двух мономеров mitoTALEN, один из которых распознает патогенный вариант, а затем димеризуется со вторым мономером, вызывая расщепление мтДНК ниже по течению от локуса варианта. Внутримышечное введение каждого вектора AAV9 в концентрации 1,0-1,5 x 1012 vg/мышь приводило к восстановлению мтДНК WT, а также экспрессии tRNAAla. Внутривенное введение векторов AAV9 ювенильным мышам в возрасте 2-3 недель и внутрибрюшинное введение неонатальным мышам в той же дозе на мышь приводило к хорошей трансдукции тканей скелетных мышц и сердца, что приводило к сдвигу гетероплазмии в сторону WT мтДНК, не вызывая истощения мтДНК в этих органах.
3.5.2 Zinc finger nucleases


ZFNs - это еще один тип нуклеаз, которые использовались для расщепления мутантных молекул мтДНК. ZFNs состоят из модульных и проектируемых, специфичных для последовательности ДНК-связывающих пептидов с цинковыми пальцами, соединенных с доменом FokI. Для создания ДНК DSBs два мономера ZFN должны находиться в непосредственной близости, что позволяет FokI димеризоваться (рис. 2B). Minczuk и др.102 сообщили о версии митохондриального ZFN, оснащенной MTS, - mtZFNs. Подобно mitoTALENs, димерная архитектура mtZFNs позволяет нацеливаться как на точечные мутации, так и на делеции мтДНК. В соответствии с этим mtZFNs были использованы для сдвига гетероплазмии мтДНК в клетках с точечной мутацией m.8993 T>G и общей делецией 5 Кб (m.8483 103, 104 В этих экспериментах клетки, стабильно или транзиторно трансфицированные mtZFNs, демонстрировали существенный сдвиг гетероплазмии в сторону мтДНК WT, за которым следовало восстановление числа копий мтДНК, причем изменения в уровне мутантов были стабильными с течением времени и приводили к улучшению функции митохондрий.
После обширных экспериментов in vitro Gammage и др.105 исследовали mtZFNs in vivo, используя установленную модель мыши m.5024C>T с помощью AAV. Таким образом, потребовалась совместная экспрессия обоих мономеров, каждый из которых был представлен отдельным вектором AAV9.45 (кардиотрофический серотип). Была создана библиотека из 24 возможных ZFN, нацеленных на патогенный вариант. На основе данных in vitro была выбрана лучшая пара мономеров для исследований in vivo. Затем были сконструированы AAV, содержащие две различные кассеты: по одной для каждого мономера, под контролем промотора CMV. AAVs вводили мышам внутривенно в концентрации 5 x 1012 векторных геномов (vg)/мышь, а затем за животными следили до 65 дней после инъекции. Это привело к специфическому снижению количества мутированных мтДНК в сердце животных по сравнению с фибробластами кожи, взятыми из ушных вырезов до инъекций. Сравнение уровней гетероплазмии в коже и сердце стало возможным благодаря тому, что модель имеет сходные уровни гетероплазмии мутантных мтДНК в этих тканях. У обработанных животных наблюдалось восстановление стабильности митохондриальной tRNAAla в сердце, повышение уровня лактата, пирувата и аспартата в тканях. Более высокие дозы 1 x 1013 vg/мышь приводили к индукции истощения мтДНК, что означает, что тщательный подбор дозы будет иметь важное значение для клинического применения. Важно отметить, что не наблюдалось никаких вне-целевых эффектов на ядерный геном.
3.5.3 Meganucleases


Zekonyte et al.106 использовали мегануклеазу, направленную на мтДНК, под названием mitoARCUS для борьбы с вариантом m.5042C>T у мышей, применяя метод доставки с помощью вектора AAV9. Мегануклеаза основана на гомодимере бактериальной эндонуклеазы, который может быть сконструирован для создания сайт-специфических разрывов dsDNA (рис. 2C). Как и в случае с ZFNs и TALENs, создание сайт-специфических разрывов dsDNA позволяет удалять мутантные молекулы мтДНК и сдвигать гетероплазмию мтДНК в пользу молекул мтДНК WT. Первые исследования in vitro с использованием mitoARCUS в эмбриональных фибробластах мыши, несущих вариант m.5042C>T, показали значительное снижение содержания мутантной мтДНК. Однако общая мтДНК также значительно истощилась и восстановилась до нормального уровня только через 21 день. Далее векторы AAV9, содержащие кодирующую последовательность mitoARCUS, вводили внутривенно ювенильным мутантным мышам в возрасте 2,5 недель и взрослым мутантным мышам в возрасте 6 недель. У ювенильных мышей наблюдалось прогрессирующее снижение содержания мутантной мтДНК в сердце, скелетных мышцах, почках и печени, при этом значительного общего истощения мтДНК в течение 6 месяцев наблюдения не наблюдалось. У взрослых инъецированных мышей наблюдалась более сильная экспрессия кассеты в сердце и печени и почти полное уничтожение мутантной мтДНК в печени, которое сохранялось и в последующем. Элиминация мутантных молекул мтДНК ассоциировалась со значительным улучшением экспрессии мт-tRNAAla в печени по сравнению с мышами, которым вводили контрольный AAV9-GFP. Эти данные свидетельствуют о том, что данная методика перспективна и требует дальнейшего развития.
3.6 Gene editing for mitochondrial diseases
3.6.1 CRISPR-Cas9 gene editing


Редактирование генов с помощью CRISPR-Cas9 позволило редактировать гены, кодируемые ядерной системой. Редактирование генов, кодируемых мтДНК, пока невозможно из-за невозможности эффективного импорта компонентов редактирования, в частности направляющей РНК (sgRNA), через обе мембраны митохондрий.107, 108
CRISPR-Cas9 редактирование генов было применено к iPSC модели OPA1-доминантной атрофии зрительного нерва.109 iPSC были получены из фибробластов пациента, содержащих патогенный вариант c.1334G>A; p.Arg445His в OPA1. sgRNAs были сконструированы для обеспечения Cas9-опосредованных разрывов dsDNA проксимальнее и дистальнее позиции c.1334, а шаблоны ssDNA, содержащие последовательность WT, были введены путем трансфекции в iPSCs. Исправление варианта было подтверждено секвенированием по методу Sanger, и клоны культивировали для оценки функциональных показателей. Это включало восстановление морфологии митохондриальной сети и скорости потребления кислорода клетками, а также восстановление апоптоза, вызванного staurosporine, и числа копий мтДНК до контрольных уровней WT.
Было проведено испытание in vivo метода редактирования генов CRISPR-Cas9110 для интеграции hTYMP в интрон либо эндогенного гена Tymp в мышиной модели, либо гена, кодирующего альбумин (Alb), тем самым помещая трансген под прямой контроль эндогенных промоторов локусов Tymp и Alb соответственно. Это было достигнуто путем доставки кДНК hTYMP в векторе AAV8 и доставки CRISPR/Cas9 либо в виде мРНК, содержащейся в липидных наночастицах, либо в виде ДНК через другой вектор AAV8. У обработанных мышей наблюдалось длительное восстановление активности TP в крови и снижение уровней Thd и dUrd до нормальных значений, причем наибольшая эффективность наблюдалась при использовании метода доставки мРНК CRISPR/Cas9 в виде липидных наночастиц. Эти данные расширяют возможные методы, с помощью которых AAV и более новые системы доставки могут обеспечить долгосрочную экспрессию трансгенов в печени при митохондриальных заболеваниях.
Генотерапия CRISPR-Cas9 в контексте PMDs все еще находится в зачаточном состоянии. Необходимо провести больше работ in vivo с использованием существующих хорошо охарактеризованных доклинических моделей, чтобы оценить ее применение для лечения PMDs вызванных патогенными вариантами ядерных генов. Как уже говорилось ранее, он не будет применим к заболеваниям, вызванным точечными мутациями и масштабными делециями/перестройками мтДНК, из-за сложности импорта направляющей РНК через митохондриальные мембраны. Также сохраняется риск внецелевого редактирования.
3.6.2 CRISPR-free gene editing


Другой перспективной технологией является цитидиндеаминаза, которая позволяет редактировать основания dsDNA без CRISPR.111 DddA - это цитидиндеаминаза, которая превращает цитозин в урацил в dsDNA, что приводит к изменению оснований C>T. В природе она входит в состав секретируемого бактериального токсина, производимого Burkholderia cepacia для индуцирования мутагенеза в соседних бактериях. Доставка интактного белка в клетки HEK293T вызывала токсичность in vitro, но когда DddA расщепляется на две неактивные части, он становится менее токсичным, чем при доставке в клетки в его естественном состоянии. Первые экспериментальные работы in vitro показали, что такая методология экспрессии с расщеплением может вызывать редактирование оснований остатков цитозина, следующих за тимином. Чтобы добиться редактирования митохондриальных генов, половинки DddA были соединены с белками массива TALE, содержащими MTS. Эти редакторы оснований DddA были названы DddA-derived cytosine base editors (DdCBEs). (Рисунок 3). Это позволило осуществить сайт-специфическое редактирование мтДНК нескольких генов in vitro, включая MT-ND1, MT-ND2, MT-ND4, MT-ND5 и MT-ATP8 с эффективностью до 40 %.



FIGURE 3 (A) The chemistry of cytosine editing. Cytosine deamination generates uracil in DNA which base pairs as thymidine. R = 2'-deoxyribose in DNA. (B) The architecture of DddA-derived cytosine base editors (DdCBEs). The DdCBE architecture comprises a pair of MTS–TALE or, in the case of ZF-DdCBE, MTS–zinc finger arrays linked to one DddAtox (DddA) half. DddA can be split at various positions (e.g., G1333 or G1397). DdCBE also contain a uracil glycosylase inhibitor (UGI) and the MTS from SOD2 and the cytochrome c oxidase subunit 8A (COX8A). (C) The chemistry of adenine editing. Adenosine deamination leads to inosine, which can base pair with guanosine in a DNA polymerase active site. R = 2'-deoxyribose in DNA. (D) The architecture of transcription activator-like effector adenine deaminases (TALEDs). The main TALED architectures comprise a pair (dimeric) or a single MTS–TALE array (monomeric) linked to a catalytically inactive version of DddAtox (DddAFullDead), which is believed to unwind DNA, and the TadA adenosine deaminase.
Развивая технологию DdCBE, Silva-Pinheiro и др.112 показали, что можно индуцировать варианты de novo в определенных желаемых локусах мтДНК in vivo в соматических тканях. Для этого использовались векторы AAV9.45, кодирующие мономеры DdCBE, которые вводились внутривенно в сердце новорожденных и взрослых мышей. В последующем как у новорожденных, так и у взрослых мышей в тканях сердца обнаруживались высокие уровни отредактированных молекул мтДНК, причем более высокая эффективность наблюдалась у неонатально введенных мышей. Однако в мтДНК наблюдалось значительное вне-целевое редактирование, особенно у новорожденных по сравнению со взрослыми мышами, что указывает на необходимость дальнейшей доработки технологии для повышения специфичности.
После первоначального подтверждения концепции редактирования мтДНК в мышиных эмбрионах с помощью специально разработанных DdCBEs113 , Lee et al. использовали DdCBEs для базового редактирования гена mt-Nd5 на одноклеточной эмбриональной стадии и создания трансгенных мышей, несущих вариант m.12918 G>A114 (аналогичный варианту m.13513A>G у человека, который ассоциирован с митохондриальной энцефаломиопатией, молочнокислым ацидозом и инсультоподобными эпизодами [MELAS] и синдромами Leigh). Кроме того, совместное введение mitoTALEN для деградации всех не-редактированных молекул мтДНК увеличивало % гетероплазмии для индуцированного патогенного варианта. У мутантных мышей наблюдалась потеря веса, ультраструктурные аномалии митохондрий при электронной микроскопии и гистологические аномалии в головном мозге, включая вентрикуломегалию и атрофию гиппокампа.
Инъекция DdCBE одноклеточному эмбриону также использовалась Silva-Pinheiro и др.115 для введения нонсенс-варианта m.8069G>A для инактивации гена Mt-Atp6 мыши. Эта работа была частью усилий по созданию библиотеки DdCBEs - MitoKO, оптимизированной для точного устранения каждого белок-кодирующего гена мтДНК в митохондриальном геноме мыши.
Mok и др.116 усовершенствовали дизайн DdCBEs, чтобы расширить контекст последовательности для редактирования оснований, а также повысить эффективность редактирования. Эти новые варианты DdCBE были способны редактировать остатки C, следующие за любым нуклеотидом, а не только за T. Группа продемонстрировала, что новые DdCBE могут быть использованы в мутагенезе для создания вариантов мтДНК в клетках человека в гене MT-ND4, которые ассоциированы с LHON например m.11696G>A, который находится в контексте последовательности AC.
Дальнейшая работа с DdCBEs привела к созданию DdCBEs с цинковыми пальцами (ZF-DdCBEs)117 и последующему улучшению их эффективности редактирования путем инженерии их архитектуры, определения улучшенных ZF-скаффолдов и установки мутаций, повышающих активность DddA.118 Используя небольшой размер ZF-DdCBEs, Willis и др.118 использовали один вектор AAV9 (вместо двух векторов, необходимых для доставки DdCBEs на основе TALE) для установки патогенных вариантов путем редактирования оснований в сердце, печени и скелетных мышцах постнатальных мышей.
Cho и др.119 расширили подход еще больше, разработав (TALE)-связанные деаминазы, которые связываются с аденин-деаминазой, а не с цитидин-деаминазой (рис. 3). Аденин-деаминазы преобразуют остатки аденина в инозин, который соединяется с цитозином, что позволяет осуществлять преобразования A-to-G в мтДНК в клетках человека. Таким образом, это позволило бы осуществлять мутагенез гораздо большего числа известных патогенных вариантов мтДНК, для которых изменения оснований A>G часто наблюдаются у пациентов.
DdCBE еще не использовались для исправления патогенных вариантов мтДНК ни in vitro, ни in vivo. Например, активность цитидиндезаминазы, обеспечивающая C>T-переходы на антисмысловой нити, могла бы обеспечить G>A-переходы на смысловой нити, что было бы терапевтически эффективно для исправления патогенных A>G-вариантов. Однако, как обсуждалось выше, усовершенствование этой технологии с целью повышения специфичности, обеспечения возможности доставки in vivo и нацеливания на органы, а также использования различных нуклеотидных деаминаз расширило терапевтический потенциал этой технологии. Остается выяснить, будет ли этого достаточно для спасения большинства мутантных молекул мтДНК клеток в нужных тканях, чтобы добиться длительной эффективности. Кроме того, теоретически возможно внецелевое редактирование оснований в мтДНК или ядерной ДНК, что необходимо изучить в ходе будущих доклинических исследований.
3.7 Challenges of clinical translation of gene therapy for mitochondrial disorders


Некоторые из проблем, которые необходимо учитывать при клинической трансляции генотерапии, включают достижение адекватной трансдукции органов, безопасное дозирование, дизайн клинических испытаний, определение показателей результатов и набор участников испытаний.
3.8 Achieving adequate organ transduction


PMDs часто вызывают мультисистемное поражение. С точки зрения генотерапии, это создает необходимость одновременного воздействия на несколько различных органов/тканей. Висцеральные органы могут быть исправлены при внутривенном введении, но вовлечение ЦНС является важным моментом, поскольку многие PMDs затрагивают мозг.
3.8.1 Current experience using IV AAV9 gene therapy to transduce the CNS


Достижения в подходах к восстановлению генов AAV позволили разработать серотипы, которые улучшили трансдукцию в ЦНС при внутривенном введении. Ранние исследования Foust et al. с использованием scAAV показали, что с помощью внутривенного введения AAV9 можно воздействовать на мозг новорожденных мышей.46 Иммуногистохимические результаты этого исследования продемонстрировали высокую экспрессию GFP в мозге после внутривенного введения генов новорожденным и взрослым. Однако Gray и др.120 показали, что перенос генов взрослым животным с помощью внутривенного введения scAAV у NHP привел к низкой трансдукции в головном мозге по сравнению с мышами при аналогичных дозах/кг, что означает, что дальнейший клинический перевод с использованием данного типа конструкции и способа воздействия на мозг, вероятно, будет проблематичным. Исправление фенотипа заболевания у мышей с дефицитом SMN121 обеспечило уверенность в использовании внутривенной генотерапии AAV9 для воздействия на спинной мозг, что привело к успешным клиническим испытаниям при СМА 1 типа.122 Однако доклинические исследования46, 121 также показали, что нацеливание на головной мозг уступает нацеливанию на спинной мозг с помощью внутривенного введения. Как уже говорилось ранее, генотерапия на основе AAV применялась и в других мышиных моделях PMDs. Неонатальные внутривенные инъекции AAV9 не смогли спасти неврологический фенотип модели синдрома Leigh с дефицитом NDUFS4.45 Таким образом, эти исследования не подтверждают использование внутривенных инъекций AAV9 для воздействия на мозг. Необходимо рассмотреть альтернативные подходы.
3.8.2 Alternative AAV serotypes


Недавно с помощью библиотек капсидов были созданы новые синтетические рекомбинантные серотипы AAV путем отбора векторов с улучшенной трансдукцией в ЦНС. AAV PHP.B продемонстрировал более высокую трансдукцию в мозг по сравнению с AAV9 при внутривенном введении мышам C57/BL6.123 Он также устранил аномалии мозга у мышей с дефицитом NDUFS4.124 Однако результаты биораспределения не были воспроизведены в других штаммах мышей и NHP, что означает, что клинический перевод этого подхода маловероятен.125, 126 Другой новый серотип, AAV-F, продемонстрировал лучшую нацеленность на мозг после переноса генов взрослым IV мышам по сравнению с AAV9.43 Это включало усиленную трансдукцию нейронов и астроцитов. Пока что эти результаты не подтверждены у NHP, хотя данные недавнего исследования, в котором сравнивались AAV9 и AAV-F при интратекальной доставке у NHP, не выявили существенных различий в биораспределении в мозге между двумя серотипами127.
Недавно были описаны два новых перспективных серотипа AAV - AAV.CAP-B10 и AAV.CAP-B22.128 AAV.CAP-B10 продемонстрировал усиленную трансдукцию в мозг (в частности, в нейронах) после внутривенного переноса генов у 3-недельных мышей. IV исследования на NHP (мармозетках) показали, что и AAV.CAP-B10, и AAV.CAP-B22 имели более высокую экспрессию трансгенов в головном мозге, чем AAV9, в коре, стриатуме и стволе мозга среди других областей. Кроме того, AAV.CAP-B22 преимущественно трансдуцировал астроциты. Эти новые серотипы AAV дают надежду на то, что можно добиться достаточной трансдукции мозга при внутривенном введении вектора.
3.8.3 Alternative routes of gene transfer to target the CNS


На сегодняшний день FDA не лицензировало ни одного препарата для внутривенной генотерапии in vivo, нацеленного на мозг, несмотря на многочисленные клинические исследования этого подхода.129 В большинстве клинических исследований вместо этого используется внутричерепной путь.130 Преимущества этого подхода заключаются в том, что он обходит гематоэнцефалический барьер, обеспечивая лучшую трансдукцию. Мозг является иммунопривилегированным местом, что означает меньшую вероятность вызвать иммунный ответ или повлиять на трансдукцию нейтрализующими анти-ААВ антителами.131
Возможные пути внутричерепного введения - интратекальный (интрацистернальный, поясничный интратекальный), интрацеребровентрикулярный и интрапаренхимальный. Интратекальная доставка предполагает введение в спинномозговую жидкость либо на уровне cisterna magna, либо поясничную интратекальную доставку. Было показано, что интратекальный способ обеспечивает достаточно хорошее биораспределение в мозге и эффективен для улучшения неврологических заболеваний у собак с болезнью Sanfilippo.132, 133 Основным недостатком является высокий риск повреждения продолговатого мозга у людей.134 Интратекальное введение AAV9 в поясничную область позволило устранить митохондриальную дисфункцию мозга при дефиците SURF1 у мышей, однако исследования биораспределения у NHP дали противоречивые результаты,50, 132, 135 поэтому неясно, может ли этот подход быть использован у людей.
Интрацеребровентрикулярный путь является инвазивным, поскольку требует доступа к желудочковой системе мозга. Интрацеребровентрикулярные инъекции AAV9 показали отличное биораспределение по всему мозгу,133 включая трансдукцию как нейронов, так и глии.132, 136 Этот подход улучшил неврологический фенотип в крупных животных моделях болезни Sly132 и болезни Batten CLN5,137 что делает его жизнеспособным вариантом для трансдукции мозга.
Интрапаренхимальный способ предполагает прямые инъекции в мозг, что обеспечивает локальную доставку и снижает нейротоксичность вне мишени.138 Клинические испытания интрапаренхимальной генотерапии в мозге проводятся для лечения дефицита AADC и болезни Sanfilippo, а также продемонстрировали эффективность при болезни Batten.130, 139 Трудность в случае PMDs когда поражены несколько областей мозга, заключается в том, что, скорее всего, потребуется большое количество инъекций, что снижает целесообразность применения данного подхода.
Недостатками внутричерепных путей является то, что они требуют нейрохирургического вмешательства, что может повлечь за собой периоперационные осложнения, а также возможность местных иммунных реакций.140 Кроме того, при многих PMDs когда поражаются и висцеральные органы, вероятно, потребуется внутривенное введение препаратов для воздействия на эти органы.
Необходимы дальнейшие доклинические исследования с использованием новых серотипов векторов и/или комбинированных способов доставки для совершенствования существующих подходов к генотерапии при PMDs.
3.9 Safety considerations


Из недавних клинических испытаний AAV многое стало известно о дозировке, токсичности и иммуногенности AAV. Токсичность высоких доз AAV у людей вызвала обеспокоенность в последние несколько лет.141 Высокими дозами генотерапия IV AAV9 была связана с тяжелой печеночной недостаточностью у двух пациентов со спинальной мышечной атрофией 1 типа в дозах 1,1 х 1014 vg/кг,142 и тромботической микроангиопатией (тромбоцитопения, анемия, активация комплемента) и острой почечной недостаточностью у двух пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна в дозах ~,5 x 1013 vg/кг.143 Высокая доза AAV8 в дозе ~1 ?x 1014 vg/кг, введенная пациентам с Х-сцепленной миотубулярной миопатией, была связана с желудочно-кишечной инфекцией, печеночной недостаточностью, сепсисом, повышением сердечного тропонина и смертью в двух случаях, хотя эти токсические эффекты не наблюдались после введения сравнимых доз у мышей и NHP.144 Увеличение дозы, необходимое для перехода между доклиническими и клиническими исследованиями, не является простым и требует исследовательского повышения дозы для определения минимальной эффективной дозы.
Предшествующий гуморальный и опосредованный Т-клетками иммунитет является общепризнанной проблемой, поскольку большой процент здорового населения демонстрирует серопозитивность к естественным AAV и ответы Т-клеток памяти в несколько меньшей степени.145, 146 Испытания обычно исключают пациентов с выявляемыми антителами как часть критериев отбора147 , поскольку это связано с потерей трансдукции. Это уменьшит число пациентов, которые потенциально могут получить пользу от лечения.
3.10 Clinical trial design


Клинические испытания новых методов лечения редких заболеваний часто не контролируются плацебо и не проводятся вслепую, поэтому использование данных когорты пациентов с естественной историей болезни может оказаться полезным.148 Участники испытаний также могут выступать в качестве собственного «контроля »149 , особенно если до переноса генов у них уже были симптомы. Выявление существующих пациентов с помощью реестров пациентов с митохондриальными заболеваниями, например, когорты пациентов с митохондриальными заболеваниями Великобритании150 или ее международных аналогов, вероятно, будет полезным. Введение вектора генотерапии здоровым добровольцам для оценки безопасности (исследование фазы I) не предполагается.151 Вместо этого часто проводится совместное исследование безопасности и эффективности на небольшом количестве пациентов, что позволяет достичь целей фазы I и II.
3.11 Establishing trial outcome measures and clinical trial readiness


Показатели исхода можно определить как «элементы, измеряющие изменения в состоянии здоровья или качестве жизни».152 Необходимо рассмотреть, какие биохимические, молекулярные и клинические показатели исхода могут быть использованы при разработке клинических испытаний в соответствии с фенотипом заболевания. Например, на одном международном семинаре по методу Дельфи, направленном на определение готовности к клиническим испытаниям первичных митохондриальных миопатий, клинические эксперты по PMDs согласились с необходимостью использования стандартизированных, валидированных и воспроизводимых показателей результатов в клинических испытаниях, набирающих взрослых и детей с митохондриальными миопатиями.153 Это включало достижение консенсуса относительно того, какие клинические шкалы, функциональные тесты, показатели результатов деятельности, показатели результатов по отзывам пациентов, включая показатели качества жизни, и биомаркеры должны использоваться в будущих испытаниях.
Необходимы биомаркеры крови, достоверно отражающие тяжесть заболевания, тем более что молекулярные и биохимические анализы тканей, которые используются во многих доклинических исследованиях генотерапии для демонстрации эффективности, вряд ли могут быть использованы в условиях клинических испытаний из-за инвазивности биопсий. В последние годы изучалась возможность использования FGF21 и GDF15154 , однако ни один из них не является специфичным для PMDs и уж тем более не относится к какому-либо конкретному генетическому дефекту. Необходимо провести дополнительные исследования биомаркеров, и в этом может помочь использование доклинических моделей животных и мультиомических подходов.12
В клинических испытаниях генотерапии при LHON например, в качестве показателей результатов использовались острота зрения с лучшей коррекцией и оптическая когерентная томография. Неврологический осмотр и результаты развития можно отслеживать с помощью валидированных шкал, таких как Ньюкаслская шкала педиатрических митохондриальных заболеваний.155 Хотя некоторые из этих систем оценки были разработаны не для митохондриальных расстройств, они все же могут точно отражать неврологические особенности, но в идеале должны быть оценены для данной когорты пациентов. В клиническом исследовании idebenone при MELAS в качестве показателей исхода использовался балл по Шкале тяжести усталости, а также венозный и церебральный лактат (по данным МР-спектроскопии) (NCT00887562). Наконец, можно было бы использовать данные естественной истории болезни, учитывая вероятное отсутствие контрольной группы в будущих испытаниях, но это, вероятно, будет полезно только в том случае, если данные будут собираться проспективно у пациентов, сопоставимых по возрасту и тяжести заболевания148.
3.12 Recruitment of trial participants


Необходимо выявить подходящих пациентов для клинических испытаний генотерапии. Многие PMDs проявляются классическими клиническими фенотипами, для которых дифференциальный диагноз может включать несколько различных генетических причин. Фенотипы могут перекрываться с немитохондриальными заболеваниями, что делает генетический диагноз необходимым для определения пригодности к генотерапии. В последние годы это стало возможным благодаря секвенированию следующего поколения, которое является предпочтительным методом диагностики.
PMDs встречаются крайне редко, поэтому количество пациентов, которых можно привлечь к участию в клинических испытаниях генотерапии, будет невелико. Поэтому для набора пациентов потребуется международное сотрудничество, чтобы набрать как можно больше пациентов через международные реестры пациентов. Необходимо будет согласовать критерии включения в исследование. В будущем, если геномный скрининг новорожденных станет доступным, это может привести к раннему выявлению большего числа людей, которым может помочь генная терапия.
4 ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ СООБРАЖЕНИЯ


В будущем, несмотря на то что различные продукты генотерапии будут иметь общие элементы конструкции, наличие различных терапевтических трансгенов или элементов последовательности потребует отдельных региональных разрешений регулирующих органов для каждого продукта генотерапии. Это связано с тем, что каждый из них потенциально может иметь различный токсикологический профиль, а достоинства различных пакетов данных о доклинической эффективности необходимо будет оценивать индивидуально. Это, вероятно, приведет к задержкам в утверждении, но является важным этапом регуляции. К другим проблемам клинического перевода относится необходимость привлечения адекватных инвестиций со стороны фармацевтических компаний. Для некоторых редких заболеваний это является реальной проблемой, особенно если учесть, что пациентов, которым может помочь терапия, может быть немного из-за низкой распространенности заболевания и высокой смертности в раннем детском возрасте, что характерно для многих PMDs. Также вызывает озабоченность доступность лицензированных препаратов генотерапии для бюджетов глобального здравоохранения и справедливый доступ к терапии для тех, кто в ней нуждается, особенно в странах с большим социально-экономическим неравенством.
5 CONCLUSION


Достижения в области разработки генотерапии привели к бурному развитию доклинических подходов к восстановлению генов на основе AAV в доклинических моделях PMDs. Это также стало возможным благодаря созданию более широкого спектра моделей заболеваний, особенно мышиных моделей, которые способны повторять фенотипы заболеваний человека. Тем не менее, трансляционное узкое место очевидно, поскольку только одна из этих генных терапий вошла в клинические испытания, а именно генная терапия AAV2 для лечения LHON Проблемы, связанные с токсичностью вектора AAV при высоких дозах внутривенного введения, препятствовали клиническим испытаниям других метаболических и неврологических расстройств и указывали на необходимость соблюдать осторожность. Поскольку многие PMDs затрагивают ЦНС, необходимо рассмотреть возможность воздействия на ЦНС с помощью других способов доставки. Введение AAV внутричерепным путем создает дополнительные сложности из-за значительного риска таких процедур у людей. Подходы к редактированию генов в настоящее время находятся на очень ранних стадиях разработки. Редактирование генов на основе CRISPR-Cas9 и новые редакторы оснований без РНК пока имеют ограниченное терапевтическое применение, и необходимо также учитывать возможность внецелевого редактирования оснований. Нуклеазы, вносящие разрывы dsDNA в мтДНК, также находятся на ранних стадиях разработки. При переводе на клиническую основу необходимо будет решить вопросы безопасности индукции истощения мтДНК, пусть даже временного, вопросы внецелевой активности нуклеаз и того, будут ли терапевтические сдвиги в гетероплазмии мтДНК устойчивыми в течение длительного времени.
В будущем, учитывая редкость большинства PMDs любые предстоящие клинические испытания потребуют многонационального сотрудничества. Необходимо будет продумать набор участников, сроки переноса генов и выбор релевантных и доступных показателей результатов, чему будет способствовать глубокое понимание естественной истории болезни и перспективная характеристика соответствующих когорт пациентов. Уточнение трансляционных линий принесет пользу научному сообществу и вдохновит на проведение исследований генотерапии при других PMDs для которых очень нужны эффективные методы лечения, модифицирующие болезнь.