Когда ученые впервые начали применять CRISPR для редактирования генома в клетках человека, это открыло шлюзы для изучения генетики заболеваний. В те первые дни редактирования с помощью CRISPR-Cas9 исследователь точной онкологии Francisco Sanchez-Rivera был аспирантом, изучавшим генетику рака в лаборатории Tyler Jacks’ в Массачусетском технологическом институте (MIT). В своей дипломной работе он одним из первых редактировал геномы мышей с помощью CRISPR-Cas9, исследуя генетические факторы рака легких. Эти исследования положили начало интересу Санчеса-Риверы к высокопроизводительному редактированию генома, что послужило основой для его нынешних исследований в Массачусетском технологическом институте.

В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Nature Biotechnology, Санчес-Ривера в сотрудничестве с биохимиком David Liu из Гарвардского университета изучил наиболее часто мутирующий ген рака: TP53, который кодирует хранителя генома, белок-супрессор опухолей p53. Они исследовали тысячи вариантов p53 с помощью новой высокопроизводительной библиотеки датчиков для редактирования праймеров, которая позволяет количественно оценить, как различные мутации влияют на функцию эндогенного белка.

Санчес-Ривера и его команда обнаружили, что некоторые мутации вызывают фенотипы, отличающиеся от тех, что наблюдались ранее в модельных системах со сверхэкспрессией, особенно те, которые затрагивают домен олигомеризации, позволяющий белкам p53 образовывать функциональные тетрамеры в клетках. Работа Санчеса-Риверы подчеркивает важность дозирования эндогенных генов в исследованиях генетики опухолей и создает основу для крупномасштабного исследования генетических вариантов для будущих открытий в области точной медицины.

Система CRISPR-Cas9 не очень хорошо подходит для инженерии специфических мутаций, связанных с раком, таких как однонуклеотидные варианты, однонуклеотидные полиморфизмы, инсерции и делеции, а также различные типы хромосомных перестроек. Я переключил свои усилия на технологии точного редактирования генома, такие как редактирование цитозиновых оснований и адениновых оснований, первоначально разработанные в лаборатории David Liu’s Alexis Komor (сейчас биохимик в Калифорнийском университете в Сан-Диего) и Nicole Gaudelli (сейчас предприниматель в Google Ventures), соответственно. Эти технологии позволили нам создавать специфические однонуклеотидные изменения в геномах клеток и проводить in vivo соматическое редактирование генома у мышей. Это привело к перепрофилированию редактирования оснований CRISPR для высокопроизводительной функциональной геномики, что послужило основой для нашей работы по редактированию праймов. Прайм-редактирование было разработано David Liu and Andrew Anzalone (сейчас он директор Prime Medicine), и это действительно то, что я считаю святым Граалем прецизионного редактирования генома, поскольку оно позволяет нам создавать практически любые типы мутаций.

The prime editing machinery comprises a prime editing guide RNA (pegRNA) and a Cas9 nickase enzyme fused to a reverse transcriptase.

Infographic: How Prime Editing Works

Оригинальная направляющая РНК нуклеазы Cas9 (gRNA) разрушает ДНК и обычно вызывает потерю функции или инактивирующие мутации. В этом контексте количество gRNA , полученное с помощью секвенирования следующего поколения, является косвенным показателем свойств направляющей gRNA, способствующих фитнес-редактированию. Для редактирования оснований и праймирования полагаться на количество gRNA в клетке не точно и меняется количественно. Для решения этих проблем мы разработали сенсорные библиотеки.

Это позволяет нам одновременно количественно оценить эффективность и точность редактирования каждой pegRNA в библиотеке в процессе ее работы в клетках». -Франциско Сбнчес-Ривера, Массачусетский технологический институт

Сенсорные библиотеки - это конструкции, которые кодируют gRNA и синтетическую версию целевого сайта в одной и той же конструкции. Несмотря на то что мы разрабатываем и клонируем синтетический целевой сайт, в контексте библиотеки сенсоров этот целевой сайт призван как можно точнее имитировать эндогенный сайт. Мы включаем целевой сайт и фланкирующие последовательности ДНК, которые основаны на последовательности эндогенного локуса.

Ранее мы показали, что можем получить косвенное измерение событий редактирования оснований, происходящих эндогенно, путем секвенирования этого синтетического целевого сайта в конструкции во время высокопроизводительного скрининга.² В этом исследовании мы взяли страницу из этой книги и создали библиотеку датчиков редактирования оснований.¹

Направляющая РНК для редактирования праймера (pegRNA) в целом является более сложной конструкцией, но концепция та же. Если мы вводим эти библиотеки в клетки, экспрессирующие механизмы редактирования праймера, pegRNA в составе конструкции будет редактировать целевой сайт в сенсоре, а если библиотеки доставляются в клетки того же вида-мишени, pegRNA будет редактировать эндогенный геномный сайт. Это очень важно, поскольку позволяет нам одновременно количественно оценивать эффективность и точность редактирования каждой pegRNA в библиотеке, пока это происходит в клетках.

Почему при разработке библиотек датчиков редактирования праймов вы остановились на р53?

Мы использовали p53 в качестве прототипа по нескольким причинам. Ген, кодирующий p53, является наиболее часто мутирующим геном рака, и до сих пор существует много споров о том, что делают эти мутации.³

3D-рендеринг вариантов р53, связанных с ДНК p53 - это транскрипционный фактор, образующий активные тетрамеры посредством межбелковых взаимодействий, которые способствуют связыванию ДНК и выполнению опухолевых супрессорных функций. Будучи наиболее часто мутирующим геном рака, ученые выявили тысячи вариантов p53, связанных с заболеванием.

Каждая человеческая клетка начинается с двух копий p53 дикого типа. Как правило, первое событие, которое происходит, когда клетка приобретает мутацию p53, - это точечная мутация в одной копии, за которой следует событие потери гетерозиготности, в результате которого мутирует или теряется вторая копия гена TP53. В ряде исследований использовались методы экзогенного мутагенеза на основе кДНК или глубокого мутационного сканирования для сверхэкспрессии различных мутантов, охватывающих ген TP53. Эти исследования проводились на клетках, экспрессирующих дикий тип р53, таких как клетки аденокарциномы легкого, которые мы использовали в нашем исследовании.

С точки зрения генетики, единственное свойство, которое можно измерить с помощью такого подхода, - это доминантно-негативная активность, то есть мутант вводится в контекст тетрамера дикого типа, и доминантно-негативная активность вмешивается в этот пул р53 дикого типа. Но есть определенные мутанты, которые могут обладать и другими свойствами, не только доминантно-негативной активностью.

Мы хотели дойти до момента, когда сможем строго проверить эту модель, и эта работа - только начало. С помощью редактирования праймера мы сконструировали эндогенные мутации, сохранив стехиометрию, дозировку генов и естественный способ возникновения и прогрессирования этих мутаций. Этот метод также позволил нам очень строго проверить технологию, поскольку мы применяли сильный отбор для клеток с нарушенной активностью р53, так что мы быстро получили представление о том, является ли технология надежной и масштабируемой.

Эта область развивается быстро, но иногда мы страдаем от того, что она развивается так быстро, что забываем проводить самые важные эксперименты. Механическое исследование этих мутантов определенно является частью наших следующих шагов. Мы возвращаемся к мышиным моделям, чтобы создать различные типы мутаций в разных тканях, чтобы понять, как они действуют in vivo. Помимо моделирования отдельных мутаций, мы с нетерпением ждем возможности проводить мультиплексное редактирование праймеров в контексте генетических экспериментов с высокой пропускной способностью в мышиных моделях, как мы это делали в клетках.

Gould SI, et al. High-throughput evaluation of genetic variants with prime editing sensor libraries. Nat Biotechnol. Published online March 12, 2024. doi:10.1038/s41587-024-02172-9

Sбnchez-Rivera FJ, et al. Base editing sensor libraries for high-throughput engineering and functional analysis of cancer-associated single nucleotide variants. Nat Biotechnol. 2022;40(6):862-873.

Huang J. Current developments of targeting the p53 signaling pathway for cancer treatment. Pharmacol Ther. 2021;220:107720.