Ползователи:
НАРУШЕНИЯ НЕЙРОТРАНСМИССИИ



Генотерапия

Gene therapy for neurotransmitter-related disorders
Wing Sum Chu, Joanne Ng, Simon N. Waddington, Manju A. Kurian
Journal of Inherited Metabolic DiseaseVolume 47, Issue 1 p. 176-191

Inborn errors of neurotransmitter (NT) metabolism are a group of rare, heterogenous diseases with predominant neurological features, such as movement disorders, autonomic dysfunction, and developmental delay. Clinical overlap with other disorders has led to delayed diagnosis and treatment, and some conditions are refractory to oral pharmacotherapies. Gene therapies have been developed and translated to clinics for paediatric inborn errors of metabolism, with 38 interventional clinical trials ongoing to date. Furthermore, efforts in restoring dopamine synthesis and neurotransmission through viral gene therapy have been developed for Parkinson's disease. Along with the recent European Medicines Agency (EMA) and Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (MHRA) approval of an AAV2 gene supplementation therapy for AADC deficiency, promising efficacy and safety profiles can be achieved in this group of diseases. In this review, we present preclinical and clinical advances to address NT-related diseases, and summarise potential challenges that require careful considerations for NT gene therapy studies.
Нейротрансмиттеры NT представляют собой разнообразную группу химических мессенджеров, включая в основном тормозные аминоацидергические (γ-аминомасляная кислота [GABA] и глицин), возбуждающие аминоацидергические (аспартат и глутамат) и моноаминергические (адреналин, норадреналин, дофамин [DA] и серотонин [5-HT]) системы.1 NTобычно синтезируются, хранятся и высвобождаются из пресинаптических нейронов, диффундируют через синаптическую щель для связывания с постсинаптическими рецепторами и, наконец, транспортируются или ферментативно деградируют для прекращения нейротрансмиссии.1 Inborn errors of NT metabolism (IEM-NT) - это редкая группа заболеваний, обусловленных дефектами синтеза, метаболизма или обратного захвата NT.2, 3 В рамках данного обзора мы сосредоточимся на IEM-NT, определенных Международной рабочей группой по расстройствам, связанным с нейротрансмиттерами.2 Однако многие другие заболевания также могут нарушать гомеостаз NT с аномальным профилем NTв спинномозговой жидкости (CSF), включая митохондриальные заболевания, каналопатии и нарушения синтеза сфинголипидов и холестерина.4
Большинство IEM-NT влияют на синтез, метаболизм и обратный захват моноаминов, а именно DA и 5-HT (рис. 1).DA синтезируется из L-тирозина в два этапа: до levodopa (l-DOPA) с помощью лимитирующей скорость тирозингидроксилазы (TH) с необходимым ко-фактором тетрагидробиоптерином (BH4); затем с помощью декарбоксилазы ароматических L-аминокислот (AADC) и ко-фактора пиридоксаль 5-фосфата (PLP; активная форма витамина B6).5 DA также может быть превращен в норадреналин с помощью дофамин β-гидроксилазы. Моноамины затем упаковываются в везикулы везикулярным моноаминовым транспортером-2 (VMAT2), транспортером нейротрансмиттеров (NTT), для последующей Ca2+-опосредованной стыковки и слияния для высвобождения в синапсе. Дофаминовый транспортер (DAT), NTT из плазматической мембраны, повторно захватывает DA из синаптической щели для пространственно-временной регуляции синаптической DA-нейротрансмиссии.6 Одним из ключевых путей деградации моноаминов является окислительное дезаминирование моноаминоксидазой А.5 Патогенные варианты были идентифицированы в генах, кодирующих ферменты и белки-транспортеры, упомянутые выше.7, 8 Из-за общих метаболических путей между DA и 5-HT, уровень 5-HT может быть затронут при дефектах птерина, дефиците AADC (AADCD) и дефиците VMAT2.



FIGURE 1 Selected pre-synaptic neurotransmitter metabolic pathway with gene therapies in clinic and under development. Proteins known to be involved in IEM-NT are coloured yellow; those with preclinical and clinical gene therapy investigations are in bold, and type of strategies are indicated by respective icons. Dashed lines indicate intermediate metabolic steps not shown; drawings not to scale. Created with BioRender.com. 5-HIAA, 5-hydroxyindoleacetic acid; 5-HT, serotonin; 5-HTP, 5-hydroxytryptophan; AADC, aromatic l-amino acid decarboxylase; AAV, adeno-associated virus; ASO, antisense oligonucleotide; BH4, tetrahydrobiopterin; COMT, catechol-O methyl transferase; DA, dopamine; DAT, dopamine transporter; DBH, dopamine Я-hydroxylase; NHTP, dihydroneopterin triphosphate; DOPAL, 3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde; GABA, ?-aminobutyric acid; GABA-T, GABA transaminase; GAD, glutamic acid decarboxylase; GAT, GABA transporter; GHB, gamma-hydroxybutyric acid; GTP, guanosine-5'-triphosphate; HVA, homovanillic acid; l-DOPA, levodopa; MAO, monoamine oxidase; OCT3/PMAT, organic cation transporter 3/plasma membrane monoamine transporter; PLP, pyridoxal phosphate; PTP, 6-pyruvoyltetrahydropterin; PTPS, 6-pyruvoyltetrahydropterin synthase; RV, retroviral; SSA, succinic semialdehyde; SSADH, succinic semialdehyde dehydrogenase; SERT, serotonin transporter; TCA, tricarboxylic acid; TH, tyrosine hydroxylase; TPH, tryptophan hydroxylase; VIAAT, vesicular inhibitory amino acid transporter; VMAT2, vesicular monoamine transporter 2.

Пациенты с IEM-NT имеют ряд общих клинических признаков, хотя часто варьируют в отношении возраста начала заболевания, степени тяжести и реакции на лечение.7, 8 Для расстройств спектр моноаминовых NT включает неонатальную гипотонию, двигательные расстройства, такие как дистония, паркинсонизм, глазодвигательные расстройства, включая окулогирический криз (OGC), вегетативную дисфункцию и задержку развития.9-11 На магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга также наблюдаются отклонения, но они не специфичны, включая уменьшение объема мозга, замедленную миелинизацию и изменения в области водоразделов (watershed).12, 13 Ранее своевременная и точная диагностика была сложной задачей из-за необходимости проведения специальных диагностических исследований, например, анализа NT в CSF. Клинические симптомы также могут имитировать ряд неврологических заболеваний (таких как гипоксически-ишемическая энцефалопатия и церебральный паралич), что приводит к ошибочному диагнозу и задержке диагностики.7, 8 Растущая доступность методов секвенирования экзома и генома ускорила диагностику многих редких заболеваний и изменила методы выявления детей с IEM-NTs; генетическое тестирование теперь часто предшествует, а иногда и позволяет избежать необходимости анализа CSF NT.14
В зависимости от основного заболевания подходы к лечению включают использование кофакторов (например, sapropterin dihydrochloride, pyridoxine) и/или предшественников NT (например, l-DOPA, 5-гидрокситриптофана [5-HTP]).9, 15, 16 Реакция на лечение варьирует в зависимости от IEM-NT , некоторые из них излечиваются, например, низкая доза l-DOPA с ингибитором дофа-декарбоксилазы (DDC) при аутосомно-доминантном дефиците GCH1, некоторые имеют переменную реакцию, как при AADCD и дефиците TH (THD), а другие являются медицински рефрактерными, например, синдром дефицита транспортера дофамина (DTDS). 15-18 Более того, при IEM-NT которые поддаются лечению, включая некоторые нарушения BH4, разрешение симптомов и улучшение качества жизни часто связаны с ранним началом лечения.19 Таким образом, новые терапевтические подходы, такие как генотерапия, являются перспективными для устранения дефектов генов, лежащих в основе лекарственно-устойчивых форм IEM-NTs.
Генная терапия направлена на доставку генетических материалов с помощью вирусных или не вирусных носителей, называемых векторами, для устранения клеточных дисфункций, характерных для данного заболевания.20 В настоящее время Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA) и Агентство по регулированию лекарственных средств и товаров медицинского назначения (MHRA) одобрили in vivo неврологическую генотерапию, а именно Zolgensma® (onasemnogene abeparvovec) для спинальной мышечной атрофии (SMA) и Upstaza™ (eladocagene exuparvovec) для AADCD, с использованием вирусных векторов под названием адено-ассоциированный вирус (AAV).
Дикий тип (WT) AAV - это парвовирус с дефицитом репликации и одноцепочечным (ss) геномом ДНК размером 4,7 килобаз (kb); рекомбинантные векторы AAV (rAAV) сохраняют только инвертированные терминальные повторы, которые участвуют в упаковке вектора, трансдукции и экспрессии трансгенов21, 22 Самокомплементарный AAV (scAAV) обходит ограничивающий скорость синтез второй нити, тем самым достигая более раннего и высокого уровня экспрессии трансгена21, но вызывает более высокий иммунный ответ, чем ssAAV у мышей.23, 24 Различные комбинации капсида AAV, регуляторных элементов (RE), таких как промоторы и способ доставки, используются в зависимости от желаемого профиля экспрессии.25 Как правило, серотип капсида определяет тропизм тканей благодаря распознаванию специфических рецепторов клеточной поверхности, затем происходит интернализация частиц, выход из эндосом, разворачивание и последующая транскрипция трансгена.21, 26 Инженерия капсида, путем рационального дизайна, реконструкции предковой последовательности или направленной эволюции путем перетасовки ДНК, может еще больше улучшить трансдукцию, специфичность и специфический для ЦНС аксональный ретроградный и/или антероградный транспорт.26, 27 Многие новые капсиды проходят клинические испытания, например, AAV-LK03 (тропный к печени,28 для гемофилии А (NCT03003533)29) и Anc80 (нацеленный на печень, мышцы и сетчатку глаза,30 при болезни Вильсона [NCT04537377]). Включение цис-действующего RE может дополнительно определить специфичность трансгена и уровень экспрессии.21, 26 В большинстве конструкций для генотерапии, применяемых в клинических испытаниях, используются вездесущие промоторы, такие как от цитомегаловируса (CMV) и гибридный промотор CMV immediate-early enhancer/куриный β-актин (CAG).31 Это дает дополнительные преимущества, если продукты трансгена могут секретироваться для перекрестной коррекции, например, при лизосомных заболеваниях хранения.32 Тканеспецифичные промоторы могут потенциально ограничить вне-целевую экспрессию и связанные с ней токсические эффекты25; индуцибельные33 и зависящие от активности34 промоторы находятся в разработке, но пока не нашли клинического применения. Недавние исследования на грызунах и не-человекообразных приматах (NHP) показали, что взаимодействие капсид-промоторов может также влиять на селективность клеточного типа35, 36 Другие RE, включая интрон, сигнал полиаденилирования (polyA) и пост-транскрипционный регуляторный элемент (WPRE) вируса гепатита глухаря, повышают уровень экспрессии трансгена, способствуя стабильности мРНК и/или ядерному экспорту,37 тогда как вставка сайтов связывания тканевых или клеточно-специфических микроРНК на 3' конце может регулировать уровень транскрипта трансгена,38 и предотвращает избыточную экспрессию трансгена у мышей.39 Способ доставки является еще одним важным моментом для получения желаемого профиля биораспределения и безопасности вектора. При заболеваниях ЦНС прямая паренхимная доставка является довольно инвазивной и может привести к очаговой или широкой трансдукции; последнее достижимо при ретроградном/антероградном транспорте благодаря обширной связности таких областей, как путамен и таламус.40 В качестве альтернативы, интрацеребровентрикулярным (ICV), интрацистернальным и интратекальным (IT) инъекциям используют поток CSF для распространения, что приводит к трансдукции в спинном и головном мозге с некоторой периферической "утечкой".41 Внутривенная (IV) доставка возможна для некоторых серотипов (например, AAV9, rh8, rh10), которые могут преодолевать гематоэнцефалический барьер; однако опасения по поводу больших доз, системной генотоксичности и иммуногенности могут заставить использовать альтернативные пути.42 Также возможна двойная доставка, например, интраталамическая (ITH) и IT доставка у пациентов с ганглиозидозом GM2.43
Одна из первых генных терапий, связанных с NT, была проведена для лечения болезни Паркинсона (PD), что позволило получить важные клинические данные, имеющие отношение к разработке генотерапии для IEM-NTs. PD - это нейродегенеративное заболевание, для которого в настоящее время не существует терапии, модифицирующей болезнь; симптоматическое улучшение от l-DOPA уменьшается по мере прогрессирования PD.44 Различные стратегии генотерапии были подробно рассмотрены в других источниках.45, 46 Особый интерес представляет интрапаренхимальная доставка ферментов синтеза DA (AADC, с или без TH и гуанозинтрифосфат циклогидролазы 1 [GTPCH, ограничивающей скорость синтеза BH4]),47-54 и GABA (декарбоксилаза глутаминовой кислоты 65 и 67 [превращает глутамат в GABA]),55-57 которые в целом хорошо переносились в клинических испытаниях. Общие нежелательные явления в испытаниях DA включали дискинезию, связанную с лечением, и события, связанные с хирургическим вмешательством. В исследовании фазы 2 rAAV2-AADC (NCT03562494), в котором использовался более высокий объем инфузии - 1800 мкл/путамен58 , наблюдались аномалии Т2 МРТ, в связи с чем исследование было приостановлено, а сотрудничество со спонсором было прекращено в 2021 году59.
Учитывая клинические прецеденты генотерапии НТ, разработанной для лечения PD, понимание дизайна вектора, дозировки, способов доставки, безопасности, переносимости и трансдукции нейронных путей является ценным для разработки генотерапии для IEM-NT в клинике.60 Недавние одобрения EMA и MHRA препарата Upstaza™ для лечения AADCD и рекомендации Национального института здоровья и совершенствования медицинской помощи (HST26) еще больше проложили путь для разработки и трансляции этих методов терапии, модифицирующих заболевание. Здесь мы приводим краткое описание доклинических и клинических исследований генотерапии для IEM-NT (рис. 2) и обсуждаем потенциальные будущие проблемы в области клинической трансляции.



FIGURE 2 Summary of clinical and preclinical advanced therapeutics for IEM-NT. 3'-UTR, 3'-untranslated region; AADCD, aromatic l-amino acid decarboxylase deficiency; AAV, adeno-associated virus; ASO, antisense oligonucleotide; CMV, cytomegalovirus enhancer/promoter; DTDS, dopamine transporter deficiency syndrome; hAADC, human aromatic l-amino acid decarboxylase; hBG, human Я-globin; hBG2/3, human Я-globin partial intron 2/partial exon 3; hGHpA, human growth hormone polyadenylation signal; ICV, intracerebroventricular; IP, intraperitoneal; IT, intrathecal; IV, intravenous; N.D., not disclosed; PTPSD, pyruvoyltetrahydropterin synthase deficiency; RE, regulatory elements; RO, retro-orbital; RV, retroviral; SLC6A1, SLC6A1-related disorder (GABA transporter 1-related myotonic-astatic epilepsy); SN, substantia nigra; SNpc, substantia nigra pars compacta; SSADHD, succinic semialdehyde dehydrogenase deficiency; SV40pA, simian virus 40 early polyadenylation signal; vg, vector genomes; VTA, ventral tegmental area.

2 GENE THERAPY FOR MONOAMINE NT DISORDERS
2.1 AADC deficiency


AADCD (OMIM #608643) - редкое расстройство нервного развития, характеризующееся нарушением синтеза DA и 5-HT вследствие биаллельных мутаций в гене DDC (7p12.2). Синтез норадреналина и адреналина также нарушен, так как они находятся ниже по течению от DA; поэтому типичные маркеры CSF включают низкий уровень DA, 5-HT и метаболитов норадреналина, а именно гомованилиновой кислоты (HVA), 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA) и 3-метокси-4-гидроксифенилгликоля, наряду с высоким уровнем предшественников l-DOPA и 5-HTP.61 На сегодняшний день опубликованы данные о 120 пациентах; 80% случаев классифицируются как тяжелые, при этом пациенты обычно появляются в первые месяцы жизни с гипотонией, OGC и задержкой развития.16, 62 Также наблюдаются вегетативные дисфункции, такие как повышенное потоотделение и нарушения сна, двигательные нарушения, например, дистония, и церебральная атрофия на МРТ головного мозга.16, 62, 63 Более высокая распространенность в Тайване объясняется вариантом основателя c.714 +4A>T (IVS6+4A>T), а гомозиготные пациенты проявляют тяжелые фенотипы, с выраженными двигательными нарушениями, застоем веса и повышенным риском преждевременной смерти.64 Существующие методы лечения, включая агонисты DA, ингибиторы моноаминоксидазы, витамин B6 и тонизирующие средства, такие как бензодиазепины, имеют ограниченную пользу, а побочные эффекты встречаются часто.62
Терапия с использованием гена rAAV2, направленная на путамен или средний мозг, была опробована на пациентах с AADCD. Upstaza™, одобренный EMA и MHRA для лечения тяжелой формы AADCD в возрасте 18 месяцев и старше, вводится в виде двусторонней интрапутаминной инфузии (3 мкл/мин, 80 мкл/сайт, 2 сайта/полушарие) в общей дозе 1,8 x 1011 vg.65 Конструкция содержит кДНК AADC, промотор CMV, частичный интрон 2/частичный экзон 3 человеческого β-глобина и полиА вируса симуляции 40 (SV40). Путаминовая мишень была выбрана из-за ее доступности, дефицита DA в стриатуме, связи в сети кортико-базальных ганглиев и профилей безопасности, полученных в ходе испытаний AADC в области PD.66 В исследованиях из сострадания67 , в фазе 1/268 и фазе 2b69 приняли участие 21 пациент (возраст 1,7-8,5 лет) в дозе 1. 8 х 1011 vg, продемонстрировав непрерывное улучшение первичных конечных точек развития грубой и мелкой моторики (Peabody Developmental Motor Scales-Second Edition [PDMS-2]), значительное улучшение двигательных показателей (Alberta Infant Motor Scale [AIMS]), когнитивных функций, языковых навыков и активности AADC в путамене, измеренной с помощью PET-сканирования с F-DOPA18, в течение 5 лет после лечения69. Достижение основных показателей, таких как контроль головы и сидение без опоры, происходило постепенно: 44% и 20% в 1 год и 75% и 67% в 5 лет, соответственно.70 Также сообщалось о снижении частоты OGC, повышении уровня HVA в CSF (но не 5-HIAA), улучшении набора веса, вегетативных (потоотделение) и серотонинергических (настроение) симптомов через 1 год после лечения.67-69 В исследовании фазы 2b не было достигнуто значительной разницы в отношении PDMS-2 при более высокой дозировке 2,4 х 1011vg; напротив, более раннее лечение значительно коррелировало с более высокими баллами PDMS-2 и улучшением микроструктуры белого вещества на МРТ.69, 71 Три пациента, способные ходить без посторонней помощи после лечения, также были пролечены рано, к 4,2 годам.69 Нежелательные явления включают хирургические осложнения, пирексию, преходящую дискинезию мышц лица и конечностей, возможно, вызванную ранней гиперчувствительностью DA-рецепторов. Дискинезия началась в течение 3 месяцев после начала лечения, снималась risperidone и прошла к 10 месяцам; тяжесть и продолжительность коррелировали с возрастом пациентов, а не с дозировкой.69 Недавно сообщалось об улучшении двигательных и не двигательных функций через 1 год после лечения у двух пожилых пациентов (лечившихся в возрасте более 10 лет) с тяжелой формой AADCD, с улучшением путаминного поглощения 18F-DOPA по сравнению с исходным уровнем.72
Аналогичные результаты были показаны в японском исследовании фазы 1/2 rAAV2, также с использованием промотора CMV, в котором у пациентов с тяжелой формой AADCD была выявлена значительная активность путаминовых AADC с помощью PET, улучшение двигательных функций (AIMS) и сокращение продолжительности OGC до 2 лет после генной терапии.73 Генотерапия проводилась в более высокой концентрации (т.е. меньший объем инфузии - 50 мкл/сайт, при аналогичной общей дозе 2х 1011 vg). Наблюдалась изменчивая реакция на уровень HVA в CSF и когнитивные способности; преходящая орофациальная дискинезия и хореические движения наблюдались у всех шести пациентов, достигая пика в течение 2 месяцев и уменьшаясь к 6 месяцам.73 Дальнейший анализ показал, что после генотерапии поглощение тирозинового трассера в PET значительно увеличилось в путамене и substantia nigra (SN) и было связано с улучшением грубой моторики через восстановление префронтальной кортико-путаминовой сети.74 Лечение двух пациентов с умеренным AADCD в возрасте 4 и 12 лет, соответственно, привело к улучшению показателей AIMS, но улучшение показателей коэффициента развития наблюдалось только у пациента, прошедшего более раннее лечение75.
В отличие от PD, структуры среднего мозга при AADCD, как известно, не дегенерируют.76 Поэтому другой подход заключается в прямой доставке rAAV2-AADC в средний мозг, в частности в нейроны DA в SNpc и ventral tegmental area (VTA), чтобы устранить дефицит DA в nigrostriatal и других дофаминергических путях.77 В исследовании 1 фазы (NCT02852213), также проводимом под контролем промотора CMV, семь пациентов (в возрасте 4-9 лет) получали лечение в общей дозе 1,3 или 4,2 х 1011 vg с помощью двусторонней конвексной доставки под контролем МРТ (50 мкл в SNpc и 30 мкл в VTA/полушарие). Было достигнуто 80-процентное покрытие обеих областей; PET-сканирование с 18F-ДОФА показало увеличение активности AADC в среднем мозге и стриатуме через 3 и 24 месяца, что, вероятно, связано с антероградным аксональным транспортом вектора и белка AADC. Примечательно, что полное и устойчивое устранение OGC произошло в течение 9-33 дней у 5 пациентов; 6 (86%) пациентов обрели контроль над головой, а 4 (57%) смогли самостоятельно сидеть к 12 месяцам. У всех пяти пациентов, наблюдавшихся до 18 месяцев, было достигнуто клинически значимое улучшение двигательных показателей (Gross Motor Function Measure; GMFM-88), уменьшение раздражительности и бессонницы. Как и в предыдущих исследованиях, через 3-4 недели после лечения у всех пациентов наблюдалось улучшение уровня HVA в CSF (но не 5-HIAA) и преходящая дискинезия. В текущем исследовании по эскалации дозы оценивался больший объем (до 300 мкл, 1 инфузия на полушарие, между SNpc и VTA) и доза до 1,5 х 1012 vg, а возраст пациентов варьировал от 4 до 27 лет.78, 79
Недавно в Китае было начато раннее исследование 1 фазы с доставкой AAV9-AADC (VGN-R09b) в билатеральный путамен (NCT05765981).80 В исследование набирают детей в возрасте от 2 до 8 лет с гомозиготной или сложной гетерозиготной миссенс IVS6+4A>T и исходным уровнем моторного развития менее 3 месяцев. Показателями результата являются нежелательные явления и моторное развитие в 1 год. Информация о дозировке и конструкции не предоставлена.
Наконец, поскольку основательный вариант c.714+4A>T приводит к аберрантному сплайсингу и производит преждевременный стоп-кодон из псевдоэкзонического +38 криптического сайта сплайсинга,64 то стратегия антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) была протестирована in vitro для восстановления нормального сплайсинга мРНК.81 ASO связываются с целевой мРНК через сопряжение оснований Уотсона-Крика, и модулируют сплайсинг через пре-стерические препятствия для привлечения факторов сплайсинга.82, 83 Желаемые свойства могут быть получены путем химической модификации основы, сахарного соединения и/или нуклеозида.82, 83 При использовании фосфородиамидатного морфолиноолигомера (PMO) после 72-часовой трансфекции в лимфобластоиде, полученном от пациента, наблюдалось восстановление уровня мРНК до 41%, а также значительное увеличение уровня белка AADC и 5HT.81 Тем не менее, возникли две новые вне-рамочные изоформы, что указывает на необходимость доработки и/или использования комбинированных ASO для обеспечения соответствующего сплайсинга, чтобы минимизировать риск вне-целевых эффектов.
2.2 Pyruvoyltetrahydropterin synthase deficiency


Пирувойлтетрагидроптерин синтаза (PTPS) является вторым этапом синтеза BH4 из GTP.84 Это наиболее распространенное нарушение BH4, выявляемое при скрининге новорожденных (из-за наличия гиперфенилаланинемии). Дефицит синтазы пирувоилтетрагидроптерина (PTPSD) (OMIM #261140) имеет широкий фенотипический спектр и может быть биохимически охарактеризован как легкая и тяжелая формы со снижением уровня HVA и 5-HIAA, что обычно требует добавок BH4 и предшественников NT с переменным ответом.15, 85 Было идентифицировано 99 аутосомно-рецессивных вариантов гена PTS, расположенного в 11q22.3-23.3, включая 115 миссенс и 26 сплайс замен; известно, что белковые структуры, в частности, область связывания BH4 активного сайта, нарушены.86, 87 Для устранения генетического дефекта в фибробластах пациентов были оценены ретровирусная (RV) передача гена и две стратегии ASO. У пациентов с PTPSD наблюдается низкий уровень biopterin и высокий neopterin; после трансфекции RV на основе вируса мышиного лейкоза Молони (MLV) активность фермента PTPS и тенденция к нормализации птерина наблюдались во всех трех линиях фибробластов пациентов.88 Однако потенциальной проблемой трансдукции является то, что векторы MLV неэффективны при трансдукции медленно или не-делящихся клеток, а также имеются опасения относительно инсерционного мутагенеза.89 Варианты сайтов сплайсинга могут приводить к аберрантному включению интронов (псевдоэкзоны), что опосредовано такими механизмами, как новый 5' или 3' сайт сплайсинга и влияние на усилитель сплайсинга/сайленсер.90 Поэтому блокирование с помощью ASO этих криптических сайтов сплайсинга может способствовать экспрессии более функциональных белков.83 В двух подходах использовались различные химические составы ASO, в частности PMO91 и 2'-O-метилфосфоротиоат,92 чтобы блокировать привлечение факторов сплайсинга для производства патогенных псевдоэкзонов. ASO, нацеленные на сайт сплайсинга, смогли спасти три глубокие интронные мутации, которые обычно приводят к дополнительным аминокислотным вставкам, преждевременному окончанию и сдвигу рамки считывания,93 в фибробластах пациентов на уровне мРНК и белка.91 Дальнейшее исследование другого варианта интрона 2 показало, что те же ASO могут быть использованы в вариантах, затрагивающих один и тот же регион, например, общий сайт сплайсинга или регуляторные связывающие мотивы.92
3. NT TRANSPORT
3.1 Dopamine transporter deficiency syndrome


DAT играет важную роль в регуляции нейротрансмиссии DA путем повторного всасывания внеклеточного DA в дофаминергические нейроны среднего мозга (mDA), тем самым регулируя возбудимость mDA.94 DAT принадлежит к семейству переносчиков растворов (SLC) 6 и совместно переносит Na+ и Cl- по электрохимическим градиентам, чтобы стимулировать транслокацию DA против градиента концентрации через чередование доступа.95, 96 Варианты гена были связаны с PD, синдромом дефицита внимания и гиперактивности, аутизмом и нейропсихиатрическими расстройствами.97-99 DTDS (OMIM #613135) возникает в результате биаллельных мутаций потери функции в SLC6A3. Классический DTDS - это прогрессирующее двигательное расстройство с младенческим началом, симптомы которого включают гиперкинезию, оролингвальную дискинезию, паркинсонизм-дистонию и глазное дрожание; также встречаются атипичные ювенильные и взрослые формы с менее агрессивным течением заболевания и более высокой остаточной функцией DAT.18, 100, 101 У двух атипичных взрослых пациентов были обнаружены признаки нейродегенерации по данным DAT-однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT).102, 103 Известен один случай, когда расстройство аутистического спектра и PD связаны с доминантно-отрицательным вариантом, выявленным с помощью секвенирования экзома.102 При DTDS потеря функции DAT приводит к экстранейрональному накоплению DA, что приводит к повышению уровня HVA в CSF, но к нормальной концентрации 5-HIAA.101 У пациентов наблюдается незначительный эффект от фармакологического лечения101; хотя фармакошапероны потенциально могут исправить связанные с мутацией дефекты сворачивания белка и экспрессии на поверхности DAT,104 такие подходы специфичны для мутации, в отличие от стратегии генного дополнения, которая может помочь более широкому спектру пациентов с DTDS.
DAT-нокаутные мыши воспроизводят основные двигательные признаки DTDS у человека, включая прогрессирующий двигательный дефицит, дискинезию, тремор и метаболические профили с высоким содержанием HVA и низким содержанием DA; у этих мышей также обнаружено сокращение продолжительности жизни с паркинсонизмом и снижение уровня TH.105-107 Стратегия двойного rAAV2/10, использующая систему Cre/LoxP (FLEX switch108) для специфической экспрессии нейронов DA, была оценена на взрослых постнатальных (P70) мышах DAT-KO.109 Вкратце, GOI (мышиный Slc6a3 или репортерный ген) в инвертированной антисмысловой ориентации был помещен в двойную инвертированную открытую рамку считывания, содержащую две пары взаимно ориентированных сайтов LoxP, управляемую вездесущим (CMV) промотором и упакован в виде первого rAAV. Второй rAAV содержит целевой клеточный/тканевой промотор (промотор нейрона DA среднего мозга, крысы TH110) для доставки Cre-рекомбиназы, которая может распознавать сайты LoxP и инвертировать последовательность GOI, обеспечивая экспрессию трансгена.109, 111 Двусторонние стереотаксические SN инъекции двух векторов, примерно по 5 х 109vg каждого, привели к экспрессии DAT и значительному улучшению уровня внеклеточного DA в стриатуме и к восстановлению TH в дорсальном стриатуме.109 Дальнейшие анализы поведения, выживаемости, тканей и метаболитов показали значительные улучшения по сравнению с нокаутами, обработанными репортерным геном, а в некоторых случаях восстановление фенотипа было сопоставимо с диким типом (WT). Несмотря на то, что этот подход стал отличным доказательством концепции генотерапии rAAV-DAT, использование мышиного транскрипта, Cre/LoxP, выведенного бактериофагом P1, и потенциальная нейротоксичность, связанная с Cre112 , ограничивают перевод в клинику.
Наша группа ранее показала, что в нейронах mDA, полученных из фибробластов пациентов с DTDS, дисфункция DAT связана с TNF-α-опосредованной апоптотической нейродегенерацией, которая не наблюдалась в сопоставимых по возрасту и изогенных линиях.113 Лентивирусная трансдукция человеческого SLC6A3 восстанавливала поглощение DA и предотвращала нейродегенерацию. Для исследования in vivo rAAV9-SLC6A3, управляемый усеченным промотором синапсина 1 (hSyn1) человека, вводили новорожденным мышам DAT-KO внутривенно в дозах 2 х 1010 и 2 х 1011 vg/pup. По сравнению с не лечеными DAT-KO, низкая доза увеличила 1-летнюю выживаемость с 41% до 100%, восстановила массу тела, локомоторное поведение, профили DA и HVA, а также возбудимость striatal нейронов. Наблюдалась широко распространенная, рострокаудальная трансдукция, без дозозависимого увеличения целевых нейронов mDA; напротив, избыточная экспрессия по всему мозгу у животных, получавших высокие дозы, привела к побочным явлениям, потребовавшим эвтаназии у 50%, реактивному астроглиозу коры, потере нейронов и вакуолизации. Поэтому для борьбы с этими наблюдаемыми вне-целевыми эффектами для лечения симптоматических DAT-KO в возрасте 4 недель использовали более ограниченную дозу rAAV2. 3-log диапазон доз (2 х 108-1010 vg/mouse) показал дозозависимое увеличение количества нейронов mDA, человеческого белка DAT, мРНК и копии генома вектора в среднем мозге, с доказательствами антероградного транспорта в стриатум. Все дозы восстановили foot fault до уровня WT, а высокая доза 2 х 1010 продемонстрировала время снижения в открытом поле и вертикальном поле, эквивалентное WT. При использовании этих доз, способа доставки и капсида не наблюдалось нейропатологии. Генотерапия для лечения DTDS недавно получила статус сиротского препарата от EMA и статус редкого педиатрического заболевания от FDA, и в настоящее время планируется проведение клинических испытаний фазы 1/2/3.114
3.2 SLC6A1-related disorder (GABA transporter 1-related myotonic-astatic epilepsy)


GABA-транспортеры (GAT)-1 и -3 являются основными GAT, которые широко экспрессируются в различных типах клеток по всему мозгу; GAT-1, кодируемый SLC6A1 на хромосоме 3, в основном локализуется в аксональных окончаниях GABA-ергических нейронов и астроцитов.115, 116 Миоклоническая astatic эпилепсия (OMIM #616421), вызванная гаплонедостаточностью SLC6A1, является энцефалопатией развития и эпилептической энцефалопатией, связанной с миоклонически-астатическими припадками и припадками отсутствия, умственной отсталостью, расстройством аутистического спектра и гипотонией в первые годы жизни.117, 118 Около 120 пациентов были опубликованы.117 Варианты с потерей функции SLC6A1 приводят к нарушению транспортировки белка и активности транспорта GABA; повышенный внеклеточный и пониженный внутриклеточный уровень GABA предположительно вызывает тоническое и фазическое торможение.119, 120 Учитывая роль GABA в развитии мозга с ранней эмбриональной стадии до зрелости,121 восстановление экспрессии GAT-1 с помощью генотерапии может быть полезнее, чем текущее симптоматическое лечение.
TSHA-103, scAAV9, управлчяющий кодон-оптимизированной копией человеческого SLC6A1, в настоящее время находится в стадии доклинической разработки компанией Taysha Gene Therapies.122 В модели гомозиготных мышей SLC6A1-KO неонатальное внутривенное введение 3 х 1011 vg/pup двух конструкций, управляемых либо вездесущим (JeT), либо специфическим для нейронов (MeP) промотором, значительно уменьшило бремя припадков. Поведенческие улучшения были отмечены только в нейрон-специфическом варианте. Кроме того, наблюдались неблагоприятные эффекты, включая более высокую смертность при использовании вездесущего промотора.123 Для перевода на клиническую основу пожилых мышей лечили IT в дозе 7-7,5 х 1011 vg/мышь, при этом экспрессия в коре головного мозга была ниже, чем у новорожденных, но хорошо переносилась в течение 1 года. Однако при лечении в возрасте P7-10 наблюдалась лишь скромная эффективность в поведенческих тестах, а в группе P28-35 улучшений не было.123 Чтобы оценить, связана ли терапевтическая эффективность с эффективностью трансдукции или более ранним вмешательством, AAV-PHP.eB, нейротропный вариант AAV9, использовали для внутривенного введения мышам P23.124 Снижение припадков не было достигнуто ни при одной из трех доз (от 2 [ 1010 до 1 [ 1012 vg/мышь). Это свидетельствует как об узком терапевтическом окне, так и о необходимости дальнейшей оптимизации экспрессии.
4 NT DEGRADATION
4.1 Succinic semialdehyde dehydrogenase deficiency


Сукциновый полуальдегид дегидрогеназа (SSADH) - системно экспрессируемый митохондриальный фермент с основной экспрессией в мозге и печени.125 У здоровых людей синаптическая GABA транспортируется в астроциты с помощью GAT, превращается в сукциновый полуальдегид с помощью GABA-трансаминазы (GABA-Т), затем окисляется в тандеме SSADH до сукцината, субстрата цикла TCA.125 При SSADHD (OMIM #271980) биаллельные мутации с потерей функции в кодирующем ALDH5A1 (6p22.3) гене приводят к цитозольному превращению янтарного полуальдегида в γ-гидроксибутират (GHB), нейромодулятор с нейротоксическими свойствами.126 Избыточное накопление GABA, GHB и других метаболитов GABA обнаруживается в мозге и биологических жидкостях, но точная патофизиология еще не выяснена125 . Клинические симптомы, включая гипотонию, задержку развития, эпилепсию, нарушения поведения и сна, проявляются в раннем детстве126 ; описана зависимость выраженности симптомов и типов припадков от возраста127. Посмертное исследование одного пациента также выявило нарушения в содержании аминокислот, фосфолипидов и НТ.128 В настоящее время не существует эффективного лечения для устранения основного дефицита и последующих метаболических последствий.
Поскольку печень также экспрессирует высокий уровень SSADH, а центральный и периферический GHB быстро уравновешиваются,125 аденовирусный подход, направленный на печень, был оценен в мышиной модели SSADH-KO.129 Эти мыши повторяют метаболические особенности, наблюдаемые у людей, но имеют более тяжелые фенотипы, с пониженной выживаемостью до ст. P26 из-за эпилептического статуса.130 Используя аденовирус первого поколения с удаленным E1, кДНК SSADH человека была доставлена под мощным промотором вируса саркомы Роуса внутрибрюшинно (IP) на ст. P10 в трех дозах (4,5 х 108, 1 х 1010, 1 х 1011 вирусных частиц [vp]) и ретро-орбитально (RO) на ст. P13 с 1 х 1011 vp.129 Увеличение выживаемости наблюдалось во всех группах лечения, больше всего на 39,3% в группе с 4,5х 108 IP. Для анализа тканей вводили разные наборы мышей и собирали ткани в разные моменты времени; через 72 ч после введения RO показал более высокую ферментативную активность печеночной SSADH (максимум ~20%), чем IP. У обработанных RO мышей также наблюдалось снижение содержания GHB в печени, мозге, почках и сыворотке, в то время как у IP оно ограничивалось только печенью. У обработанных мышей, выживших после 1 месяца, была обнаружена мРНК, но не активность фермента SSADH. Неонатальные (P0) IP-инъекции снижали уровень GHB в печени на 8 дней, но сопровождались необъяснимым повторным повышением в мозге. В целом, вектор оказался безопасным, но преходящая экспрессия, обусловленная иммуногенностью, делящейся природой гепатоцитов и нацеленностью только на печень, возможно, ограничила его эффективность - все факторы, которые необходимо учесть для будущего клинического применения.
5 DISCUSSION


Эффективное лечение редких заболеваний, в том числе IEM, требует точной диагностики и модифицирующего болезнь лечения. В случае IEM-NT только несколько заболеваний выявляются в ходе скрининга новорожденных, и часто диагностика может быть отложена. Клиническая реакция на существующие фармакотерапевтические препараты на основе малых молекул варьируется от заболевания к заболеванию, при этом некоторые данные свидетельствуют о том, что более раннее начало лечения связано с лучшими результатами при некоторых IEM.8, 19 Достижения в области секвенирования генома/экзома, транскриптомики и других дополнительных методов диагностики позволили значительно улучшить показатели диагностики пациентов с редкими заболеваниями.14 Другие возможности включают использование существующих программ скрининга новорожденных, которые либо уже приняты, либо в настоящее время проходят проверку для AADCD. В Тайване, Италии, Германии и Бразилии в настоящее время проводится оценка диагностической ценности выявления высокого уровня 3-О-метилдопы в высушенных пятнах крови с помощью масс-спектрометрии.131-134 Что касается лечения, то генотерапия, как до-клиническая, так и клиническая, оказывается перспективным подходом к модификации заболевания для многих IEM.135, 136 Другие технологии, такие как редактирование генов, с использованием таких механизмов, как нуклеазы с цинковыми пальцами и CRISPR-Cas (кластеризованные регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы-Cas-ассоциированные нуклеазы), доставляемые in vivo в виде белков в системах доставки наночастиц или нуклеиновых кислот в AAV, проходят доклинические и клинические исследования для некоторых состояний IEM.137, 138
Поскольку большинство IEM-NT являются моногенными и аутосомно-рецессивными, генотерапия AAV является привлекательным, одноразовым, модифицирующим заболевание методом лечения для многих из этих редких заболеваний. Это дает некоторые преимущества по сравнению с ASO, которые требуют многократного прямого введения в ЦНС, и позволяет избежать необходимости подбора направляющих РНК для каждой патогенной мутации при редактировании генов. Безопасность и переносимость генных терапий, связанных с НТ, у людей были оценены с точки зрения PD, а эффективность была четко продемонстрирована при AADCD положительными результатами испытаний, которые завершились для генотерапии, доставляемой через путамен67-69, 73 и средний мозг77, а Upstaza™ получит одобрение EMA и MHRA в 2022 году.
С выходом генотерапий на клиническую арену появляются новые аспекты, которые необходимо учитывать, узнавая больше о генотерапиях AAV, например, новые проблемы безопасности, оптимальное терапевтическое окно, легкость глобального доступа к лечению и то, как ориентироваться в многочисленных вариантах лечения для каждого IEM-NT. Особые опасения по поводу безопасности генотерапий AAV в ЦНС связаны с токсичностью в ганглиях дорсальных корешков , дегенерацией нейронов и аксонопатией, связанными с различными капсидами и промоторами rAAV, которые были использованы для избыточной экспрессии трансгенов в NHP.139, 140 Дозо-ассоциированная токсичность при введении ITH, при этом у NHP, получивших самую высокую дозу в 3,2 х 1012 vg вектора rAAVrh8, экспрессирующего Hexα/β наблюдалась атаксия и общая слабость в течение 2-3 недель, а к 1 месяцу потребовалась эвтаназия из-за апатии.141 На сегодняшний день клиническое значение токсичности DRG у людей еще не выяснено, при этом в ходе испытаний Zolgensma® и программы глобального доступа не сообщалось о связанных с лечением токсических эффектах DRG.142-144 Более того, жесткий контроль систем NT может подразумевать узкое терапевтическое окно дозирования (т.е. между эффективностью и токсичностью), как это было показано в нашем до-клиническом исследовании генотерапии DTDS, в котором 10-кратное увеличение дозы привело к неожиданной потере веса и двигательным нарушениям, связанным с вне-целевыми эффектами113. Тщательная калибровка дозы для достижения эффективности и минимальной токсичности может быть сложной задачей, учитывая необратимость генотерапии AAV, длительную персистенцию генома AAV (до 15 лет в NHP для PD145) и потенциальное эпигенетическое сайленсинг генома rAAV in vitro146, что еще предстоит определить в отношении пациентов-людей. Как было описано ранее, стратегии тонкой настройки экспрессии могут включать оптимизацию путей доставки, капсида, промоторов и/или RE.27
Что касается нарушений IEM-NT, мы должны признать, что NTs жизненно важны для нейрального развития, начиная с эмбриональных стадий147 , поэтому один из вопросов заключается в том, как диагностировать пациентов при самой ранней возможности и обеспечить назначение лечения в оптимальные сроки для максимальной терапевтической эффективности. Уже признано, что при дефиците BH4 более раннее лечение связано с лучшими когнитивными результатами, но неясно, можно ли полностью восстановить нормальную траекторию развития.19, 148 Аналогичным образом, испытания генотерапии AADC показали, что более молодые пациенты достигли лучших показателей двигательной активности и улучшили структуру мозга. Примечательно, что все пациенты, которые обрели способность ходить, были пролечены к возрасту ~4 лет.69, 71 При THD легкая и умеренная когнитивная задержка наблюдается у значительной части пациентов, которые в других случаях положительно реагируют на l-DOPA.17 Аномалии развития нейронов и синапсов наблюдались у выкидыша с THD уже на 16 неделе беременности.149 Кроме того, при IEM-NT затрагивающих более одной NT, как в случае с AADC, необходима тщательная оценка при выборе мишени (мишеней) для препарата генотерапии для достижения максимальной пользы для пациента. 5-HT вырабатывается в raphe ядрах по всему стволу мозга; существующие стратегии, направленные на путамен или средний мозг, возможно, не решают проблему дефицита 5-HT напрямую, поскольку метаболиты 5-HT в CSF (5-HIAA) не были существенно повышены после родов.69, 77 Хотя значительное улучшение симптомов было отмечено в опроснике, составленном по результатам опроса, 69, 77 последствия для долгосрочного ведения этих пациентов остаются неясными. Более того, взаимодействие между различными компонентами пути синтеза NT может быть изменено в состоянии болезни, при этом точные механизмы и долгосрочные последствия не до конца понятны. В качестве примера можно привести различные мышиные модели с дефицитом BH4, а именно sepiapterin reductase,150 PTPS,151 и GCH1,152 в которых наблюдалось снижение уровня белка TH, особенно в стриатуме, что повлияло на развитие фетальной цепи DA.153 Нормальный уровень TH, таким образом, представляется критическим для психомоторной функции и созревания системы DA.154 Возможно, генотерапия IEM-NT будет наиболее эффективной у молодых пациентов, что дает основания для ранней диагностики и потенциального скрининга плода/новорожденного на IEM-NT. Таким образом, более обширные исследования естественной истории этих редких расстройств будут иметь неоценимое значение при разработке новых методов лечения, чтобы лучше определить время доставки генов.
Еще одним важным моментом является доступность для пациентов; прейскурантная цена Upstaza™ составляет 3 миллиона фунтов (~3,4 миллиона евро),155 в то время как Zolgensma® для лечения СМА - 1,95 миллиона евро. Переговоры о скидках, схемы возмещения расходов и расчеты экономической эффективности, измеряемой количеством лет жизни с поправкой на качество, варьируются в зависимости от страны,156 поэтому, вероятно, следует ожидать региональных различий. Часть стоимости объясняется сложностью производства AAV GMP и последующей обработки.157 Кроме того, необходимость мониторинга до и после введения и установления долгосрочных профилей эффективности и безопасности (для Upstaza™ требуется 10 лет),65 это, вероятно, означает, что только специализированные больницы могут предоставлять такую терапию, что потенциально ограничивает более широкий доступ.
В быстро развивающемся пространстве передовых методов лечения для одного и того же заболевания будут одобрены и лицензированы несколько стратегий, как, например, в случае со SMA. Для AADCD три клинических испытания генотерапии и Upstaza™ используют различные стратегии введения генов AAV. Однако клиническое воздействие различных стратегий нацеливания на мозг, дозировок, капсидов и конструкций (с различными RE) пока не ясно. Было установлено, что восстановление DA в префронтальной кортико-путаменовой сети имеет важное значение для улучшения двигательной активности 66 , а прямое воздействие на нейроны mDA может улучшить или восстановить физиологический гомеостаз DA и потенциально защитить от вызванного DA окислительного стресса, который может возникнуть при синтезе дофамина в путамене. Кроме того, профили экспрессии варьируют в зависимости от капсида, промоторов и RE. AAV2 демонстрирует свойства антероградного транспорта с преобладанием нейрональной трансдукции, в то время как AAV9 демонстрирует как антероградный, так и ретроградный транспорт, а также нейрональную и глиальную трансдукцию.158 В клинических испытаниях AADCD (если они были раскрыты) использовались вездесущие CMV-промоторы, однако не проводилось исследований in vivo для сравнения эффективности экспрессии конструкции или других различий (Рисунок 2), что может привести к изменению уровня мРНК и стабильности. С клинической точки зрения, различный возраст включения (Upstaza™ 18 месяцев и старше, Kojima et al.73, 75 и Pearson et al.77, 79 4 года и старше, VGN-R09b80 2-8 лет), различная исходная тяжесть заболевания и относительно небольшие группы пациентов могут затруднить прямое сравнение, также как и использование различных показателей (например, PDMS-2 против GMFM-88). Со временем для пациентов будет очень полезно иметь международный стандартизированный подход от предварительного отбора до наблюдения после генотерапии, используя соответствующие регистры по конкретным заболеваниям, для консолидации клинических данных, что позволит проводить тщательную оценку лечения, особенно при таких редких заболеваниях, как IEM-NT.159
Неблагоприятные эффекты генотерапии при IEM-NT, вероятно, будут зависеть от пути (путей) NT, на который (которые) направлено воздействие. Например, для большинства пациентов с AADCD преходящая дискинезия ожидается примерно через 4 недели после терапии. Вероятно, это результат выработки DA, связанной с AAV, что приводит к потенциальной гиперчувствительности DA-рецепторов, и должно пройти по мере стабилизации гомеостаза DA.69, 73 Лечение этих дискинезий зависит от протокола испытания или местных рекомендаций и должно проводиться под наблюдением врача, имеющего опыт в этой области. Как правило, лечение следует начинать, если движения мешают рутинному уходу, функционированию, комфорту, сидению или сну. Любые агонисты DA или ингибиторы моноаминоксида могут быть сокращены и отменены, по мере необходимости.77, 159 Такие средства, как amantadine, benzodiazepines, gabapentin, clonidine или даже tetrabenazine, могут быть рассмотрены для краткосрочного лечения этих преходящих дискинезий.72, 79 Некоторым пациентам потребуется более интенсивное медицинское лечение в условиях интенсивной терапии или высокой зависимости.
В целом, благодаря быстрым инновациям в векторной технологии и лучшему пониманию патофизиологии и молекулярной диагностики, генотерапия для IEM-NT - это растущая область, которая вскоре может стать клинической реальностью для многих заболеваний. Ранняя диагностика и лечение, вероятно, будут иметь ключевое значение для IEM-NT, а доступность будет иметь решающее значение для реализации всего потенциала и клинического воздействия этих новых методов лечения в глобальном масштабе.