Болезнь Гиршпрунга, врожденная дисплазия интестинальных нейронов (congenital intestinal neuron dysplasia Hirschsprung’s disease, HSCR) характеризуется пространственно паттернированным дефицитом энтерических нейронов и всегда ограниченна самыми дистальными отделами кишечника, хотя протяженность участков с отсутствием нейронов вариабельна. Генетические факторы (аномалии), являющиеся причиной HSCR в большинстве случаев известны (Newgreen DF, Young HM. The enteric nervous system:development and developmental disturbances-Part 1.Pediatr Dev Pathol 2002;5:224-247). Тем не менее связь между генотипом и фенотипов непрямая и требует понимания происхождения и морфогенетических преобразований клеток-предшественников энтеральной нервной системы (ЭНС).

Развитие ЭНС

Происхождение ЭНС. Эмбриональный период.

Вильгельм Гис (Wilhelm His, Jr.) еще 130 лет назад обнаружил, что клетки могут перемещаться не некоторое расстояние от мест их происхождения посредством процесса, названного им миграцией. Клетки, описанные Гисом при исследовании гистологических срезов куриного эмбриона, мигрировали из зачатка мозга и формировали черепные ганглии. Эти способные к миграции клетки, сейчас называют клетками нервного гребня (НГ). Популяция клеток НГ появляется на границе между нервной пластинкой и эпидермальной эктодермой вдоль всего росто-каудального пространства эмбриона и позже распространяется на дорсальную срединную линию, когда складки валика нервной пластинки формируют нервную трубку -- зачаток, который позже превращается в центральную нервную систему (ЦНС). Клетки нервного гребня посредством тонко контролируемого процесса миграции, сами распространяются довольно широко и точно. В конечном итоге все клетки НГ дифференцируются не только в клетки черепных ганглиев, как это описывал Гис, но и в другие клеточные типы - пигментные клетки и клетки черепно-лицевой соединительной ткани. Клетки НГ дают начало большинству периферических нервных тканей, включая нейроны, опорные клетки и Шванновские клетки дорсальных корешковых ганглиев, а также автономной нервной системе, включая ЭНС.

До создания методов мечения клеток и молекулярных клеточных маркеров, идентификация происхождения мигрирующих клеток, их миграционные пути и их места конечной локализации были затруднены, т.к. недифференцированные мигрирующие клетки трудно было отличить от недифференцированных клеток тканей, через которые они мигрировали. Для идентификации клеток применяли такие методы как удаление групп клеток на ранних стадиях эмбрионального развития живого эмбриона до клеточной дифференцировки, последующее гистологическое исследование эмбриона, наблюдение за тканями и клеточными типами, которые были удалены. В конце 1940, начале 50-х годов Yntema и Hammond изучая этими методами куриный эмбрион, проследили происхождение определенных элементов автономной нервной системы. В частности, в одном из опытов (in ovo) микрохирургического удаления дорсального нейрального зачатка (т.е. нервного гребня вместе некоторыми прилегающими частями нервной трубки) Yntema и Hammond обнаружили, что ЭНС не развивалась в гистологически нормальном кишечнике.

Это непрямое доказательство происхождения клеток ЭНС, в частности, нейронов, из нервного гребня в дальнейшем было подтверждено, после применения метода трансплантации chick -quail Le Douarin и Teiller (J.Embryol Exp Morphol 1973;30:31-48). При этом одном из наиболее удачных методов классической эмбриологии, нейроны нервного гребня перепела пересаживали в куриный эмбрион до начала миграции. Такие химерные эмбрионы развивались совершенно нормально, и можно было проследить сложные миграционные процессы и дифференцировку клеток, т.к. клетки двух видов животных отличались и гистологически и иммунологически. Более того, пересадки нервного гребня между двумя родственными видами лягушек Xenopus приводила к развитию ЭНС в эмбрионе хозяина, чьи клетки являлись донором . Клетки нейрального зачатка, меченые флуоресцентными красителями еще до миграции клеток НГ у мышей в культуре целого эмбриона позже были обнаружены в ЭНС (Development 1991;111:857-866), что подтверждало происхождение ЭНС из НГ у млекопитающих. Молекулярно-генетические маркеры указывали на сходное происхождение ЭНС у полосатых данио (zebrafish). Исследования рыб, амфибий, птиц и млекопитающих подтвердило, что ЭНС у всех позвоночных происходит из НГ, клетки которого мигрируют в кишечник.

Эмбриональное происхождение интерстициальных клеток Кахаля (interstitial cells of Cajal, ICC)

ICC - это сеть клеток, ассоциированных с наружной мускулатурой кишечника. Они также образуют тесные связи с нервными волокнами, иннервирующими кишечник (Microsc Res Tech 1999;47:223-238). Разные субпопуляции ICC отличаются по своим физиологическим функциям. Некоторые субпопуляции ICC жизненно необходимы для генерирования медленных электрических волн, обеспечивающие ритмичные сокращения, другие субпопуляции ICC являются важными интермедиаторами в нейромышечной трансмиссии. Так как ICC тесно связаны с энтерическими нейронами, долгое время считали, что они имеют то же происхождение, что и энтерические нейроны. Однако недавно было показано, что и у млекопитающих, и у птиц происхождение ICC отличается от происхождения энтерических нейронов. ICC возникают из локальной кишечной мезенхимы, а не из НГ.

ICC экспрессируют рецептор тирозин киназы, Kit, а развитие этих клеток зависит от фактора-Kit сигнального пути стволовых клеток (stem cell factor-Kit signaling pathway). Энтерические нейроны являются основным источником фактора стволовых клеток (лиганд для Kit еще называют «steel“) и, вероятно, что для развития ICC требуется присутствие энтерических нейронов. Однако, у эмбрионов мышей и птиц ICC развиваются в отсутствие энтерических нейронов. Данные о плотности ICC у больных с HSCR противоречивы. Сообщалось (Gastroenterology 1996;111:901-910), о нарушениях сети ICC и о дефиците ICC в аганглионозных сегментах больных HSCR. Однако в более позднем исследовании различий в плотности и в расположении ICC в аганглионозных сегментах кишечника больных HSCR и в идентичных областях непораженного кишечника обнаружено не было. Недавно было опубликовано два сообщения о присутствии ICC при полном интестинальном ганглионозе. У обоих младенцев была понижена плотность ICC. В одном из этих исследований показано, что поражались не все субпопуляции ICC - ICC, ассоциированные с миэнтерическим сплетением были нормальными, но ICC, ассоциированные с кольцевой мышцей, имели значительное снижение числа этих клеток.

Регионализация энтерического нервного гребня

НГ простирается вдоль всей длины оси тела. Yntema и Hammond удаляли нервный гребень у куриного эмбриона на разных уровнях оси и пришли к заключению, что удаление на всех уровнях (за исключением одного) не оказывало никакого эффекта на последующий фенотип ЭНС. Они также обнаружили, что удаление одного короткого участка приводило к полному отсутствию ЭНС во всем желудочно-кишечном тракте. Эта критическая область располагалась в заднем мозге, каудальнее зачатка уха и простиралась в направлении первых нескольких цервикальных сегментов. Она находится на уровне сомитов 1-7, и называется вагальным уровнем (vagal level) НГ(Рис.1). Авторы пришли к выводу, что ЭНС является производным только вагальной области НГ. Примерно через 20 лет, после того как был идентифицирован вагальный источник, Le Douarin и Teillet предположили существование еще одного источника -- пояснично-крестцовую область (люмбосакральную) НГ (Рис.1а). Но значение этой области как источника ЭНС долгое время не признавалось. Недавно было подтверждено, что пояснично-крестцовая область является источником нейронов и глии ЭНС в нижних отделах кишечника (Development 1998;125:4335-4347). Как дополнительный источник клеток ЭНС была идентифицирована область НГ, расположенная каудальнее вагальной области.

Вагальный (vagal) нервный гребень как источник ЭНС

Пересадка сегментов между куриными и перепелиными эмбрионами подтвердила предположение Yntema и Hammond о том, что вагальный НГ дает начало ЭНС и что никакие другие клетки ЭНС не появляются из цервикального и торакального НГ, а также то, что вклад люмбосакрального НГ как источника ЭНС невелик. В дальнейшем при использовании других методов было установлено, что единственным источником клеток ЭНС является ростральная часть НГ. Эти косвенные данные не подтвердили значимость люмбосакрального уровня НГ как источника ЭНС. Такая интерпретация базировалась на том, что тезис Yntema и Hammond о вагальном НГ как единственном источнике ЭНС утверждал -- клетки НГ должны заселять желудочно-кишечный тракт в росто-каудальном (оро-анальном) направлении, тогда как дополнительный люмбосакральный источник мог бы быть дополнительным источником заселения ЖКТ в каудо-ростральном (ано-оральном) направлении. Первые доказательства о направлении колонизации кишечника клетками НГ у куриного эмбриона были получены с помощью гистологической идентификации нейронов в небольших определенных сегментах эмбрионального кишечника, растущего изолированно на мембране хориоаллантоиса эмбриона хозяина. В то время еще не было подходящих эндогенных маркеров для клеток НГ на ранних стадиях миграции. Отсутствие нейронов указывало, что предшественники ЭНС еще не достигли сегмента, и не означало, что они, например, присутствуют, но не дифференцируются. Результаты этого исследования показали, что заселение клеток происходит только в росто-каудальном направлении, что подтверждало значимость вагального НГ как единственного источника ЭНС. Идентичные результаты были получены у мышей и крыс при использовании того же метода, где серию пересадок сегментов эмбрионального кишечника производили в капсулу почки взрослого животного. В дальнейшем использование метода надрезания кишечника куриного эмбриона in ovo показало отсутствие ганглиев ЭНС каудальнее места надреза. Эти данные также согласовывались с представлениями о ростральном происхождении ЭНС.

Последующие исследования с использованием маркеров для клеток НГ или нейронов также не подтвердили наличие других источников ЭНС, кроме вагального НГ. Использование маркеров клеток НГ ранних стадий его развития - Phox2b, p75 NTR и Ret (Рис. 2) и ET B у мышей указывали на росто-каудальную волну продвижения клеток. У трансгенных мышей почти все предшественники энтерических нейронов экспрессировали репортерный ген LacZ. При исследованиях куриных и перепелиных эмбрионов Tucker с соавт. использовал HNK -1 тип (т.е. HNK-1, NC-1) моноклональные антитела, которые метили мигрирующие клетки НГ птиц. Авторы также пришли к выводу о росто-каудальном направлении миграции.

Результаты всех этих исследований показали, что источником клеток ЭНС является вагальный НГ и что клетки-предшественники заселяют ЖКТ в росто-каудальном направлении. Но была сделана оговорка - допускалось существование дополнительного (т.е. люмбо-сакрального) источника клеток ЭНС. Предполагалось, что клетки люмбо-сакрального НГ заселяют кишечник после клеток вагального НГ. В настоящее время ведутся работы в этом направлении. Несмотря на несовершенство методов исследования, они дали ценные результаты о формировании ЭНС, особенно о пространственно-временных характеристиках клеток-предшественников вагального Нги их миграции. И хотя представления о происхождении ЭНС только из клеток-предшественников вагального НГ несколько преувеличены, это оказалось полезным для исследований происхождения HSCR.

Люмбосакральный нервный гребень как источник ЭНС

Исследования эмбрионов птиц подтвердили вагальное происхождение клеток ЭНС ЖКТ. Предполагали, что цервикальный и торакальный нервный гребень (т.е. области, расположенные каудальнее вагального НГ) не вносят никакого вклада в развитие ЭНС. Однако были обнаружены меченые клетки ЭНС в задней части кишечника и в дистальной части средней кишки, являющиеся производными люмбосакрального НГ (у птиц каудальнее 28 сомита, что соответствует сомитам 24 у мышей и человека). Сходное, но более детализированное исследование с использованием современных молекулярных маркеров, подтвердило эти находки как для нейронов, так и для клеток энтеральной глии. Эти исследования доказали (по крайней мере, у птиц), что для передней части ЖКТ и части средней кишки единственным источником их ЭНС является вагальный НГ, а для задней части кишечника и прилегающего к нему среднего кишечника дополнительным источником нейронов ЭНС является люмбосакральный НГ. Это указывает на то, что имеется завершенная росто-каудальная волна заселения кишечника нейронами ЭНС (происходящая из вагального НГ) и незавершенная каудо-ростральная волна (из люмбосакрального НГ). Самые последние исследования показали, однако, что клетки люмбосакрального НГ не проникают в заднюю часть кишечника до тех пор, пока не произойдет его заселение клетками вагального НГ (см. ниже).

Клетки люмбосакрального происхождения всегда встречаются в сплетении симпатического нерва (Ауэрбаховском сплетении) и их относительно немного в подслизистом сплетении. Кроме того, доля клеток ЭНС, имеющих происхождение из люмбосакрального НГ относительно невелика и уменьшается в ростральном направлении. Например, в наиболее дистальной части Ауэрбаховского сплетения, менее 20% нейронов имеют люмбосакральное происхождение. В более ростральном отделе, ближе к слепой кишке доля таких клеток уменьшается до 2%, а в дистальной части тонкого кишечника их уже только 0,5% (27). Клетки, имеющие происхождение из люмбосакрального НГ, никогда не обнаруживаются в областях кишечника ростральнее области пупка.

Недавние работы с использованием трансгенных маркеров и тканевых рекомбинантных пересадок подтвердили, что происхождение ЭНС дистального кишечника у мышей совпадает с тем, что было найдено для птиц. Т.о., в дополнение к вагальным клеткам, люмбосакральные клетки НГ вносят существенный вклад в развитие дистальных отделов ЭНС у позвоночных. Но люмбосакральные клетки менее многочисленны и заселяют кишечник только после того, как произошло его заселение вагальными клетками НГ. Из изученных позвоночных не обнаружен люмбосакральный источник у зебровых рыб (персон. сообщение), хотя вагальный источник ЭНС у них присутствует.

Люмбосакральный источник некоторых клеток ЭНС был подтвержден и в ряде других работ, но их результаты отличались от результатов, полученных ранее. В одном из исследований авторы пришли к заключению, что люмбосакральный источник имеется у птиц. В качестве маркера они использовали HNK-1 куриного эмбриона. Авторы обнаружили каудо-ростральную волну продвижения HNK-1-экспрессирующих клеток, мигрирующих вдоль заднего кишечника еще до того, как клетки вагального НГ достигнут районов своего заселения. И хотя это совпадает с представлениями о люмбосакральном дополнительном источнике клеток ЭНС, возникает четыре вопроса. Первый - временные показатели значительно отличались от показателей, описанных в предыдущих работах, поэтому авторы, вероятно, описали другие клетки. Второй - при использовании практически того же метода, Tucker с соавт. не обнаружили волны HNK-1 меченых клеток. Третий - ранние клетки в задней части кишечника, наблюдаемые Pomeranz и Gershon не экспрессировали другие маркеры, не сходные с другими маркерами клеток НГ в ЭНС. Четвертое - число HNK-1- меченых клеток значительно превосходило то, что требуется для ЭНС и метка обнаруживалась также в мезенхиме кишечника. Вероятно, все это ограничивает использования HNK-1 антител. Клетки мезенхимы заднего кишечника у куриного эмбриона метятся HNK-1 антителами, то же самое наблюдали у эмбрионов крыс.

Куриные и перепелиные клетки нервного гребня метятся одинаково HNK-1, но у куриного эмбриона антителами метились также клетки мезенхимы заднего кишечника. Задний кишечник эмбрионов, исследованный Tucker, не обнаружившим там люмбосакральных клеток, были перепелиными, а Pomeranz и Gershon проводили исследования куриных эмбрионов. Следовательно, большинство или все HNK-1 меченые клетки являются, скорее всего, мезенхимными клетками заднего кишечника. Настоящие люмбосакральные клетки НГ заселяют кишечник позже и в меньшем числе.

Другое исследование, доказывающие, что сакральные клетки могут быть источником энтерических нейронов, было проведено на мышах с помощью микроинъекций DiI флуоресцентной метки в нейральный зачаток эмбриона, развивающегося в цельной культуре. Как и у птиц, число меченых клеток, входящих в кишечник, было небольшим в сравнении с их количеством из вагального НГ. Однако были обнаружены резкие различия временного паттерна между птицами и мышами и это является результатом того, что меченые клетки вступают в задний кишечник без задержки и даже еще до вагальных клеток. Кроме того, меченые клетки присутствовали в энтодерме заднего кишечника, которая в норме не является мишенью клеток НГ. Таким образом, хотя и было доказано, что определенные клетки ЭНС происходят из клеток-предшественников сакрального НГ, часть доказательств могла оказаться артефактом. Частично это может быть обусловлено несовершенством методов исследования.

Органные культуры in vitro указывали на присутствие предшественников нейронов в эксплантате мышиного кишечника, выделенного на 9 день эмбрионального развития (Е9), т.е. еще до того, как там произошла колонизация клетками вагального НГ. Соответственно было сделано заключение, что, что эти нейроны произошли из клеток сакрального нервного гребня и заселили заднюю часть кишечника без задержки. В связи с результатами этого исследования также возникает несколько вопросов. Во-первых, клетки сакрального НГ не начинают миграцию к Е9 у мышей. Вероятно, здесь имелось некоторое несоответствие в сроках эмбрионального развития мышей и в органной культуре это скорее всего была стадия Е10. Во-вторых, эти результаты противоречат данным очень сходных экспериментов, при которых кишечник мыши был выделен и выращен не в органной культуре мышиного эмбриона, а в почечной капсуле той же взрослой мыши. В этих экспериментах никаких доказательств присутствия ЭНС клеток в заднем кишечнике до Е11 получено не было. Чтобы как-то объяснить эти различия, было замечено, что развитие кишечника шло нормально при использовании метода «почечной капсулы» и аномально в органной культуре. Предполагают, что при использовании второго метода, сам метод способствует дифференцировке клеток НГ в нейроны, что не происходит в норме. Такая артефактная экспрессия нейронального фенотипа была описана в исследованиях in vitro. Однако недавно был разработан метод органной культуры, при котором развитие кишечника протекает относительно нормально. Его применение подтвердило, что предшественники ЭНС не заселяют задний кишечник на таких ранних стадиях. Некоторые авторы предполагают, что происходит контаминация интестинальными предшественниками Ауэрбаховского сплетения, расположенного вблизи, но не в самом заднем кишечнике. Такой контаминации избежать крайне трудно, т.к. полная изоляция заднего кишечника от прилегающих к нему pelvic body стенки на стадии Е9-10 затруднительна.

Общее заключение - люмбосакральный НГ является источником нейронов и глиальных клеток ЭНС. Эти клетки составляют малую часть всех нейронов ЭНС и локализуются в более дистальных отделах кишечника. Этот источник нейронов ЭНС высококонсервативен у высших позвоночных животных.

Стволовой (трункальный) нервный гребень как источник нейронов ЭНС

Данные этих исследований крайне противоречивы. Используя DiI для изучения миграции клеток НГ у эмбрионов мышей Durbec с соавт. (Development 1996;122:349-358) предположили, что нейроны ЭНС возникают из НГ на уровне 6-7 сомитов, которые рассматривают как наиболее ростральный стволовой сегмент (цервикальный), расположенный каудальнее вагального НГ. В двух работах на птицах показано, что эзофагеальные нейроны не являются потомками клеток вагального НГ. Установлено также, что энтерические нейроны развивались в пищеводе даже после удаления вагального НГ. Сходны данные получены в работе, где использовали ретровирусные маркеры, которые инъецировали в вагальные сомиты куриного эмбриона. Метка была обнаружена у очень небольшого числа клеток в эзофагусе. Метод основан на том, что клетки вагального НГ должны пройти через вагальные сомиты, чтобы достичь кишечника. Инъекции ретровирусов, кодирующих репортерный ген lacZ в индивидуальные вагальные сомиты живых эмбрионов, метили клетки НГ en passant. Однако в недавней работе было показано, что клетки НГ, прилегающие к сомитам 1-2 (т.е. на ростральном вагальномй уровне) дают начало многим нейронам пищевода. И совсем небольшое число нейронов пищевода происходит из НГ, прилегающего к сомитам 3-4. Почти никаких эзофагеальных нейронов не происходит из НГ, прилегающего к сомитам 6 и 7.

Такие различия могут быть обусловлены временными показателями. Вполне возможно, что во всех работах манипуляции для выявления клеток НГ, предназначенных для заселения пищевода, выполнялись слишком поздно. Они, согласно Burns с соавт., должны эмигрировать раньше других клеток вагального НГ. Отсутствие ретровирусных маркеров, инъецированных в сомиты для мечения эзофагеальных нейронов также может указывать на маловероятность того, что клетки НГ, колонизирующие эзофагус, не проходят через сомиты.

Различия могут быть связаны и с видовыми особенностями развития животных (птиц и мышей) и с методами исследования. В связи с этим необходимы дальнейшие исследования.

Преспециализация нервного гребня при формировании ЭНС

НГ на среднем вагальном уровне (против сомитов 3-5) вносит основной вклад в развитие ЭНС. Однако почти на всем протяжении оси НГ продуцирует широкий спектр различных производных. Например, клетки НГ более ростральной части вагальной области дают начало клеткам, формирующим не только ЭНС, но и сердечные ганглии, и вносят определенный вклад в образование сенсорных ганглиев черепных нервов IX и X и соединительную ткань heart outflow tract (Рис. 1В). Более каудальная часть вагального НГявляется источником клеток наиболее ростральных дорсальных корешковых ганглиев шейного отдела, а также верхних цервикальных симпатических ганглиев. В то же время разные уровни НГ не вносят никакого вклада в специфические производные НГ. Например, вагальный НГ не является источником адреномедуллярных клеток, а НГ среднего торакального уровня не является источником ЭНС.

Считается, что в основном индивидуальные клетки НГ в пределах какого-то одного аксиального уровня и между аксиальными уровнями, являются изначально мультипотентными и неспециализированными и что именно они получают информацию, которая «руководит» их специфической дифференциацией, от эмбрионального окружения во время миграции, особенно на ее конечных этапах . Являются ли вагальный и люмбо-сакральный НГ преспециализированными в образовании ЭНС? В основном исследователи склоняются к тому, что вагальный НГ имеет ЭНС-формирующие способности, по сравнению с более каудальными уровнями зачатка. Эксперименты по трансплантации торакального нейрального примордия (который в норме не участвует в формировании ЭНС) на место вагального примордия, и наоборот, в системе куриных и перепелиных эмбрионов показали, что клетки торакального НГ, имплантированные в область вагального уровня мигрировали и заселяли переднюю кишку, но не весь кишечник. Т.е. они обладали более низкой способностью, чем вагальные клетки в снабжении нервными клетками ЖКТ. В отличие от этого вагальные, клетки, трансплантированные в область торакального уровня, достигали и заселяли кишечник. Эти результаты заставили провести исследования по совместному культивированию различных частей нейрального зачатка птиц с лишенной нейронов ободочной кишкой. Показано, что вагальный домиграционный зачаток дает в 50 раз больше нейронов ободочной кишки по сравнению с цервикальным, торакальным или люмбосакральным уровнями, в то время как trunk (стволовой) уровень обеспечивает появление многочисленных меланоцитов. Такие различия не абсолютны. Эксперименты Le Douarin и Teillet указывают на большие способности вагальных клеток в заселении отдаленных областей ЖКТ, даже из аномальных исходных позиций. Результаты экспериментов co-culture, напротив, указывают на значительные способности вагальных клеток НГ, предназначенных для ободочной кишки, к выживаемости, пролиферации или дифференцировке, т.к. клетки и вагального, и не вагального НГ достигали нормального положения в ЭНС.

Полученные данные подтверждают, что способность продуцировать клетки ЭНС очень высока, и не только предшественниками вагального НГ, но и клетками более рострального уровня, и даже краниального уровня, которые в норме не вносят никакого вклада в развитие ЭНС. В кишечнике крайне небольшое число клеток ЭНС могут быть сформированы областью НГ, расположенной каудальнее вагального уровня. В большинстве описанных экспериментов ЭНС-формирующую способность тестировали, главным образом, в заднем кишечнике. Точно так же в экспериментах LeDouarin и Teillet пересадки транкального НГ в область вагального уровня не подтвердили факт развития ЭНС в заднем кишечнике эмбриона, которому была произведена пересадка. Однако наиболее ростральная часть кишечника, очевидно, имеет многочисленные клетки, происходящие из транкального НГ. Возникает вопрос, может ли передний кишечник эффективно осуществлять дифференцировку клеток, происходящих из всего НГ, в то время как задний кишечник не является эффективным индуктором ЭНС для области НГ, расположенной каудальнее вагального уровня. Возможность ростокаудальных различий в ткани кишечника реципиента в развитии ЭНС, также как и ростокаудальных различий в донорских клетках НГ в формировании ЭНС не проверялась.

Вагальный НГ по определению Yntema и Hammond охватывает больше семи сегментов, но возможно, что некоторые участки в пределах этой области имеют важные для происхождения ЭНС различия. Доказательства против этого утверждения были получены в экспериментах с использованием инъекций lac-Z -ретровирусных маркеров, которые позволили установить вклад в развитие ЭНС «субрегионов» вагального НГ . Этот метод предполагает, что клетки НГ в каждом сомите происходят из области нервной трубки, расположенной ближе всего к этим сомитам. Инъекции маркеров в индивидуальные сомиты вагального НГ позволили пометить клетки для последующего исследования. Показано, что подавляющее большинство энтерических нейронов возникает из клеток НГ, которые мигрируют через сомиты 3-6. Это исследование также показало, что ЭНС в каждом регионе ЖКТ имеет смесь клеток разных уровней в пределах вагального НГ, что не подтверждает существование тесной связи определенного уровня в происхождении клеток в пределах вагального уровня НГ и области ЖКТ, в которую эти клетки позднее вносят свой вклад

Специализирован ли люмбо-сакральный уровень (как и вагальный уровень) в образовании ЭНС? Клетки цервикального и торакального НГ в норме не мигрируют вентрально в ЖКТ, как это делают клетки люмбо-сакрального уровня. Erickson и Goins трансплантировали перепелиный торакальный нейральный зачаток на место куриного люмбосакрального нейрального зачатка и наоборот. Они обнаружили, что клетки НГ обоих уровней могут достигать кишечника, если имплантировались люмбо-сакрально, и не достигали, если имплантировались на торакальные уровни. Авторы заключили, что способность достигать определенной области кишечника не имеет отношения к врожденным различиям между люмбосакральным и торакальным уровнями, а связана скорее с относительно более коротким расстоянием между нейральным зачатком сакральных уровней и задним кишечником. Кроме того, когда торакальные и люмбосакральные нейральные зачатки птиц объединяли с анейральным задним кишечником и трансплантировали в хориоаллантоисную оболочку эмбриона хозяина, оба доставляли несколько нервных клеток в энтерические сплетения, хотя в гораздо меньшем количестве, чем в тех случаях, когда вагальный зачаток был донором ЭНС. Т.о., в настоящее время нет убедительных доказательств, подтверждающих, что популяция клеток люмбосакрального НГ перед миграцией специализирована в отношении формирования клеток ЭНС.

В кишечнике ЭНС клетки, происходящие из люмбосакрального НГ, были более многочисленны в ткани дистальной части кишечника (дистальной толстой кишке), чем в ткани более ростральной части. Это свидетельствует в пользу того, что имеется специализация наиболее дистальных уровней кишечника для дифференцировки ЭНС из клеток люмбосакрального НГ.

Доказательства о специализации вагального уровня в образовании ЭНС получены с помощью экспериментов на клеточных популяциях. Каким образом такая специализация достигается на клеточном и молекулярном уровнях - неизвестно. Предполагают, что это может быть связано с пространственно ограниченной различной экспрессией разных паттернированных генов вдоль заднего мозга. На первом месте стоят гены Hox, которые в специфически различных областях могут быть идентичными вдоль спинного мозга. Однако некоторые другие гены (например, Ret у куриных эмбрионов, см. GDNF -RET-GFRα1 сигнальные системы экспрессируются в спинном мозге во время, когда происходит преспецификация для краниального уровня, включая вагальный уровень. Знания генетических основ преспециализации, которая благоприятствует вагальным клеткам как источникам клеток ЭНС, необходимы для исследований патологических основ отсутствия нейронов в некоторых областях кишечника.

Развитие и функциональное несходство клеток ЭНС, происходящих из вагального и люмбосакрального НГ

Развитие двух популяций клеток ЭНС протекает по-разному. Вагальные клетки дают начало клеткам ЭНС в большом числе на протяжении всего кишечника, люмбосакральные клетки заселяют преимущественно дистальные отделы кишечника в небольшом количестве. Люмбо-сакральные клетки получают транзиторный сигнал из заднего кишечника, которые игнорируются вагальными клетками. Объяснения таких различий на молекулярном уровне пока нет. Однако один эксперимент подтвердил специфические различия. Нокаут по гену, кодирующему gfrα1 у мышей приводил к отсутствию всех нейронов в среднем и заднем кишечнике, за исключением нескольких клеток в дистальной части прямой кишки. Предполагая, что эти клетки являются люмбосакральными производными, эти результаты указывают на то, что вагальные клетки абсолютно зависят от GDNF/Ret сигнальной системы, а сакральные - нет.

Вагальные производные клетки ЭНС формируют широкий спектр дифференцированных типов нейронов и клеток глии, которые почти все представлены в кишечнике. Однако консервация во время эволюционного процесса источника из люмбосакрального НГ, который и менее многочисленнен и ограничен определенными регионами в кишечнике, подтверждает, что функции, выполняемые этой группой клеток ЭНС, необходимы и не могут быть обеспечены вагальным источником клеток. Возможно, что общий паттерн интестинальной подвижности может быть достигнут определенными клеточными типами connectivity паттернами вагальных клеток. Однако в терминальной части кишечника этот паттерн может быть модулирован для процесса дефекации и это может быть достигнуто перекрыванием различных клеток ЭНС люмбосакрального происхождения. Необходимы более подробные сведения о распределении, связях, электрофизиологии и нейротрансмиттерных особенностях вагальных и люмбосакральных клеток ЭНС в прямой кишке для понимания этого вопроса. Burns с соавт. обнаружили, что, по крайней мере, несколько нейронов, имеющих происхождение из люмбо-сакрального НГ содержат синтазу оксида азота (NOS). Однако NOS нейроны присутствуют во всем ЖКТ, включая передний кишечник и, т.о., нейроны этого класса могут произойти и из вагального и из люмбосакрального НГ.

Независимость вагальных и люмбосакральных источников ЭНС

Невозможность определения люмбосакральных производных клеток ЭНС при отсутствии вагальных клеток и постоянная задержка входа люмбосакральных клеток в кишечник до того момента, пока его не заселят вагальные клетки, подтверждает существование некоторой зависимости первых от вторых. Возможен такой сценарий - вагальные клетки поддерживают люмбосакральные тропически или трофически. В поддержку такого предположения свидетельствуют данные о «спасении» мутантных ЭНС предшественников нормальными клетками ЭНС у химерных мышей. Возможна и конкуренция между нервными клетками за target-derived трофическую поддержку. Можно предположить, что удаление вагального источника ЭНС популяции приведет к увеличению люмбосакральной популяции. Эта гипотеза проверялась и была отвергнута исследователями, применявшими разные методы исследования, включая пересадки, удаления кусочков, рекомбинантные пересадки у птиц и мышей. Во всех этих экспериментах клетки люмбо-сакрального НГ формировали нейроны и глию в кишечнике в отсутствие вагальных клеток. Количественно люмбосакральные клеточные популяции не показали ни уменьшения числа клеток (из-за отсутствия вагальных клеток), ни их увеличения (как компенсация вагальных клеток). Однако в настоящее время неизвестно, существует ли качественные изменения в типах нейронов, продуцируемых люмбосакральным НГ или их паттернах иннервации, в отсутствие клеток вагального гребня.

Миграция клеток нервного гребня в ЖКТ

Клетки вагального нервного гребня

Имеется «расписание» ростокаудальной миграции клеток вагального НГ в кишечник, на что указывают результаты исследований на куриных эмбрионах, мышах и крысах. У человека расписание миграции вагальных клеток выявлено при гистологических исследованиях. Эти миграционные этапы суммированы в Таблице 1.

Начальная миграция предшественников ЭНС производных вагального НГ.

Миграция предшественников ЭНС (Рис.1В) до входа в кишечник описана плохо. В тканях на уровне семи ростральных сомитов, имеются три возможных пути из вагального НГ в кишечник. Дорсо-латеральный путь встречается в свободном от клеток внеклеточном матриксе (cell-free extracellular matrix, ECM) между эпидермисом и сомитами. А вентральный путь присутствует в межсомитных пространствах и через мезенхиму склеротомальной области сомитов. У птиц клетки НГ обнаружены на всех путях., но большинство клеток НГ вероятно достигают переднего кишечника посредством вентрального пути миграции через сомиты 3, 4 и 5, каудальнее жаберных дуг с некоторым продвижением через жаберную дугу 6. Эти клетки вагального НГ, мигрирующие в сомиты, ограничиваются ростральной половинкой каждого сомита (Рис.1В). В торакальных сомитах преимущество для ростральных половинок сомитов достигается присутствием в каудальных половинках сомитов репульсивных молекул.

Далее вентральная миграция формирует так называемый circumpharyngeal гребень, очень сложный паттерн большого числа клеток гребня, который будет распределяться не только в ЭНС, но также и как предшественники нервной и соединительной ткани в кардиальной области и в сенсорных ганглиях, особенно в glossopharyngeal (IX) и vagus (X) cranial nerves, и в верхний цервикальный симпатический ганглий (Рис.1В). Время достижения первых клеток вагального НГ до ближайшего участка кишечника наиболее короткое у птиц. Первые клетки покидают вагальный уровень НГ на стадии 7-10 сомитов и авангард предшественников ЭНС появляется в кишечнике на стадии 13 сомитов. Это занимает менее 9 часов.

Клетки вагального НГ должны двигаться вентрально к кишечнику и к удивлению не требуется никаких каудально направленных передвижений вдоль кишечника для заселения всего пространства переднего кишечника - т.е. кишечного зачатка, продуцирующего эзофагус, желудок и 12-перстную кишку на уровне желчного хода. Ближе к переднему кишечнику клетки НГ формируют левые и правые strings (волокна), которые формируются вдоль путей после вагальных аксонов ЦНС, перед тем как они войдут в ближайшую мезенхиму кишечника. Возможно, что эти вагальные клетки не сразу входят в мезенхиму кишечника, а через некоторую паузу. Сходная задержка во вхождении клеток в кишечник происходит с люмбо-сакральными клетками, примыкающими к заднему кишечнику.

Миграция предшественников ЭНС, производных вагального НГ, в средний и задний кишечник.

В средний кишечник клетки вагального нервного гребня мигрируют продольно в пределах мезенхимы кишечника. У эмбрионов птиц волновой фронт клеток НГ продвигается со скоростью около 40 мкм/час. Мигрирующие клетки имеют высокую плотность, которая сохраняется для того, чтобы волновой фронт клеток позже опустился почти отвесно (Рис.2). Клетки в этих мигрирующих популяциях имеют межклеточные контакты, которые осуществляются через клеточные отростки (Рис.3). На этой стадии мезенхима формирует однородную и плотную популяцию клеток между энтодермальной трубкой внутри и серозным слоем плоского эпителия, который окружает кишечник снаружи. Во время их миграции, клетки НГ обнаруживаются во внешней мезенхиме, но вскоре после колонизации клетки формируют тонкий слой, состоящий их 1-2 клеточных слоев серозы, на месте будущего миэнтерического сплетения (Рис.4). Причина такого предпочтения для дискретных скрытых слоев неизвестна, но хондроитин сульфат протеогликан. (который отвергается клетками НГ) наиболее сильно экспрессируется в мезенхиме, ближе к эндодерме. Это распределение дает возможность подсчитать расстояние, сохраняющееся между клетками НГ и эндодермой. Однако число известных молекул, привлекающих или отталкивающих клетки НГ, недостаточно и вероятно в кишечнике будут обнаружены дополнительные молекулы, указывающие на точное положение клеток НГ. Эти молекулы могут быть под контролем Sonic hedgehog, продуцируемых эндодермой, которые, как оказалось, влияют на радиальное паттернирование кишечника.

Хотя будущая миэнтерическая область заселяется вскоре после прибывания клеток. производных НГ, эти клетки не обнаруживаются в области подслизистого сплетения до более поздних стадий и неясно, возникают ли они в результате вторичной центростремительной миграции из локальных миентерических клеток или отдельной продольной волны иммиграции.

Начальная иммиграция вагальных клеток в задний кишечник несколько отличается от таковой в средний кишечник. Клетки волнового фронта заселения заднего кишечника распределены более диффузно, чем в среднем кишечнике и только постепенно волновой фронт клеток становится более плотным. Кроме того, Burns и LeDouarin показали, что у эмбрионов птиц вагальная волна, продвигающаяся в задний кишечник, важна для образования слоев кишечника, внутренних по отношению к слою кольцевой гладкой мышце, т.е. в положении подслизистого сплетения. Из этого слоя позже, благодаря цетробежному расселению, клетки оказываются в более периферическом миэнтерическом слое, между кольцевым и продольным мышечными слоями. Однако в заднем кишечнике мышиных эмбрионов клетки вагального НГ заселяют миэнтерическую область до того как заселят подслизистую.

Клетки люмбосакрального НГ

Расписание каудо-ростральной миграции клетками люмбо-сакрального НГ у птиц, вероятно, такое как было описано Burns и LeDouarin. Сообщалось о значительных различия между таким расписанием у птиц и мышей, но возможно, что имели место и артефакты. Данные о миграции люмбосакральных клеток представлены в Табл.1

Миграция ЭНС предшественников, производных люмбосакрального НГ.

Эти клетки мигрируют вентрально через ростральные половинки соседних склеротомов сомитов в ближайшую область к клоаке (расширенному заднему отделу кишечника). У эмбрионов мышей эти клетки формируют ганглии тазового сплетения. У куриных эмбрионов они образуют не только тазовое сплетение, но и nerve of Remak. Последний представляет собой цепочку ганглиев в дорсальном мезентерии, соседствующим с кишечником. Он распространяется рострально из клоаки, чтобы в конце концов достичь области пупка. Клетки люмбо-сакрального НГ у мышей и птиц делают «остановку» в тазовом сплетении и в nerve of Remak на продолжительное время (до 4 дней у птиц, пятого эмбрионального периода) перед вхождением в задний кишечник, распределяясь, главным образом, в ганглиях миэнтерического сплетения, где они перемешиваются с клетками вагального происхождения. Сейчас пока трудно оценить (у птиц) мигрируют ли люмбосакральные клетки рострально в пределах мезенхимы ободочной кишки или их ростральные передвижения происходят вне кишечника в nerve of Remak. У мышей stepping stone для сакральных клеток НГ, предназначенный для ободочной кишки, расположен каудальнее тазового сплетения, поэтому ростральное распространение этих клеток должно достигаться посредством миграции в пределах мезенхимы ободочной кишки.

Почему у люмбо-сакральных клеток имеется задержка вхождения в задний кишечник?

Задержка входа в задний кишечник люмбосакральных клеток, несмотря на близость их расположения к поверхности кишечника, может быть обусловлена отсутствием promotive молекул клеточной миграции в заднем кишечнике (или их рецепторов на поверхности клеток НГ) и/или ранним присутствием репульсивных сигналов. Эта задержка отражается идентичной задержкой во «врастании» аксонов нейронов автономной нервной системы, происходящих из люмбосакрального НГ, в nerve of Remak. В случае задержки аксонов, эксперименты с использованием in situ гибридизации и in vitro гибридизации показали, что за это ответственен секретируемый белок семафорин-3А (collapsing-1). Эта молекула индуцирует коллапс конуса роста аксона и прекращает рост аксона. Семафорин-3А продуцируется мезенхимой кишечника на стадии до входа аксона, но его секреция снижается и совпадает с врастанием аксона. Кроме того, подавление образования семафорина-3А вызывает преждевременное врастание аксона. Сообщалось также, что семафорин-3А влияет на локомоцию клеток краниального НГ in vitro. Таким образом, возможно, что семафорин каким-то образом влияет на задержку входа люмбосакральных клеток в задний кишечник. Вероятно, любые сигналы, предотвращающие колонизацию заднего кишечника люмбо-сакральными клетками, оказываются неэффективными в отношении вагальных клеток НГ.

Факторы ЖКТ, влияющие на миграцию клеток НГ

Meijers с соавт. получили куриный безнейронный (анейронный) кишечник и затем попытались заселить его более зрелой тканью с клетками-предшественниками ЭНС. Они обнаружили, что хотя заселение может происходить на более поздней стадии, чем в норме, способность поддержки миграции снижена. Гистодифференцировка кишечника кур и крыс происходит в ростокаудальной (оро-анальной) волной, которая сталкивается с каудоростральной волной. Т.о., в заднем кишечнике микроокружение, сталкивающееся с мигрирующей волной вагальных клеток НГ, имеет преимущества в продвижении по сравнению с микроокружением, сталкивающимся с вагальными клетками в среднем кишечнике. В этой области куриных и крысиных эмбрионов мезенхима кишечника -- это не более чем удлиненное однородное скопление клеток, а не расслоившаяся мезенхима кишечника (на соединительную ткань и слои гладких мышц). На самом деле, к тому моменту, когда вагальные клетки уже достигают терминальной ободочной кишки, волновой фронт проникает глубоко в кишечник, который уже достаточно полно сформирован в отношении своей структуры по сравнению с ростральным уровнем. Эти различия в стадиях развития ткани могут играть роль в снижении скорости продвижения волны, когда она достигает заднего кишечника. Кроме эффекта задержки созревания кишечника, сходные эксперименты, сравнивающие способность клеток НГ колонизировать пересаженный кишечник без ЭНС и пересаженный с ЭНС показали, что присутствие клеток ЭНС снижает способность кишечника принимать иммиграцию новых предшественников нейронов.

Причастность роста кишечника к миграции ЭНС предшественников

Ростокаудально направленная колонизация ЖКТ клетками, являющимися производными вагального НГ происходит сложно, так как миграционная поверхность (которая конечно является цилиндрической, обернутой вокруг кишечной трубки) сама по себе увеличивается в размерах. Для кишечной трубки, особенно ее отрезка от duodenum до ileum, наиболее сильное увеличение обусловлено элонгацией, но в некоторых областях, таких как область желудка и ободочной кишки, кишечник расширяется. Предварительные попытки измерить этот рост были проделаны на эмбрионах перепела, крыс и мышей. Рост кишечника происходит неравномерно, скорее он растет скачкообразно - от относительно медленного до крайне быстрого роста. Начало фазы быстрого роста прогрессирует каудально вдоль кишечника. В preumbilical среднего кишечника рост становится нормальным после появления там клеток, являющихся производными вагального НГ. Но пока нет доказательств, что именно клетки НГ индуцируют этот рост. Более каудально, в postumbilical среднем кишечнике лаг-период между появлением клеток НГ и началом быстрого роста меньше. А в заднем кишечнике, особенно в его дистальной части, клетки НГ проникают в ободочную и прямую кишки, когда у них начинается самая быстрая фаза роста. В этом эффекте клетки НГ, мигрирующие вдоль среднего кишечника своевременно будут прибывать элонгационной волной, в то время как в дистальный отдел заднего кишечника они должны следовать за ростом кишечника. Если миграция задерживается, клетки стараются опередить скорость, с которой отдаляется от них терминальный кишечник. Наблюдения волны клеточной миграции в кишечнике Sl мышей соответствует этому сценарию и указывают, что волна предшественников нейронов у этих мутантных животных продолжает мигрировать даже после срока нормального завершения, но еще не достигнув прямой кишки.

Дифференцировка ЭНС

Разные типы энтерических нейронов различаются по направлению проекций аксонов (оральное, анальное, радиальное, периферическое), аксонным мишеням (другие энтерические нейроны, гладкая мускулатура и т.д.) и используемыми ими нейротансмиттерам. Из-за определенной сложности организации ЭНС, большого числа нейрональных и глиальных фенотипов клеток и их важности, работ, описывающих события следующие после начала заселения кишечника явно недостаточно. У птиц и млекопитающих дифференцировка первых нейронов ЭНС происходит достаточно рано, так как клетки с признаками дифференцировки (наличие аксонов или экспрессия специфических белков) встречаются вблизи фронта миграционной волны клеток НГ. Несмотря на такую очень раннюю дифференцировку некоторых клеток, пул клеток-предшественников персистирует в ЭНС достаточно долго, на что указывает увеличение числа энтерических нейронов вплоть до рождения или вылупления из яйца. Таким образом, новые нейроны добавляются к уже прошедшим дифференцировку.

Реорганизация клеточного распределения, начиная от миграции и до образования ганглиев ЭНС проходит относительно быстро. Группы нервных клеток (т.е. ганглиев) появляются в среднем кишечнике мышей через 2-3 дня после первого появления там клеток. Но еще раньше выявлены отдельные дифференцированные клетки, имеющие ориентированные проекции аксонов. Предполагали, что в формировании ЭНС (из миграционной популяции клеток) участвует рецептор ламинина (110 kDa М.в.), дающий возможность клеткам воспринимать молекулу ламинина ECM как сигнал к дифференцировке.

Первые нейроны ЭНС являются катехоламинергическими, как у мышей, так и у крыс, но эти нейротрансмиттеры транзиторны. Катехоламинергические нейроны не были найдены в ЭНС птиц. По крайней мере, некоторые из этих клеток становятся nitrergic, что было продемонстрировано присутствием NOS, синтетического фермента оксида азота. Эти клетки простирают свои аксоны очень быстро, с ростовыми конусами, находящимися среди волнового фронта недифференцированных мигрирующих клеток. Сначала аксоны этих клеток проецируются в анальном направлении, и это соответствует проекционному паттерну NOS ингибиторных нейронов у взрослых животных, хотя в это время аксоны являются катехоламинергическими. Изменения нейротрансмиттерного типа для других типов нейронов не описаны. Более того, пространственные и временные связи между дифференцировкой нейронов и приобретением паттерна проекций аксонов для других нейронов ЭНС также не описаны.

Некоторое число разных трансмиттерных типов локализовано в развивающейся ЭНС. У мышей, кроме транзиторных аминергических/nitrergic клеток описанных выше, показано, что холинергические, серотонинергические (5-НТ) и нейропептидные Y нейроны дифференцируются на стадии Е12, через 2 дня после начала образования популяции. Позднее появляется ряд других пептидергических нейронов. У эмбрионов птиц соматостатиновые и vasoactive intestinal peptide (VIP) иммуннореактивные клетки появляются сначала бимодально, в области желудка цыпленка на Е4 и Е5.5 соответственно и в слепой кишке на 1,5 дня позже, т.е. раньше появления пептидергических клеток у грызунов. Эти клетки дифференцируются позже на уровне кишечника ближе к этим центрам до тех пор, пока они не распространятся по всему кишечнику к стадии Е11.5 (соматостатин) и Е13,5 (VIP). Однако на всех стадиях развития соматостатин встречается редко в proventriculus (секреторная часть желудка птиц). Met-enkephalin и substance P содержится в нейронах примерно на тех же стадиях развития. В целом миэнтерическое сплетение становится иммунореактивным для пептидов на 3-5 дней раньше, чем подслизистое сплетение, а волокна в кольцевой мышце и подслизистой выявляются несколькими днями позже (J Neurosci 1983;3:2431-2447) Максимальное число VIP клеток у куриного эмбриона наблюдали на стадии Е15.5. после чего следовало их снижение. Неясно, обусловлено ли это гибелью клеток и происходит ли снижение числа других типов клеток в ЭНС. Стадии, на которых различные типы нейронов останавливают деление, были исследованы у мышей при введении Н3-тимидина беременным самкам. Позже меченые клетки были типированы иммунологически на присутствие трансмиттеров у эмбрионов и у неонатального потомства. Обнаружено, что предшественники некоторых холинергических и серотонинергических нейронов были уже постмитотическими на стадии Е8. Эти клетки, вероятно, были или премиграторными или находились на очень ранней стадии миграции, локализуясь еще вне кишечника. Первые пептидергические нейроны прекращали клеточный цикл позднее, на стадии Е10,. когда первые клетки уже входили в кишечник. Однако у каждой популяции клеток свое время ухода из митотического цикла, и весь этот период составляет больше 7 дней. У куриного эмбриона VIP нейроны proventriculus прекращают деление на стадии Е3-Е10 и время между выходом из митоза и появлением VIP значительно варьирует, от 2 до 10 дней.

Все эти данные указывают, что дифференцировка нейронов ЭНС не идет параллельно со временем прибывания нейронов в кишечник, и что имеется региональная специализация по длине кишечника и между двумя сплетениями ЭНС. Имеются также некоторые видовые различия при ранней дифференцировке -- во времени выхода клеток из митоза и времени появления нейротрансмиттеров, имеющих отношение к нейротрансмиттерным типам клеток, т.к. существует значительное перекрывание во времени для разных популяций нейронов ЭНС.

Понимание процесса появления разных типов нейронов и нейронных цепей крайне важно, т.к. некоторые не-HSCR аномалии функций кишечника могут быть связаны с изменениями этих свойств. Среда кишечника может повлиять на ряд фенотипов, которые могут экспрессировать нейроны, произошедшие из НГ. Например, окружение кишечника, оказывается, подавляет экспрессию катехоламинергических свойств. Кроме того, эксперименты, в которых постмиграторные клетки (производные НГ) были изолированы и затем трансплантированы обратно в миграционные пути эмбриона, находящегося на более ранней стадии развития, показали, что, хотя клетки - производные кишечника, могут мигрировать и оседать в сенсорных или симпатических ганглиях, они не экспрессируют нужный фенотип. И хотя окружение кишечника ограничивает репертуар фенотипов, которые могут приобрести энтерические нейроны, в настоящее время мало известно о молекулярных механизмах, лежащих в основе образования разных типов энтерических нейронов. Во время развития фенотип, по крайней мере, некоторых автономных нейронов детерминируется таргетированной тканью. Однако в кишечнике разные типы нейронов часто иннервируют одну и ту же ткань. Например, кольцевая мышца иннервируется и холинергическими нейронами, и nitrergic нейронами. Возможно, что разные типы энтерических нейронов могут быть генерированы в ответ на сигналы, поступающие из ткани-мишени. В настоящее время единственным сигнальным путем, принимающим участие в генерировании специфических типов энтерических нейронов, является GDNF family member neurturin, действующий на рецепторный комплекс gfrα2 и Ret. Мыши с отсутствием neurturin или gfrα2 имеют сниженное число энтерических холинергических нейронов по сравнению с мышами дикого типа (Neuron 1999;22:243-252.). Транскрипционный фактор Mash1 также важен для образования специфических типов энтерических нейронов, потому что Mash1-/- мыши не имеют 5-НТ (серотонин)-содержащих нейронов (Development 1996;122:309-320).

Гены, участвующие в развитии ЭНС и возникновении HSCR

Мутации или делеции ряда генов могут вызвать HSCR-подобную патологию. (Parisi MA, Kapur RP. Genetics of Hirschsprung disease.Curr Opin Pediatr 2000;12:610-617), но связь между генотипом и фенотипом не абсолютна. В настоящем обзоре показано, что генные продукты воздействуют на «социальное» поведение клеток прямо или косвенно. И это является следствием измененного «социального» поведения на уровне клеточной популяции, что приводит к нормальному или аномальному морфогенезу ЭНС.

Влияние числа клеток НГ на клеточную миграцию

Использование in vitro моделей позволило подсчитать число клеток вагального НГ, мигрирующих на начальной стадии - у эмбриона птиц их всего несколько тысяч. Их число во время и в конце миграции неизвестно, хотя размер популяции увеличивается многократно. Частичное удаление вагального НГ до миграции приводило к HSCR-подобному дистальному аганглионозу. Чувствительность к частичному удалению неизвестна, но вероятно, что для появления аганглионоза в терминальном кишечнике должна быть удалена значительная часть вагальных клеток. Это предполагает, что, возможно, имеется значительная способность вагального НГ восстанавливаться после уменьшения популяции.

HSCR гены влияют на число клеток НГ и их способность к передвижению

При удалении части НГ фенотип у модельных животных имеет большое сходство с проявлениями HSRC у человека и модельными мутантными животными с интестинальным аганглионозом , т.е. на состояния, при которых миграция клеток НГ протекает с задержкой или затруднена. У мутантных животных имеются аномалии RET/GDNF и ETB/ET-3 сигнальных систем. Еще несколько «аганглионозных» генов кодируют транскрипционные факторы Phox2b, Sox10 , которые модулируют экспрессию RET (1) .

GDNF продуцируется клетками мезенхимы и воздействует через рецептор GFRalpha;1 на клетки НГ, он также является митогеном и фактором выживаемости для клеток ЭНС, производных НГ (in vivo и in vitro). Но кроме этой роли, способствующей увеличению размера популяции, необходимой для миграции, GDNF индуцирует диференцировку этих клеток в нейроны. Эта дифференцировка в свою очередь ограничивает роль GDNF в увеличении размеров популяции, потому что нейроны ЭНС не пролиферируют и обладают плохими миграторными способностями. Оказывается, что реакция клеток НГ в кишечнике на GDNF проявляется в тенденции к дифференцировке в более зрелых тканях. Баланс между этими двумя ролями может быть изменен ETB/ET-3 сигнальной системой. Через рецептор ETB на клетках НГ ET-3, продуцируемая мезенхимой кишечника, действует как тормоз на дифференцирующие способности GDNF и, очевидно, не воздействует на пролиферативную роль GDNF (Development 1999; 126:1161-1173). ET-3 может эффективно поддерживать клетки в состоянии митотического и миграционного пула и, не будучи ростовым фактором, способствовать образованию больших популяций предшественников энтерических нейронов для более поздней дифференцировки в нейроны и глию. Вероятно, что другие нейрональные факторы роста, пока недостаточно изученные, также играют определенную роль в этом процессе. Эти эксперименты подтверждают, что аганглионоз может возникать 1) из-за уменьшения стартового числа клеток НГ, которые, вероятно, имеют нормальную реакцию на митогены во время миграции и б) при отсутствии нормальной митогенной реакции во время миграции, но с нормальным стартовым количеством клеток НГ. Следовательно, вполне вероятно, что решающим фактором, контролирующим заселение кишечника клетками НГ является число клеток, происходящих из вагального НГ. Кроме того, клетки НГ эмбрионального кишечника птиц мигрируют преимущественно в направлении к источнику GDNF (хемотаксис), что было показано в экспериментах in vitrо. Таким образом, гены RET/GDNF системы могут непосредственно воздействовать на способность клеток ЭНС к передвижению, по крайней мере, двумя путями.

Эффект плотности клеточной популяции на миграцию

Сейчас известно, что плотность клеточной популяции ЭНС влияет на миграционный процесс. Плотность энтерических нейронов зависит от числа и скорости их увеличения, размера области кишечника и скорости его роста.

Эффект гомотипичности межклеточных контактов

Плотность популяции клеток НГ в кишечнике достаточно однородна. Статичное изображение морфологии клеток (Рис.3) и распределения популяции in vivo в значительной степени напоминает миграцию клеток НГ in vitro. Кроме того, анализ миграции методом time-lapse (регистрации через определенные промежутки времени) показал сходство динамики миграции in vivo и in vitro. В культуре продвижение популяции клеток НГ находится под контролем популяционного давления. Такое популяционное давление действует на межклеточные контакты, чтобы стимулировать передвижения в других направлениях (не в тех, которые определяются контактами) путем разрыва контактов. После этого сеть направленного передвижения быстро становится беспорядочной и в отсутствии контактов неспособной к передвижению. Следовательно в тот период, когда клетки НГ имеют самую высокую плотность и многочисленные контакты, их миграция идет в определенном направлении. Клетки НГ активно заполняют свободные пространства, но плотность фронта продвигающихся клеток резко снижается из-за утраты направленного передвижения.

Эффект хемотаксиса

Клетки энтерического НГ in vitro хемотаксически передвигаются к источникам GDNF, для чего необходим его градиент концентрации. Оценка синтеза GDNF in vivo (обнаруживаемая по уровням мРНК) не обнаружила градиента (рострального-вниз, каудального-вверх), с помощью которого можно было бы оценить ростокаудальную миграцию. Однако клетки НГ могли бы создать функциональный градиент, если бы концентрация GDNF была ограничена и если бы нервные клетки действовали подобно GDNF «сточной трубе». Во всяком случае, снижение образования GDNF у мутантных мышей gdnf +/- приводит к резкому снижению числа ЭНС нейронов (Am J Hum Genet. 2002.70:435-447). А введение клеток или аксонов с активированным RET (рецептором GDNF) в развивающуюся почку мышей мимикрирует эффект отсутствия GDNF. Т.о., GDNF в регионах уже заселенных клетками вагального НГ, может способствовать клеточной выживаемости в ЭНС, пролиферации и дифференцировке и сохранять пространства в мезенхиме кишечника с GDNF. Однако волновой фронт популяции клеток НГ может сам продуцировать градиент GDNF, который притягивает клетки НГ в направлении скрытых источников GDNF, локализованных каудально. Такой двойной эффект межклеточных контактов и хемотаксиса трудно разделить, т.к. GDNF вносит определенный вклад и в тот и в другой.

Сигнальная балансовая модель HSCR

Для HSCR была предложена следующая модель. Снижение GDNF сигнализации вследствие делеции или мутации одной их копий гена рецептора RET имеет несколько последствий. Во-первых, снижение митогенных функций может снижать скорость увеличения популяции и ослаблять межклеточные контакты, управляемые миграционным давлением. Во-вторых, снижение поверхностного RET может нарушать способность различать разные концентрации GDNF и одновременно снижать эффект «стока» GDNF, который создает этот градиент. По этим причинам может уменьшаться и хемотаксическое притяжение. В третьих, снижение нейральных функций дифференцировки во время миграции может приводить к редукции числа клеток-предшественников и, следовательно, к снижению числа нейронов. Кроме того, выживаемость, обусловленная функциями RET сигнальной системы, может увеличивать клеточную гибель в ЭНС. Полная утрата функций RET может приводить к дистальному аганглионозу из-за всеохватывающей направленной миграции клеток вагального НГ. Вероятно, клинически менее значимым является поражение сакральных клеток (из-за редукции RET), т.к. эти клетки малочисленны и не могут ни по числу, ни функционально заменить утраченные клетки вагального НГ.

Снижение функций ЕТ-3 вследствие мутации одной копии ЕТВ рецептора или самого ЕТ-3 гипотетически может приводить к меньшим ограничениям нейрональной дифференцировки, управляемой GDNF/RET . Возможно, что клетки могут преждевременно покинуть пролиферативный пул, в результате чего останется слишком мало клеток для выстраивания ЭНС в дистальном кишечнике. Отделы проксимального ЖКТ могут оказаться транзиторно гиперганглиозными, из-за быстрой дифференцировки, хотя это может измениться из-за снижения образования нейронов на более поздних стадиях, которые в норме продолжают диференцироваться до рождения

Заселение всего кишечника предшественниками энтерических нейронов и правильная дифференцировка этих клеток зависит от баланса между двумя факторами роста сигнальных систем. Дисбаланс в любом направлении может привести к аганглионозу. В настоящее время эти модели не точны, поэтому трудно предположить, будет ли этот баланс стремиться к стабильности или нестабильности, т.е. будет ли формирование ЭНС относительно стабильной при такой вариабельной доступности факторов или рецепторов, или будет ли формирование ЭНС изменяться пропорционально или диспропорционально вместе со всеми сигнальными переменными. Неясно, как (для стабильной системы) с помощью такого толкования можно предсказать, что образование ЭНС будет медленно дегенерировать или неожиданно менять свои пропорции, когда ростовые факторы или сигнальные компоненты изменяются после критического периода.

Эта модель не учитывает также другие переменные, например, дополнительные факторы роста, которые воздействуют на предшественники нейронов. В настоящее время нет работ о роли клеток ЭНС, являющихся производными сакрального НГ и неизвестно, существует ли патология, такая же, как и при HSCR, с поражением этих клеток ЭНС. Кроме того, другие патологические изменения кишечника, такие как интестинальная нейрональная дисплазия типа В, с вовлечением структуры или функций ЭНС, трудны для диагностики. Таким образом, хотя модель возникновения HSCR , основанная на морфогенезе и дисморфогенезе формирования ЭНС кажется вполне приемлемой, нам еще предстоит выяснить как образуется ЭНС и каким образом аномалии ЭНС могут быть эффективно устранены.

Enteric Nervous System: Development and Developmental Disturbances - Part-2* DONALD NEWGREEN AND HEATHER YOUNGPediatric and Developmental Pathology 5, 329–349, 2002 * часть 1