UCDs проявляются острой гипераммонемией, которая при отсутствии быстрого лечения приводит к неврологическим последствиям и/или смерти. Некоторые UCDs имеют фенотипические особенности с вовлечением вне-печеночных органов и клиническими проявлениями, которые не могут быть адекватно устранены только с помощью генотерапии, нацеленной на печень.

Иногда у пациентов с UCDs наблюдается фиброз печени^25-27 и редко цирроз.^{28, 29} Основная патофизиология изучена недостаточно хорошо, а в контексте генотерапии фиброз печени, вероятно, снижает эффективность трансдукции в гепатоциты и потенциально ухудшает биораспределение в паренхиме печени.

Дефицит ASL проявляется системным фенотипом с высокой частотой осложнений со стороны печени (гепатит, гепатомегалия, фиброз, накопление гликогена), неврологической заболеваемостью (задержка развития, эпилепсия, двигательные расстройства), артериальной гипертензией, хроническими желудочно-кишечными и почечными симптомами, гипертриглицеридемией.^{7, 30} Патофизиология, вероятно, многофакторная, вызванная токсичностью аргининосукцината, окислительно-восстановительным дисбалансом и последствиями дефицита аргинина с NO, а также дефицитом полиаминов и креатина.⁷ При дефиците ARG1 наблюдается спастическая диплегия и замедленная миелинизация.³¹ Хотя терапия, направленная на печень, например трансплантация печени, может обеспечить системное улучшение основного заболевания, нереально, чтобы стратегия "только печень" могла вылечить все внепеченочные проявления.

Важнейшим условием для разработки успешных подходов к генотерапии является глубокое понимание патофизиологии заболевания-мишени, биологии популяции клеток-мишеней и терапевтических возможностей доступных технологий переноса генов и редактирования генома. UCD установил высокую планку, и самым убедительным доказательством этого стал урок природы. У гетерозиготных женщин с дефицитом OTC, у которых одна Х-хромосома несет здоровый аллель OTC, а другая Х-хромосома - мутантный аллель, печень содержит смешанную популяцию гепатоцитов с нормальной или недостаточной/отсутствующей ферментативной активностью OTC, в зависимости от того, какая Х-хромосома инактивирована в конкретном гепатоците³². Процесс инактивации Х-хромосомы происходит на ранних этапах органогенеза печени, когда количество предшественников гепатоцитов невелико, и стохастическая природа инактивации Х-хромосомы может привести к образованию печени со значительным перекосом инактивации Х-хромосомы в пользу Х-хромосомы, несущей аллель дикого типа или мутантного аллеля. Перекос в пользу Х-хромосомы, несущей аллель OTC дикого типа, снижает долю гепатоцитов, экспрессирующих OTC, и ассоциируется со все более тяжелым фенотипом. Например, у гетерозиготных женщин с перекосом до 10 % гепатоцитов, экспрессирующих аллель дикого типа, ожидается тяжелый фенотип заболевания. Учитывая, что у пациентов мужского пола с 10 % остаточной активности OTC ожидается менее тяжелое течение заболевания на поздних стадиях³³ , становится ясно, что клеточное биораспределение активности OTC по всей печени имеет решающее значение. Нормальная физиологическая активность OTC в 10% гепатоцитов (90% без активности) не так эффективна для уреагенеза, как субфизиологическая активность в 10% по всей печени. Примечательно, что пациенты женского пола со смешанной популяцией гепатоцитов, экспрессирующих OTC, естественным образом моделируют печень после генотерапии и подтверждают вывод о том, что для обеспечения надежного терапевтического эффекта необходимо генетически модифицировать значительно больше 10% гепатоцитов. Математическое моделирование цикла мочевины подтверждает качественно аналогичные выводы для других UCDs³⁴.

Достижение эффективности переноса генов, необходимой для терапевтического эффекта при UCDs, осложняется феноменом метаболической зональности, когда многочисленные метаболические функции печени демонстрируют четкие градиенты активности в печеночной дольке между портальными триадами и центральной веной³⁵, причем ферменты цикла мочевины наиболее сильно экспрессируются в гепатоцитах, расположенных в перипортальных областях. Как следствие, ген-терапевтические вмешательства при UCDs в идеале должны быть направлены преимущественно на эту область печеночной дольки, поскольку доставка/редактирование генов вблизи центральной вены будет вносить относительно небольшой вклад в восстановление уреагенной активности. Первые попытки решить эту проблему только появляются в литературе по переносу генов³⁶.

Еще одной важной проблемой, особенно в педиатрическом контексте, является рост печени. Это особенно важно учитывать при использовании эписомных векторных систем, поскольку гепатоцеллюлярная репликация приводит к разбавлению и потере векторных геномов с течением времени, что влечет за собой снижение терапевтического эффекта. По этой причине все большее внимание уделяется технологическим подходам, которые приводят к постоянным изменениям в геноме гепатоцитов, будь то геномная интеграция терапевтической кассеты или точная локус-специфическая коррекция вызывающего заболевание мутантного локуса с помощью подходов редактирования генома.

Сбалансировано решая эти сложные задачи, печень обладает рядом свойств, которые благоприятствуют проведению генотерапии, особенно после системной доставки путем внутривенного введения составов для переноса генов, в том числе на основе рекомбинантных вирусов и физико-химических подходов, таких как липидные наночастицы. Хотя печень составляет примерно 2-3 % от массы тела, она получает около 25 % сердечного выброса крови, что представляет собой очень высокий относительный кровоток.³⁷ Таким образом, большая часть начальной дозы переноса генов достигает печени при первом прохождении, где встречается вторая благоприятная особенность биологии печени - наличие фенестрированного сосудистого эндотелия.³⁸ Это позволяет составу для переноса генов во внутрисосудистом отделении установить прямой контакт с поверхностью гепатоцитов без необходимости проникать через интактный сосудистый эндотелий.

Последняя благоприятная особенность печени - ее толерогенные свойства, наиболее очевидные в том, что печень может быть успешно пересажена, минуя HLA-границы, в отличие от других солидных органов, подлежащих трансплантации.³⁹ Это снижает вероятность того, что трансгены, экспрессированные в печени, даже если они являются эффективными неоантигенами, вызовут иммунный ответ путем презентации пептидов, полученных трансгенами, через HLA-путь класса I. Однако следует отметить, что после испытаний генотерапии, направленной на печень человека, были зарегистрированы сильные адаптивные иммунные реакции на структурные элементы векторов переноса генов, такие как капсид адено-ассоциированных вирусных векторов (rAAV).⁴⁰

Первое клиническое испытание, направленное на UCDs, было начато в конце 1990-х годов с использованием аденовирусных векторов для экспрессии генов, направленных на печень. Аденовирусы - это не-развивающиеся двухцепочечные ДНК-вирусы. Они имеют большой геном размером 36 кб и способны трансдуцировать делящиеся и не-делящиеся клетки⁴¹ , но остаются эписомальными и, следовательно, со временем могут быть потеряны из делящихся клеточных популяций. Наиболее распространенным серотипом является серотип 5, обладающий высоким тропизмом к печени. Аденовирусы являются провоспалительными и вызывают устойчивый врожденный и адаптивный иммунный ответ.⁴² Несмотря на попытки снизить иммунитет, связанный с вектором, путем удаления специфических вирусных геномных последовательностей, были разработаны различные поколения аденовирусных векторов. Доказательство концепции было продемонстрировано на мышиных моделях с дефицитом OTC, ASS, ASL и ARG1.43-47 В клиническое исследование I/II фазы генотерапии были включены взрослые пациенты с поздним развитием дефицита OTC для проверки безопасности и эффективности аденовирусного вектора второго поколения 5, кодирующего ген hOTC. Одному из участников, Джесси Гелсингеру, была введена самая высокая из шести эскалационных доз (6 х 10¹¹ vg/кг) через печеночную артерию. Впоследствии у него развился тяжелый синдром иммунного ответа в течение 24 ч, и он умер от полиорганной недостаточности через 4 дня после введения аденовирусного вектора.⁴⁸ Другой испытуемый получил такую же самую высокую дозу аденовирусного вектора в этом испытании без летального исхода. Причиной смерти стал тяжелый капсид-опосредованный врожденный иммунный ответ и цитокиновый шторм. Доклинические исследования показали тяжелую токсичность у обезьян при 17-кратном превышении дозы и незначительные лабораторные отклонения при дозах, использованных в исследовании.⁴⁹ Этот случай смерти вызвал шок в области генотерапии, послужил полезным уроком о соотношении риска и пользы в испытаниях на людях и подчеркнул острую необходимость в разработке более безопасных векторов.

В начале 2000-х годов внимание было сосредоточено на разработке более безопасных вирусных векторов, при этом возрос интерес к векторам, полученным из адено-ассоциированного вируса (AAV). AAV - это одноцепочечный ДНК-вирус, который не связан с какой-либо известной патогенностью во время острой сероконверсии. Геномная интеграция не является обязательным элементом жизненного цикла вируса AAV, и скорость интеграции последовательностей векторов AAV относительно низка, но все же значительна.⁵⁰ Недавние публикации указывают на потенциальную связь между интеграцией AAV дикого типа в печень человека и опухолеродностью,^{51, 52} однако онтогенез гепатоцеллюлярного рака сложен и многофакторен, что затрудняет установление причинно-следственной связи.⁵³ Недавно сообщалось о педиатрической острой печеночной недостаточности, вызванной вирусами-помощниками, такими как адено- или хелперные вирусы, но этот вопрос остается не до конца изученным.⁵⁴

Первоначальные исследования по доказательству концепции с использованием AAV-опосредованного добавления генов, проведенные с использованием гепатотропных серотипов AAV, таких как AAV7, 8 или 9, показали долгосрочную нормализацию основного биомаркера, оротата мочи, у взрослых мышей Spfash с дефицитом OTC в легкой форме⁵⁵. Более того, риск долгосрочной генотоксичности печени представляется низким.^{56, 57} Однако следует отметить, что редкие события интеграции в локусе Rian у мышей, получавших лечение в период новорожденности, могут привести к развитию гепатоцеллюлярной карциномы у пожилых мышей,⁵⁸ причем величина риска зависит от силы промотора-энхансера.⁵⁹

AAV-опосредованный перенос генов опирается преимущественно на эписомы - круговые двухцепочечные молекулы ДНК, присутствующие в ядре, которые размываются и теряются во время деления клеток⁵⁰ (рис. 2). Это было признано основным ограничением для получения устойчивой эффективности трансгенов в быстро растущей печени молодых животных, если не рассматривать повторное введение AAV⁶⁰. В то время как коррекция взрослого фенотипа мышей Spfash сохранялась в течение длительного времени после системного введения гепатотропного вектора AAV8, кодирующего ген мышиного Otc под транскрипционным контролем специфического для печени промотора, метаболическая коррекция и преимущества переноса генов AAV были быстро утрачены у новорожденных животных.¹⁸ Несмотря на различные доклинические попытки с использованием различных иммуносупрессивных протоколов, успешная реинъекция AAV остается проблемой, которую еще предстоит полностью преодолеть.



FIGURE 2 Transduction pathways of lentiviral, adeno-associated viral vectors and messenger RNA (mRNA) lipid nanoparticles: cellular uptake and in-cell processing. AAV, adeno-associated virus.

Возник еще один вопрос, касающийся потенциального доминантно-отрицательного эффекта мутантных белков на их собратьев дикого типа после переноса генов. После доставки AAV8-трансгена мутантных аллелей Otc в мышиную печень дикого типа у мышей не наблюдалось снижения активности OTC независимо от экспрессии мутантных белков.⁶¹ Это подтвердило, что мутантные белки не оказывают доминантно-отрицательного эффекта на OTC дикого типа, что подтверждает трансляционную эффективность переноса генов AAV.

В течение нескольких лет стратегия добавления генов AAV стала ведущей и самой безопасной технологией таргетной терапии печени. Многочисленные доклинические успехи в лечении UCDs и других IMD печени проложили путь к клиническим испытаниям ранней фазы в течение следующего десятилетия. Однако преимущественно не интегративный характер AAV-опосредованного переноса генов был быстро признан основным препятствием для достижения устойчивой эффективности при педиатрических IMD печени, поскольку повторное введение предотвращается гуморальным иммунным ответом против AAV, возникшим после первого введения. Необходимо было рассмотреть альтернативные стратегии для педиатрических UCDs.

В течение последнего десятилетия добавление генов было основной терапевтической стратегией, а векторы на основе AAV были ведущей успешно переведенной технологией, нацеленной на печень. Альтернативные стратегии трансдукции печени детей либо путем стабильной интеграции геномных трансгенов, либо с помощью транзиторной терапии мРНК продемонстрировали доказательство концепции и в настоящее время переносятся (Таблица 1).

TABLE 1. Clinical trials for ornithine transcarbamylase deficiency.

После различных исследований по доказательству концепции в доклинических моделях UCDs первое клиническое испытание CAPtivate по AAV-опосредованному добавлению гена UCDs с использованием AAV8, направленное на взрослых пациентов с поздней формой дефицита UCDs, было спонсировано компанией Ultragenyx (NCT02991144). Это пилотное клиническое испытание I/II фазы с открытой дозировкой показало незначительный профиль эффективности DTX301 в диапазоне доз 3,2 x 10¹²-1,7 x 10¹³ GC/кг. Семь из 11 пациентов были признаны ответившими на лечение , причем у самого длительно лечившегося пациента эффект сохранялся до 4 лет.⁶² Четырем пациентам, полностью ответившим на лечение, удалось прекратить прием препаратов, поглощающих аммиак, и либерализовать свою диету. В рамках этой программы начато клиническое исследование III фазы (NCT05345171).⁶³ Еще одно открытое клиническое исследование HORACE, направленное на педиатрических пациентов с дефицитом OTC и спонсируемое Университетским колледжем Лондона (NCT05092685), находится на стадии предварительного набора участников.⁶³ В этом испытании будет использоваться разработанный гепатотропный капсид AAV-LK03, эффективность которого в трансдукции гепатоцитов человека в разы выше по сравнению с AAV8. ⁶⁴ Эта лучшая скорость трансдукции AAV-LK03 и родственных капсидов AAV3B была показана различными группами на тирозинемической и иммунодефицитной модели мыши Fah-/-/Rag2-/-/Il2rgh-/- (FRG), с приживленными первичными человеческими гепатоцитами, что позволило получить химерную печень мыши и человека с заселением печени мыши более 95% человеческих гепатоцитов.^64-66 Недавние клинические испытания I/II фазы гемофилии А показали, что трансдукция AAV-LK03 лучше, чем капсида AAV8, при относительно более высокой экспрессии фактора VIII в аналогичных дозах, например, 16%-194% (NCT03003533) против 54%-69% (NCT03370172) активности фактора VIII на пике после введения 6 х 10¹² vg/кг у взрослых с тяжелой гемофилией А, соответственно.^{67, 68} Доклинические исследования HORACE продемонстрировали безопасность у не-человекообразных приматов⁶⁹ и сниженную серораспространенность инженерных капсидов AAV по сравнению с капсидами дикого типа у людей.⁷⁰

Совсем недавно дополнительные доклинические исследования с использованием AAV-опосредованного добавления генов показали дополнительные преимущества у мышей Spfash с дефицитом OTC, с долгосрочной пользой, предотвращая хронические заболевания печени и фиброз.⁷¹ Многократная кодон-оптимизация трансгена OTC может значительно улучшить транслируемость мРНК, следовательно, долгосрочную терапевтическую эффективность и потенциально лучшую безопасность, если доза вводимого AAV может быть уменьшена для достижения аналогичного эффекта.⁷² После успеха в лечении дефицита OTC, другие UCDs, такие как дефицит CPS1,⁷³ дефицит ASS,⁷⁴ дефицит ASL^{12, 75} и дефицит ARG1^{16, 76, 77}, были направлены на добавление генов AAV с успехом у взрослых мышей, но с ограниченной эффективностью у новорожденных. Для дефицита CPS1 размер трансгена слишком велик, чтобы его можно было упаковать в открытую рамку считывания одного вектора AAV. Поэтому трансген был разделен и введен с помощью двух векторов AAV с перекрывающейся кодирующей последовательностью, что позволило осуществить гомологичную рекомбинацию и синтез активного фермента⁷³. Интересно, что последовательные инъекции генотерапии AAV8, включающие фетальные, неонатальные и дополнительные постнатальные инъекции, для лечения ASS-дефицитной модели с неонатальной летальностью потребовали перекрестного воспитания щенков вектор-негативными плодами, поскольку иммунизированные плоды с нейтрализующими антителами (NAbs) после фетальных инъекций передавали эти NAbs через молоко, тем самым блокируя успешную трансдукцию печени⁷⁴. Исследовалась также генная терапия дефицита ASL с использованием кодон-оптимизированного человеческого ASL в AAV8 с целевой доставкой в печень в гипоморфной мышиной модели. Введение через височную лицевую вену привело к увеличению выживаемости, но не до уровня дикого типа. Внутривенное введение молодым взрослым мышам привело к коррекции метаболитов.⁷⁵ В другом исследовании также использовался одноцепочечный вектор AAV8 с мышиным Asl, который доставлялся системно, что привело к фенотипическому спасению взрослой гипоморфной мышиной модели AslNeo/Neo и ограниченной коррекции новорожденных животных после однократного внутривенного введения.¹²

В связи с возможными ограничениями устойчивой эффективности направленной на печень генотерапии AAV в педиатрии были разработаны стратегии интеграции в геном хозяина для обеспечения долгосрочной экспрессии трансгенов.

Случайная интеграция интересующего трансгена была успешно достигнута при UCDs с использованием нуклеазы или без нее. Доклиническое исследование с использованием транспозазы piggybac, доставляемой двойной системой AAV, содержащей трансген и нуклеазу, было успешно протестировано на модели Spfash с дефицитом орнитин-транскарбамилазы (OTCD) и неонатально летальной ASS-дефицитной мыши, обеспечив устойчивую фенотипическую коррекцию до взрослого возраста после однократной системной неонатальной инъекции⁷⁸.

Другой подход, использующий лентивирусную генотерапию in vivo, был успешно испытан в ASLD, обеспечивая долгосрочное излечение дефекта уреагенеза после однократной неонатальной внутривенной инъекции и без проблем с безопасностью.⁷⁹ Лентивирусные векторы представляют собой одноцепочечные РНК-векторы, которые высвобождают свой груз в цитоплазме, где обратная транскрипция и синтез второй нити ДНК обеспечивают ядерную миграцию и вставку в геном (рис. 2). Интеграция несет в себе теоретический риск инсерционного мутагенеза, однако его не наблюдалось при использовании лентивирусных векторов в различных доклинических моделях, например, у мышей, собак и не-человеческих приматов, после доставки in vivo.^{80, 81}

Таргетная генотерапия может снизить риск развития опухолевых событий путем выбора генетического локуса, определенного как "безопасная гавань". Это достигается с помощью нуклеазы или без нее, часто с помощью стратегии гомологичной рекомбинации (рис. 3).



FIGURE 3 Non-targeted and targeted integrations. Non-targeted integration is mediated by integrative viral vector systems like lentiviral vectors or nucleases such as piggybac transposase. Targeted integration can use homologous recombination only but usually combines the action of a nuclease and homologous recombination, a strategy which shows a higher insertional rate. Homology-independent targeted integration (HITI) does not use homology arms but a Cas9 nuclease, which cuts the genomic target sequence and the donor plasmid DNA, thereby creating complementary blunt ends between both target and donor sequences. The donor DNA plasmid is used for repair by the non-homologous end-joining pathway and integrates at the genome double-strand break site.

UCDs характеризуются большим разнообразием генотипов с многочисленными частными мутациями и небольшим количеством "горячих точек".^82-84 Хотя редактирование генов с одной миссенс-мутацией было успешно достигнуто in vivo, это не является надежной трансляционной терапией для этих расстройств. Поэтому все усилия направлены на интеграцию целых трансгенов.

Замена генов без промотора и без нуклеазы путем гомологичной рекомбинации доказала свою эффективность при многих IMD печени, например при гемофилии В⁸⁵ , болезни Crigler–Najjar⁸⁶, метилмалоновой ацидемии⁸⁷ , и в настоящее время оценивается на безопасность и эффективность в клиническом исследовании I/II фазы SUNRISE (NCT04581785) для метилмалоновой ацидемии, спонсируемом компанией LogicBio Therapeutics⁶³. В зависимости от целевого участка в геноме, отсутствие энхансера/промотора может обеспечить физиологическую регуляцию гена эндогенным промотором и снизить риск трансактивации, которая была определена как один из основных рисков инсерционного мутагенеза⁵⁹.

Редактирование генома, опосредованное нуклеазой, основано на использовании нуклеазы, например, TALENS, нуклеазы цинковых пальцев, мегануклеазы и Cas9, редактирующих геном хозяина в определенном локусе, что достигается за счет одной направляющей РНК (sgRNA), специфически распознающей последовательность ДНК длиной 20 п.н. Нуклеаза создает одноцепочечный или двуцепочечный разрыв ДНК, который затем восстанавливается с помощью гомологически-направленной репарации (HDR) на основе шаблона донорской ДНК. Двойная система AAV доставляет sgRNA с донорским шаблоном OTC и Cas9. Этот подход был использован на мышах OTCD Spfash для успешной коррекции миссенс-мутации в этой мышиной модели, причем эффективность была выше у новорожденных животных по сравнению с молодыми взрослыми особями: 15 % против 6 % гепатоцитов, трансдуцированных через 3 недели после инъекции, соответственно.⁸⁸

Другой подход, сочетающий двухцепочечный разрыв ДНК и гомологичную рекомбинацию через два гомологичных рукава длиной 900 п.н., фланкирующих шаблон донора OTC, был затем успешно протестирован с использованием той же sgRNA через аналогичный двойной подход AAV, вводимой системно неонатальным детенышам OTCD Spfash. Двадцать пять процентов гепатоцитов были успешно трансдуцированы через 3 недели после инъекции с коррекцией фенотипа. Однако это было связано с 28-процентной частотой инсерций и делеций из-за ограниченного HDR и восстановления двунитевого разрыва ДНК путем негомологичного соединения концов (NHEJ).⁸⁹ В аналогичном подходе расщепление CRISPR-Cas9 в сочетании с HDR было использовано in vivo для исправления миссенс-мутаций в прижившихся первичных гепатоцитах OTCD, полученных от пациентов, у мышей FRG. Доставка технологии CRISPR-Cas9 осуществлялась с помощью двойной системы AAV с разработанным гепатотропным капсидом AAV-NP⁵⁹. Этот подход привел к беспрецедентному уровню коррекции - до 29% гепатоцитов были исправлены.⁹⁰ Этот же подход, предполагающий Cas9-опосредованную вставку генов в сочетании с гомологичной рекомбинацией, был протестирован в гепатоцитах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS) с дефицитом ARG1, путем вставки кДНК ARG1 человека полной длины с оптимизированными кодонами в экзон 1 локуса гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы. Это успешно восстановило активность аргиназы и, следовательно, уреагенез.⁹¹ Этот подход был опробован при дефиците CPS1 с направленной интеграцией с помощью Cas9 cut и опосредованной гомологичной рекомбинацией вставкой генов в локус AAVS1. Однако отредактированные клетки не показали восстановления уреагенеза in vitro.⁹² Быстрое развитие iPSC-производных гепатоцитов и органоидов печени облегчает скрининг стратегий редактирования in vitro.⁹³

Недавно была описана цельная вставка трансгена, вызванная комбинированным двунитевым разрывом ДНК и гомологичной рекомбинацией, с помощью альтернативной нуклеазы - мегануклеазы ARCUS. ARCUS основана на естественном гомодимерном ферменте редактирования генома I-CreI, который происходит из генома хлоропласта Chlamydomonas reinhardtii и обеспечивает высокоточные разрезы двуцепочечной ДНК.⁹⁴ Мегануклеаза ARCUS показала высокий процент отредактированных гепатоцитов (16%) в экзоне 7 гена PCSK9, определенного как безопасная гавань. Устойчивая эффективность после однократной системной инъекции у щенков OTCD Spfash наблюдалась в течение года после инъекции. Безопасность этой стратегии редактирования подтверждается на не-человеческих приматах с удовлетворительными предварительными результатами⁹⁵.

Хотя эти доклинические успехи обнадеживают, существует ряд трансляционных проблем, которые еще предстоит полностью решить с точки зрения как эффективности, так и безопасности. Например, пока не ясно, будут ли HDR-зависимые подходы достаточно эффективны в печени человека in vivo, даже в раннем младенческом возрасте, когда печень быстро растет, и могут потребоваться подходы, использующие NHEJ, который не зависит от клеточного цикла.⁹⁶ Что касается безопасности, то одним из основных не до конца решенных вопросов является частота и характер непреднамеренных on- и off-target событий редактирования с генотоксическим потенциалом.

Другой подход к направленной интеграции называется гомологически-независимой направленной интеграцией, для которой требуется нуклеаза Cas9, но без гомологического оружия. Нуклеаза Cas9 вырезает сайты-мишени для Cas9 как в геномной последовательности-мишени, так и в круговом шаблоне FNA плазмиды. Это создает тупые концы как в геномном целевом сайте, так и в концах линеаризованной донорской последовательности, что позволяет интегрировать донорскую ДНК плазмиды в месте двухцепочечного разрыва генома с использованием пути NHEJ для восстановления (рис. 3).⁹⁶ Этот подход не был опробован с UCD.

Безопасность и эффективность технологии мРНК были продемонстрированы во всем мире во время пандемии COVID-19. Новая платформа вакцины против SarS-CoV-2 на основе мРНК была введена миллионам людей с более высокой эффективностью по сравнению с платформами вирусных векторов или рекомбинантных белковых вакцин^.97 В настоящее время разрабатывается более 400 продуктов, связанных с РНК, причем инвестиции растут по экспоненте.⁹⁸ Различные технологии РНК были протестированы с добавлением мРНК или глушением генов с помощью регуляторных РНК, то есть малых интерферирующих или коротких шпилечных РНК. Липидные наночастицы ( LNPs), содержащие РНК, захватываются и транспортируются через эндосомы для высвобождения своего груза в цитоплазме (рис. 2). Из-за их преходящего действия для долгосрочной эффективности необходимо повторное введение. мРНК инкапсулируется в LNPs для предотвращения быстрой деградации под действием РНКаз. Сообщалось, что ни соответствующим образом модифицированные мРНК, ни LNPs не вызывают устойчивых иммунных реакций,⁹⁹ что позволяет успешно применять их повторно. В настоящее время более 30 продуктов на основе РНК одобрены или находятся на поздней стадии клинических испытаний для вакцин, иммунотерапии рака, редактирования генов или замены белков при наследственных заболеваниях печени или нервно-мышечных расстройствах.^{100, 101}

Этот подход был успешно исследован для лечения дефицита ARG1 в условно нокаутной модели дефицита ARG1.¹⁰² Повторное дозирование мРНК ARG1 привело к устойчивой коррекции фенотипа заболевания с нормализацией уровня аммиака и аргинина в плазме без токсичности. Этот подход позволил описать и скорректировать специфические неврологические патофизиологические особенности заболевания, а именно дисмиелинизацию центральной нервной системы, особенно кортико-спинальных путей, щадя периферическую нервную систему.³¹ Терапия с помощью мРНК была также успешно оценена на мышиной модели дефицита ASL, при этом лечили новорожденных и спасали взрослых животных с коррекцией биомаркеров до физиологических уровней.¹⁰³ Это показало коррекцию хронического заболевания печени, наблюдаемого при ASLD, и восстановление физиологического метаболизма глутатиона.

мРНК-терапия OTCD (ARCT-810) была протестирована в клинических испытаниях фазы Ia (NCT04416126) и Ib (NCT04442347) с удовлетворительным профилем безопасности.¹⁰⁴ Эта программа, спонсируемая компанией Arcturus Therapeutics, в настоящее время находится в фазе II клинического испытания (NCT05526066) с набором пациентов подросткового и взрослого возраста с дефицитом OTCD.⁶³

Генотерапия UCDs быстро развивается. Благодаря тяжести клинического фенотипа, благоприятному профилю риск-польза для экспериментального вмешательства и относительно частому проявлению в области IMD, большинство пионерских технологий, нацеленных на печень, будут изучать возможности применения в качестве доказательства концепции при UCDs. Первые признаки трансляционных перспектив в клинических испытаниях на ранней стадии у взрослых пациентов с поздней формой дефицита OTC прокладывают путь к более широкому развитию генотерапии для молодых пациентов и для всех UCDs. По соображениям безопасности и эффективности активно разрабатываются новые интегративные и транзиторные технологии для достижения святого Грааля - полной и стабильной фенотипической коррекции с неонатального периода у самых больных пациентов с ранним развитием заболевания.