Подход к генотерапии талассемии направлен на достижение высокого уровня экспрессии β-/γ-глобина. В исследованиях, включенных в эту статью, рассматривалось использование генотерапии для достижения уровня экспрессии γ или β-глобина при талассемии. В нескольких исследованиях было обнаружено, что γ-глобин стабильно экспрессируется у талассемичных мышей после введения им HDAd-векторов, содержащих глобиновые гены. Исследования Wang et al.^{6, 7} показали увеличение экспрессии γ-глобина до более 80% в RBCs талассемичных мышей после трех циклов лечения HDAd.^{6, 7}

Векторные системы переноса генов HDAd включают в себя функции, позволяющие трансдукцию HSC опосредованную интеграцию генов и включение глобиновых генов. Исследование Wang et al.⁶ показало значительно лучший результат экспрессии глобина в векторе HDAd, содержащем длинную область локуса, по сравнению с HDAd, содержащим короткую область локуса. Длинная область локуса может предотвратить сайленсинг и инициировать транскрипцию встроенного гена в векторе HDAd.

Хотя увеличение процента экспрессии γ-глобина после лечения указывает на многообещающую эффективность, следует отметить, что уровень экспрессии γ-глобина достигал только 10%-15% от экспрессии α- и β-глобина взрослых мышей.^{6, 7} Поэтому пациентам с большой талассемией могут потребоваться более высокие уровни γ-глобина, чем те, которые были получены в настоящее время.

В другом исследовании Miccio et al. использовался лентивирусный вектор, содержащий ген β-глобина. В исследовании анализировалась способность GATA1-HS2, элемента активатора транскрипции, вставленного в лентивирусный вектор, усиливать экспрессию трансгена. Результаты показали, что введение лентивируса, содержащего ген β-глобина и GATA1-HS2 (G-GLOBE), увеличивало экспрессию человеческого β-глобина в селезеночных эритроидных клетках талассемичных мышей. По сравнению с лентивирусным вектором без элемента GATA1-HS2 (GLOBE), G-GLOBE показал значительное увеличение экспрессии трансгена. Анализ флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) также показал, что синтез глобина происходил в половине колоний. Данное исследование показало, что использование GATA1-HS2 может увеличить экспрессию трансгена в генотерапии с использованием лентивирусных векторов. Однако в этом исследовании не анализировался общий уровень глобина в RBCs.¹¹

Современные исследования, посвященные генотерапии талассемии, показали, что для этой модели терапии необходимо использовать векторы, способные стабильно экспрессировать повышенный уровень глобина.^{12, 13} Использование более длинной версии локусной области и энхансера может увеличить вероятность экспрессии потенциально лечебного количества глобина, как показано в исследованиях Wang et al.⁶, где использовалась более длинная локусная область, и Miccio et al.¹¹, где в качестве энхансера использовался GATA1-HS2.

Из шести исследований, включенных в данный обзор, в одном не были указаны гематологические параметры⁸ , в то время как остальные включали результаты.^{6, 7, 9-11} В этих пяти исследованиях в одном приводился только соответствующий график, но не указывался фактический подсчет параметров,¹¹ а в двух других не были указаны количество RBCs и уровень гематокрита.^{9, 10}

Исследование Wang et al.⁶ сравнивает контрольную группу, группу HDAd с коротким LCR и группу HDAd с длинным LCR (RBC: 8-10, 7-9 и 8-10 M/µL; соответственно). Исследование Wang et al.⁷ показало сравнение между контролем и группой трансдукции HSPC с количеством RBCs: 8,53 ± 0,29 и 7,1 ± 0,1 М/µл; соответственно.

В исследовании Miccio et al.¹¹ было отмечено, что гематологические параметры у Th3/+ мышей, трансплантированных HSC трансдуцированными GLOBE- и G-GLOBE, существенно не различались. Несмотря на то что в исследовании не был указан фактический подсчет гематологических параметров, в нем был представлен график результатов. Судя по графику, у мышей, которым были пересажены HSC полученные с помощью GLOBE- и G-GLOBE-трансдукции, уровень RBCs был выше по сравнению с мышами, не получавшими лечения (контроль). В то же время в трех других исследованиях количество RBCs не указывалось.^8-10

В исследовании Wang et al. не было указано точное количество, но было заявлено, что уровни Hb не различаются между контрольной и исследуемой группами наряду с WBCs, RBCs, средней корпускулярной концентрацией гемоглобина, средним корпускулярным объемом и шириной распределения RBCs (RDW-CV). Хотя точное число не было указано, исследование Wang et al.6 также показывает, что уровень Hb в группе HDAd-long-LCR значительно выше, чем в группе HDAd-short-LCR.

В исследовании Wang et al. полученные показатели составили 13,9 ± 0,63 и 9,7 ± 0,18 г/дл в контрольной и интервенционной группах, соответственно. В то же время результаты Bahal et al. составляют ~7,5, ~8,5 и ~12 г/дл (контроль, SCF + скремблированные γtcPNA4-Scr/донорские ДНК NPs и SCF + γtcPNA4/донорские ДНК NPs; соответственно). В обеих группах наблюдалась стойкая коррекция анемии у мышей с повышением уровня Hb в крови до нормального диапазона, в то время как в контрольной группе анемия не ослаьлялась⁷.

В работе Yannaki et al. значения Hb между нормальными мышами контрольной группы и Hbbth-3/+ (талассемия) составили 12,01 ± 2,24 против 7,21 ± 1,84 г/дл, соответственно. Когда обе группы получают G-CSF, показатели не спленэктомированных нормальных и Hbbth-3/+ мышей существенно не изменяются (норма: 11,34 ± 1,78 против 12,01 ± 2,24 г/дл; Hbbth-3/+: 7,21 ± 1,84 против 6,54 ± 1,84 г/дл). Однако спленэктомия у нормальных мышей вызвала анемию (без спленэктомии против спленэктомированных: 12,01 ± 2,24 против 10,53 ± 1,64). После введения G-CSF анемия у спленэктомированных нормальных мышей усугубилась (без лечения против лечения: 10,53 ± 1,64 против 9,74 ± 1,53). В то же время спленэктомия у талассемических мышей не привела к существенному изменению показателей Hb в группе без лечения и в группе, получавшей G-CSF (6,46 ± 1,10 против 6,16 ± 1,88 г/дл), Yannaki et al.¹⁰ объясняют, что это, вероятно, связано с развитием интенсивного компенсаторного кроветворения из талассемической печени.

В работе Wang et al.⁶ процент ретикулоцитов значительно отличался: 40,9% против 26,8% против 9,2% для мышей Hbbth-3/+ CD46+/+, не получавших лечения, HDAd-short-LCR- и HDAd-long-LCR-, соответственно. Это свидетельствует о лучших результатах в пользу использования вектора HDAd-long-LCR.

В исследовании Wang et al.⁷ окрашивание мазков крови на ретикулоциты показало впечатляющее снижение количества ретикулоцитов, что свидетельствует об обратном развитии талассемического фенотипа у обработанных мышей (31,13 % ± 3,17 % против 42,4 % ± 1,43 %, до и после трансдукции). В исследовании Bahal et al. анализ крови, взятой у мышей каждой группы на 36 день после лечения, показал снижение количества ретикулоцитов у мышей, получавших SCF + γtcPNA4/донорские ДНК NPs, но не у мышей, получавших пустые NPs (процент ретикулоцитов: ~2% против ~30%).

В работе Yannaki et al.¹⁰ частота ретикулоцитов у нормальных и Hbbth-3/+ мышей была схожа с уровнем Hb, у нормальных мышей не наблюдалось значительных изменений в процентном соотношении при введении G-CSF, спленэктомии или того и другого. В то же время в группе талассемических мышей во всех группах наблюдался высокий процент ретикулоцитов (нормальные нелеченые и не спленэктомированные против талассемических нелеченых и не спленэктомированных: 3,62 % ± 1,68 % против 34,98 % ± 14,67 %; табл. 1). В группе талассемии при введении G-CSF как в группе спленэктомированных, так и в группе не спленэктомированных наблюдается увеличение процентных значений (не спленэктомированные: без лечения [34,98 % ± 14,67 %] против G-CSF [50,17 % ± 20,26 %]; спленэктомированные: без лечения [35,83 % ± 4,92 %] против G-CSF [43,7 % ± 17,01 %]), что свидетельствует об интенсивной кроветворной активности.

В исследовании Miccio et al.¹¹ на основании графика видно, что у мышей, которым были пересажены HSC трансдуцированные GLOBE и G-GLOBE, процент ретикулоцитов был ниже по сравнению с контрольной группой (~25% против ~13%).

В исследовании Wang et al.⁶ уровень HCT был выше в группе, получавшей HDAd-long-LCR, по сравнению с группой, получавшей HDAd-short-LCR, что еще раз подтверждает эффективность вектора. вэж В исследовании Wang et al.7 уровень HCT значительно повысился после трансдукции (до и после: 41,3 % ± 0,81 % против 30,7 % ± 0,46 %) и был неотличим от уровня в группе нормальных мышей.

В исследовании Miccio et al.¹¹ параметры HCT существенно не отличались у Th3/+ мышей, трансплантированных GLOBE- и G-GLOBE-трансдуцированными HSC хотя в исследовании не был указан фактический подсчет уровней HCT, но соответствующий график результатов показал достаточно данных, подтверждающих этот результат.

Во всех пяти исследованиях, в которых приводились гематологические показатели, даже при различных вмешательствах были получены либо неотличимые уровни по сравнению с контрольной группой нормальных мышей, либо более близкие к нормальным уровни по сравнению с группой талассемии, не получавшей лечения.

Морфология нормальных RBCs имеет дисковидную форму с бледностью в центре и нормоцитарную форму.¹⁴ Следовательно, терапия считается успешной, если группа вмешательства имеет характеристики, сходные с нормальными. Поэтому фенотип RBCs включен в наши исследования как один из параметров. Здесь сравнение будет проводиться качественно.

Из шести исследований только в трех фенотип был одним из параметров.^{6, 7, 9} В исследовании Wang et al. сравнивались три различные группы, состоящие из контроля и вмешательства, с использованием векторов HDAd-long-LCR и HDAd-short-LCR. Векторы HDAd-LCR состоят из векторов HDAd5/35++ с дополнительными элементами, добавленными для максимизации экспрессии гена глобина, поэтому они получили название HDAd-long-LCR. В исходных эритроцитах наблюдались гипохромные, сильно фрагментированные и анизопойкилоцитозные эритроциты. После 16 недель терапии в группе мышей, получавших лечение, наблюдалось изменение талассемического фенотипа: в ней появились нормоцитарные и хорошо сформированные RBCs. По сравнению с контрольной группой, состоящей из CD46tg мышей, модель талассемических мышей, на которых воздействовали вектором HDAd-long-LCR, состоящая из Hbbth-3/+/CD46 мышей, показала сходные результаты, такие как нормальное распределение клеток костного мозга. В эритроидных линиях преобладают полихроматические и ортохроматические эритробласты, что свидетельствует об успешном созревании эритроидов.⁶ Это согласуется с результатами других исследований, согласно которым проэритробласты мышей претерпевают три митоза, что приводит к увеличению соотношения полихроматических и ортохроматических эритробластов.¹⁵ Между тем, в модели талассемических мышей, на которых применялись векторы HDAd-short-LCR, наблюдалось преобладание эритроидной линии, состоящей из проэритробластов и базофильных эритробластов.6 Позже базофильные эритробласты дифференцируются в полихроматические и ортохроматические эритробласты.16 Это может указывать на то, что дифференцировка HDAd-short-LCR происходит медленнее или блокируется, чем HDAd-long-LCR. Оба вмешательства с использованием векторов были сопоставимы с контрольной группой со значительными различиями до и после лечения. Исследование Wang et al.⁷ показало схожие результаты, так как они также обнаружили изменение фенотипа талассемии от гипохромии, анизопойкилоцитоза и фрагментации клеток до почти нормохромных и хорошо сформированных RBCs после 6 недель лечения O6BG/BCNU у CD46+/+/Hbbth-3/+ мышей с использованием векторов HDAd5/35++. Аналогичные результаты были получены в исследовании, проведенном Bahal et al.⁹ Улучшение талассемического фенотипа, такого как микроцитоз, было обнаружено у мышей, обработанных γtcPNA4/донорской ДНК и SCF, с улучшением пойкилоцитоза и уменьшением анизоцитоза, овалоцитоза и клеток-мишеней через 36 недель после последнего лечения. В отличие от других групп, у мышей, получавших γtcPNA4/донорскую ДНК, наблюдалось улучшение морфологии RBCs. В то же время в контрольной и нелеченой группах не наблюдалось ни улучшения анемии, ни уменьшения выраженности пойкилоцитоза, клеток-мишеней, колец Кабота, анизохромазии и овалоцитоза.

Несмотря на различные вмешательства, эти три исследования дали схожие результаты, продемонстрировав улучшение фенотипических параметров. В двух исследованиях, проведенных Вангом и др.^{6, 7}, использовались лентивирусные векторы HDAd5/35++. Этот хорошо известный стабильный инструмент переноса генов широко используется для генотерапии, хотя и имеет ограниченный размер вставки. Wang et al.^{6, 17} использовали HDAd-long-LCR для максимальной экспрессии гена γ-глобина, чтобы сбалансировать количество цепей α-глобина и тем самым облегчить течение талассемии.¹⁷ Дисбаланс α-глобина и не-α-глобина может блокировать дифференцировку и созревание эритробластов, что может быть связано со стадиями дифференцировки, наблюдаемыми в HDAd-long-LCR и HDAd-short-LCR.¹⁸ Используя тот же тип вектора, Wang et al. использовали O6BG/BCNU в качестве дополнительной терапии для поддержания γ-глобин+ RBCs. В отличие от мышей, получавших HDAd5/35++ и O6BG/BCNU, у мышей, не получавших эту терапию, преобладали проэритробласты и базофильные эритробласты, что указывает на блокировку созревания эритроидов, что может быть связано с недостаточным количеством γ-глобина для поддержания баланса α-глобина.^{7, 18} Утверждается, что в группе, получавшей только HDAd5/35++, не было достаточного улучшения морфологии эритроцитов, это указывает на то, что HDAd5/35++ и O6BG/BCNU превосходят по улучшению морфологии эритроцитов.⁷ Это связано с недостаточным количеством γ-глобина+ у мышей, получавших HDAd5/35++ без O6BG/BCNU. Между тем, в исследовании Бахала и др.⁹ наночастицы γtcPNA4/донорская ДНК и SCF-обработка оказались лучше, чем пустые наночастицы, только SCF и γtcPNA4-scr/донорская ДНК плюс SCF. Усиленное редактирование генов in vivo с помощью γPNA под действием SCF благодаря повышенной мобилизации HSC и эффективной доставке γPNA наночастицами увеличило восстановление ДНК.¹⁹ Таким образом, восстановленная ДНК улучшила фенотип заболевания, вызванный пойкилоцитозом, анизоцитозом и клетками-мишенями, улучшив морфологию RBCs. Это улучшение показывает, что осаждение глобина уменьшилось благодаря успешному восстановлению ДНК.⁹ Положительные результаты были показаны в трех исследованиях, что может стать потенциальным методом лечения для будущих исследований, особенно на людях. Однако в этих исследованиях использовались разные виды мышей, поэтому для получения дальнейших выводов необходимо провести дополнительные исследования на одном и том же образце.

Эти исследования включают в себя различные варианты лечения талассемии. И Wang et al.⁶, и Ma et al.⁸ успешно повысили уровень экспрессии бета-глобина. Wang et al.⁶ ввели LCR бета-глобина в вектор HDAd5/35++, что значительно увеличило экспрессию β-глобина в периферических резус-цитах. По данным Ma и др.⁸ Анализ влияния их вмешательства на уровень γ-глобина, проведенный Wang и др.⁷, напротив, показал, что его уровень составляет 10-15% от уровня α- и β-глобина взрослых мышей и 25% от уровня β-минорного глобина мышей. Сконцентрировавшись на внесении специфической мутации в ген бета-глобина, Bahal и др.⁹ смогли добиться 3,4 % мутаций в месте IVS2-654. Элемент GATA1-HS2 был добавлен Miccio et al.¹¹ для улучшения репарации β-талассемии. По сравнению с этим, Yannaki et al.¹⁰ предложили ограниченные данные о результатах, касающиеся использования рекомбинантного человеческого G-CSF.

Эти исследования освещают различные вмешательства и результаты скрининга на β-талассемию. Wang et al.⁶ и Ma et al.⁸ наблюдали более высокий уровень экспрессии β-глобина, в то время как Wang et al.⁷ исследовали влияние концентрации γ-глобина. Bahal et al.⁹ сообщили о специфических мутациях гена β-глобина, а Miccio et al.¹⁰ усилили коррекцию β-талассемии с помощью элемента GATA1-HS2. Yannaki и др.¹¹ представили ограниченный обзор результатов.

Среди изученных вмешательств Wang et al.⁶ достигли значительных уровней экспрессии β-глобина с помощью векторов HDAd5/35++, содержащих LCR β-глобина, показав тем самым свою перспективность. В отличие от этого, Wang et al.⁷, в частности, исследовали уровень γ-глобина, что позволило получить ценные сведения о его модуляции. Bahal и др.⁸ сосредоточились на введении специфических мутаций в гене β-глобина, предложив возможные механизмы регуляции гена. Miccio et al.¹¹ усилили β-талассемию с помощью элемента GATA1-HS2, показав многообещающие результаты, хотя необходимы дальнейшие долгосрочные исследования безопасности. Примечательно, что особенности применения препарата в исследовании Yannaki et al.¹⁰ остаются неясными, данные по-прежнему ограничены. Ma et al.⁸ сообщили о значительном увеличении экспрессии HbF, что имеет отношение к повышению уровня Hb у плода, однако долгосрочные последствия и безопасность требуют углубленного изучения. Выбор наиболее подходящего вмешательства зависит от конкретного изучаемого аспекта β-талассемии и предполагаемого клинического результата, а решение определяет его необходимость: всесторонние сравнительные исследования на животных моделях и у людей, акцент на исследованиях безопасности и всесторонние клинические испытания для получения положительных данных.

Сравнительные исследования безопасности очень важны, особенно при изучении вмешательств в сложные медицинские состояния, такие как талассемия. В исследовании Wang et al., посвященном генотерапии HSC in vivo, тщательно оценивались меры предосторожности. Их тщательная стратегия включала трансдукцию HSC in vivo с помощью HDAd-γ-глобина/mgmt в сочетании с HDAd-SB, а затем отбор O6-BG/BCNU in vivo. Примечательно, что эта процедура не вызывала лейкемических состояний, однако это было не совсем понятно. Хотя после лечения общее количество лейкоцитов снизилось, все показатели крови оставались в пределах нормы, что свидетельствует о контролируемом циторедуктивном эффекте. Это комплексное исследование безопасности подчеркивает тщательный и систематический подход, который подтвердил результаты данного исследования.⁷

В отличие от этого, Yannaki et al.¹⁰ исследовали мобилизацию HSC в талассемической мышиной модели, получавшей G-CSF. Их меры предосторожности выявили некоторые побочные эффекты, в частности спленомегалию у 65 % свиней, увеличение печени у 19,7 % и кровотечения у 12,5 % пациентов. Эти данные подчеркивают необходимость осторожности в отношении побочных эффектов и потенциальных осложнений при проведении вмешательств на животных моделях.

В частности, это сравнительное исследование выявило различия в безопасности между двумя исследованиями. Wang et al.⁷ продемонстрировали относительно безопасные результаты своего вмешательства, в то время как Yannaki et al.¹⁰ столкнулись с заметной проблемой безопасности. Эти результаты подчеркивают важность обеспечения безопасности при проведении вмешательств при таких заболеваниях, как β-талассемия.^{7, 10}

При оценке исследований, в которых сравниваются вмешательства на животных моделях β-талассемии, очень важно признать различные потенциальные ошибки и ограничения. Во-первых, различия в экспериментальном дизайне, вариациях моделей животных, методах введения и стандартах исследования могут создать проблемы для получения окончательных выводов об эффективности различных вмешательств.

Кроме того, опора на животные модели может недостаточно полно отражать сложную природу человеческой β-талассемии, что ставит под сомнение возможность переноса полученных результатов в клиническую практику. Длительные пробелы в данных некоторых исследований ограничивают наше понимание долговечности и безопасности этих вмешательств. Кроме того, предвзятое отношение к публикациям, когда положительные результаты чаще публикуются, может подорвать консенсус относительно успешности вмешательства и потенциально скрыть более негативные результаты.

Этические аспекты благополучия животных и перенос их результатов в испытания на людях также поднимают важные этические дилеммы, которые необходимо тщательно отслеживать. Наконец, потенциальная возможность и взаимоисключаемость, особенно когда исследователи имеют финансовые связи с определенными вмешательствами или методами лечения, требуют прозрачности для обеспечения достоверности исследования.

Несмотря на то, что эти исследования дают ценные сведения о вмешательствах при β-талассемии, вариабельность дизайна испытаний, подверженность интерпретации, предвзятость публикаций, этические соображения, а также потенциальный конфликт интересов препятствуют проведению сравнительных исследований.

Дальнейшие исследования, направленные на повышение эффективности изучения β-талассемии, должны быть сосредоточены на существующих пробелах и проблемах, связанных со сравнением вмешательств на животных моделях. Для того чтобы сделать значимые сравнения и облегчить их размер, исследователи должны установить официальные процедуры и руководящие принципы отчетности, обеспечивающие сбор и регулярное представление данных. Продольная оценка вмешательств необходима для определения их долговечности и безопасности, что повышает их клиническую применимость. Кроме того, важно преодолеть разрыв между моделями на животных и испытаниями на людях, чтобы успешно перенести полученные результаты в клиническую практику.

Разнообразие животных, страдающих талассемией, следует рассматривать как показатель генетических различий заболевания, что дает более широкое представление о качестве вмешательства. Исследователи также должны активно бороться с предвзятостью публикаций, пропагандируя как положительные, так и отрицательные результаты, и обеспечивая прозрачность результатов исследований. Этические соображения, включая благополучие животных и ответственную трансляционную практику, должны играть важную роль в разработке и проведении исследований. Кроме того, для поддержания доверия к исследованиям важно четко раскрывать потенциальные конфликты интересов, в частности финансовые отношения с компаниями, участвующими в клинических разработках.

В заключение следует отметить, что совместные усилия исследователей, институтов и фармацевтических компаний могут ускорить прогресс в области изучения β-талассемии. Интеграция ресурсов и знаний является ключом к ускорению разработки безопасных и эффективных вмешательств, тем самым облегчая переход от доклинических стадий к клиническому применению. Выработка рекомендаций в этом отношении может помочь преодолеть существующие ограничения.

Наши результаты исследований генотерапии талассемии с использованием HSC свидетельствуют о значительном улучшении уровня и фенотипа β-глобина. Наблюдается экспрессия генов у талассемичных мышей. Также происходит созревание эритроидов, что знаменует улучшение параметров фенотипа. Гематологические показатели у контрольных мышей по сравнению с талассемичными мышами неотличимы. Также наблюдалось положительное фенотипическое улучшение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что инъекционные методы введения HSC обладают хорошей эффективностью в генотерапии талассемии на мышиных моделях. Кроме того, в дальнейших исследованиях необходимо изучить их на человеческой модели.