Enteric Nervous System
Энтеральная Нервная Система

Enteric Nervous System: Development and Developmental Disturbances-Part 1
DONALD NEWGREEN AND HEATHER M. YOUNG
Pediatric and Developmental Pathology 5, 224-247, 2002

Перевод Ирины Г. Лильп



(Рис.1.)  |  . Whole-mount preparations of myenteric (A,B) and submucosal (C,D) plexus from the ileum (A,C) and colon (B,D) of a guinea pig. The tissue was processed for immunohistochemistry using antisera to the nitric oxide synthetic enzyme, nitric oxide synthase (NOS, red), and the calcium binding protein, calretinin (green). Myenteric ganglia in the colon tend to be larger than those in the ileum, but ganglia in both regions contain numerous NOS-immunoreactive (filled arrows) and calretinin-immunoreactive (open arrows) cell bodies (A,B). In both the ileum and colon, neurons containing NOS are descending interneurons and inhibitory motor neurons, and neurons containing calretinin are interneurons and excitatory motor neurons. In the submucosal ganglia of the ileum (C), there are many NOS-immunoreactive nerve terminals (filled ar-rows) that arise from cell bodies in the myenteric plexus, but no NOS-immunoreactive cell bodies. In contrast, there are numerous NOS-immunoreactive cell bodies (filled arrows) in the submucosal ganglia of the colon (D). Unlike submucosal ganglia in the ileum of the guinea pig, some neurons in the submucosal ganglia of the colon, such as the NOS neurons, innervate the circular muscle. Scale bar _ 50 _m.

(Рис.2.)  |  Interactions between the transcription factors Mash1, Phox2a, Phox2b, Pax3, and Sox10 and Ret (which is part of the receptor complex for GDNF) and the catecholamine synthetic enzymes, tyrosine hydroxylase (TH) and dopaminehydroxylase (DH). The expression of Ret is positively regulated, directly or indirectly, by all of the transcription factors shown in this figure. See text for references. GDNF: glial-derived neurotrophic factor.

(Рис.3.)  |  Dissociated enteric precursor cells from E4.7 quail gut grown for 4 days in culture and then fixed and processed for immunohistochemistry using antibodies to neurofilament. In control (A) cultures there is a low density of neurons (arrows), whereas in the presence of GDNF there is a very high density of neurons (B). Et-3 alone has little effect (C), but Et-3 markedly reduces neuronal differentiation induced by GDNF (D). Scale bar _ 50 _m. Micro-graphs courtesy of Dr. Catherine Hearn; see [97] for more details.

(Рис.4.)  |  Explant of a small piece of midgut from an E11.5 mouse grown on collagen culture with an agarose bead impregnated with GDNF at one side and a control agarose bead at the opposite side. The explant was grown for 4 days and then fixed and processed for immunohistochemistry to reveal neurons. The GDNF bead is surrounded by neurons and neurites. Scale bar _ 100 _m.

The Enteric Nervous System: A Second Brain
Введение: структура, функции и развитие энтеральной нервной системы (ЭНС)


Автономная нервная система (АНС) состоит из трех разных по размеру отделов: симпатической, парасимпатической и энтеральной нервных систем. ЭНС - это система нейронов и их опорных клеток, находящихся в стенке желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). По числу клеток ЭНС является самым большим отделом АНС. Число нейронов в ЭНС сопоставимо с таковым в спинном мозге. ЭНС охватывает все ороанальное пространство ЖКТ и содержит большое число нейронов, различающихся по своим функциям и их связям [Furness J.B.,2000]. Спектр нейротрансмиттеров, экспрессируемых в ЭНС достаточно широк, там же обнаружены вещества, действующие как нейротрансмиттеры в ЦНС. Энтеральная глия имеет большее сходство с глией ЦНС, чем с опорными клетками симпатических и парасимпатических ганглиев.
ЭНС опосредует рефлекторную моторику кишечника, играет главную роль в контроле водного и электролитного транспорта и регулирует снабжение кишечника кровью. Многие нейроны ЭНС иннервируются из конечного мозга (hindbrain) и из ганглиев симпатической и парасимпатической нервных систем. Периферические процессы сенсорных нейронов в узловых и дорсальных корешковых ганглиях также осуществляются в ЭНС. Несмотря на наличие такой иннервации, некоторые отделы ЭНС функционально почти автономны. Такая автономия дает возможность осуществлять полные рефлекторные циклы в ЭНС, с участием внутренних сенсорных нейронов, интернейронов и двигательных нейронов. Например, в тонком кишечнике морских свинок моторные рефлексы обнаруживаются после полной внешней денервации, при которой все нервные связи с ЦНС, симпатическими ганглиями и дорсальными корешковыми ганглиями нарушены. ЭНС свойственна также значительная адаптивная пластичность, способствующая защите всех функции ЖКТ, даже в случаях патологических или экспериментальных инсультов. Несмотря на сходство ЭНС с ЦНС, организация ЭНС радикально отличается от ЦНС. ЭНС - это система многочисленных ганглиев, регулярно расположенных в виде узлов, связанных пучками нервных волокон, так называемыми межузелковыми тяжами (internodal strands), в миэнтерическом сплетении симпатического нерва (Ауэрбаховском сплетении), между кольцевидной (circular) и продольной (longitudinal) мышечными оболочками кишечника и в подслизистом (Мейсснеровом) сплетении, расположенном внутри кольцевого мышечного слоя (Рис.1). Миэнтерические ганглии расположены по всей длине ЖКТ, подслизистые ганглии отсутствуют в пищеводе и желудке. Размеры ганглиев варьируют в зависимости от их локализации (внутримышечные или подслизистые), области кишечника и, в меньшей степени, от вида животных. Миэнтерические ганглии, как правило, крупнее подслизистых, локализованных в той же области. Нейроны ЭНС, хотя и кластеризорованы в ганглии, но не образуют ядер, морфологически, функционально и биохимически сходных нейронных типов, как, например, в стволе мозга. Каждый энтерический ганглий содержит нейроны разного типа, соседние ганглии могут содержать сходные типы нейронов, но не обязательно в той же пропорции. Таким образом, ЭНС образует повторяющиеся единицы нейронной цепи вдоль ЖКТ. Но у ганглиев ЭНС имеются систематические различия, зависящие от области их обнаружения в кишечнике. Эти различия включают вариации в размерах ганглиев, типах нейронов, проекционных паттернов и связей (Рис.1).
Функционирование ЭНС необходимо на всех стадиях постнатальной жизни из-за ее важной роли для моторики кишечника, абсорбции и секреции. Мыши с отсутствием нейронов во всем ЖКТ или некоторых его отделах ( в пищеводе или в толстом и тонком кишечниках) погибают в течение 24 часов после рождения. В раннем эмбриональном периоде ЭНС не столь значима для организма. Поэтому аномалии развития ЭНС не вносят существенного вклада в пренатальную гибель и заболеваемость, но имеют значимый эффект сразу после рождения.

Развитие.


Нейроны и глия ЭНС происходят из клеток-предшественников примордиума (зачатка) ЦНС. Эти клетки, называемые клетками нервного гребня (neural crest cells), продуцируют также клетки симпатической и парасимпатической нервных систем, дорсальные корешковые ганглии и множество других типов клеток. Клетки нервного гребня образуются из нервной трубки, но только определенные, четко обозначенные области нервного гребня дают происхождение клеткам ЭНС. Эти клетки-предшественники ЭНС, заселяя кишечник, сначала мигрируют из примордиума ЦНС в оральные и анальные концы ЖКТ на ранних стадиях эмбриогенеза, затем вдоль кишечника. Кишечник в это время осуществляет свою собственную программу роста, морфогенеза и дифференцировки. В кишечнике клетки-предшественники образуют группы, которые занимают определенное положение в слоях ткани кишечника, формирующихся в это же время. Клетки-предшественники ЭНС дифференцируются в нейроны разного типа и клетки глии и образуют сложные цепи, необходимые для функционирования ЭНС.
Для понимания развития ЭНС широкие исследования проводят на лабораторных животных, особенно на грызунах, с использованием методов молекулярной генетики и трансгенеза, а также на эмбрионах птиц с использованием классических эмбриологических методов трансплантации, ампутации и пересадки. Данные о развитии ЭНС получены для рыб и амфибий. Развитие ЭНС у разных классов позвоночных протекает сходным образом и видовые различия между ними минимальны. Поэтому животные могут быть использованы как модели нормального и аномального развития ЭНС человека. Изучение адекватных моделей дает возможность понять события, происходящие на ранних стадиях внутриутробной жизни. Сложная программа развития ЭНС является достаточно древней, она детально законсервирована у рыб, амфибий, птиц и плацентарных млекопитающих, т.е. групп организмов, имеющих общих предков более 300 миллионов лет назад.
В последнее десятилетие значительные успехи достигнуты в понимании генетики и клеточной биологии формирования ЭНС на ранних стадиях развития, а также в понимании этиологии болезни Hirschsprung (HSCR) с поражением ЭНС. Однако все еще остаются трудности в диагностике и в изучении этиологии других заболеваний, связанных с поражением ЭНС. Примером тому является интестинальная нейрональная дисплазия типа В (intestinal neuronal dysplasia B, INDB).

Болезнь Hirschsprung


HSCR является врожденным дефектом с поражением кишечника. Обычно поражается короткий сегмент кишечника, прямая и сигмовидная кишки, иногда более протяженные участки и редко поражение распространяется до проксимальной части подвздошной кишки. В зависимости от длины поражения кишечника заболевание относят к коротко- и длинносегментарным формам [Bander J.et al.1990]. Нарушения функции кишечника проявляется в кишечной непроходимости или тяжелых запорах, вызванных локальной неспособностью кишечника осуществлять моторную релаксацию и перистальтику (перистальтические волны); эта часть кишечника сужена и лишена содержимого. В результате сегмент кишечника, расположенный проксимальнее пораженного участка сильно раздут и заполнен фекалиями. Это называется мегаколон (megacolon). Заболевание обусловлено отсутствием или почти отсутствием ганглиев ЭНС в суженой терминальной области кишечника. Важно заметить, что грубое аномальное вздутие имеет относительно нормальную ЭНС, оно является косвенным результатом поражения более дистальных участков кишечника с отсутствующими энтерическими нейронами. В сегменте кишечника, лишенного ганглиев, а также во внутреннем анальном сфинктере имеется избыток и увеличение размеров нервных волокон, возникающих из внешних нейронов. Эти нервы содержат норадренергические волокна, которые, вероятно, возникают из тазового сплетения (pelvic plexus). Во многих случаях HSCR аномалии структуры и функции ЭНС не ограничены аганглионозным участком; проксимальнее может находиться вариабельного размера область, называемая переходной зоной (transition zone), для которой характерен гипоганглионоз или гиперганглионоз с признаками, сходными для INDB.
Диагностика HSCR основана на результатах биопсии подслизистой ткани с проведением гистохимического анализа на ацетилхолинэстеразу. В пораженном участке отсутствуют нейроны ЭНС. Главная трудность заключается в точной оценке проксимальной протяженности кишечника с функциональными аномалиями. Это обусловлено и неравномерной плотностью распределения нейронов в нормальном кишечнике.
Генетика. HSCR встречается примерно с частотой 1:5000 живорожденных, с соотношением мальчиков и девочек около 4:1. HSCR также ассоциируется с другими синдромами и аномалиями, такими как congenital central hipoventilation syndrome (Ondine's curse), синдромом делеции 22q11 и вариантом синдрома Shah-Waardenburg (WS4) [Parisi M. , Kapur R., 2000]. При этих синдромах первичными являются нарушения развития, связанные с нервным гребнем. Таким образом, HSCR рассматривают как нейрокристопатию (neurocristopathy) (т.е. патологию, связанную с аномалиями развития нервного гребня).
HSCR имеет четко выраженный генетический компонент с повышенным внутрисемейным риском развития заболевания (4% для сибсов и ~0.02% для общей популяции). Риск развития HSCR увеличивается в зависимости от длины пораженного сегмента кишечника, при этом дискордантность соотношения полов снижается. Заболевание наследуется доминантно с неполной пенетрантностью (длинносегментарная форма) и аутосомно-рецессивно или мультифакториально (короткосегментарная форма), хотя сейчас стало известно, что обе формы HSCR могут быть обусловлены одной и той же мутацией. При HSCR обнаружены мутации нескольких генов, но мутациями этих геном можно объяснить менее 50% случаев дистального аганглионоза. Т.е. имеются другие, еще неизвестные гены, мутации которых обусловливают предрасположенность к HSCR. Возможно, что существуют и не наследственные формы интестинального аганглионоза. Т.о., HSCR является моделью синдрома с комплексным мультигенным врожденным дисморфогенезом.
Модели. Сходные признаки дистального аганглионоза наблюдают у мутаций мышей lethal spotting (ls), piebald lethal (Sl) и dominant megacolon (Dom), у мутаций крыс spotting lethal (sl) и известен летальный синдром белых жеребят у лошадей (lethal white foal syndrome). При всех этих мутациях имеется грубая аномалия других производных нервного гребня - меланоцитов. У всех мутантных животных имеются крупные участки депигментированной кожи и шерсти. У цыплят аганглионоз дистального кишечника возникает при частичной ампутации специфических участков нервного гребня во время раннего эмбриогенеза.

Интестинальная нейрональная дисплазия типа В (INDB)


Среди детей со значительной задержкой времени кишечного продвижения фекалий и тяжелыми запорами была выделена подгруппа с мегаколоном и аномалиями ЭНС [Puri P.,1998]. В настоящее время заболевание называется INDB, его прежнее название - нейрональная интестинальная дисплазия (neuronal intestinal dysplasia, NID). По сравнению с HSCR при INDB не наблюдают аганглионозных участков, но иногда регистрируют увеличенные, не свойственные этой области кишечника нервные волокна в пораженном участке, как и при HSCR. Для INDB характерны крупные ганглии ЭНС ("гигантские ганглии") в подслизистом сплетении, которые, вероятно, являются дефинитивными, часто гиперплазия ЭНС и эктопические ганглии особенно в muscularis mucosae и lamina propria. Т.о., существует связь между HSCR и INDB, т.к. при HSCR часто наблюдают INDB-подобные признаки в сегменте кишечника, расположенном проксимальнее аганглионозного участка. Однако пока существуют сомнения в отношении того, является ли INDB самостоятельным заболеванием. Эти сомнения возникли после оглашения результатов некоторых патологов, представивших данные по биопсии 377 образцов от 108 детей в "слепом" испытании. Четкая диагностика все еще остается проблемой для INDB, особенно из-за разногласий в критериях и субъективности оценок, а также из-за того, что отличия от нормальной ЭНС являются скорее количественными, чем качественными. Количественные различия могут быть связаны с нормальной вариабельностью признаков в постнатальный период или вариабельностью плотности ЭНС между отдельными участками кишечника. Пока неясно, может ли быть поставлен диагноз INDB взрослым лицам, страдающим упорными запорами. Примером диагностических трудностей может служить критерий "гигантские ганглии", которые считаются таковыми, если содержат 7 и более нейронов. Но ганглии такого не слишком большого размера могут встречаться и в нормальной ЭНС. Кроме того, не все ганглии при INDB являются гигантскими. Существуют также возрастные изменения признаков как у здоровых лиц, так и у больных с INDB, в связи с чем следует учитывать возраст пациента при постановке диагноза. У больных с INDB обнаруживают изменения соотношения нейротрансмиттеров (снижение субстанции Р и увеличение вазоактивного интестинального пептида VIP), гиперплазию интестинальных клеток Кахаля или дефект нейромышечных маркеров. Однако такие же признаки описаны и для других, не INDB заболеваний, что осложняет диагностику INDB. Тем не менее, INDB рассматривается некоторыми клиницистами как самостоятельная клиническая единица с генетическим компонентом, установленным на основании исследования близнецов. Тот факт, что INDB распознается у новорожденных, не означает, что заболевание является результатом дефекта развития. Ахалозия (аномалия ЭНС), например, появляется у взрослых и не является дефектом развития, поэтому нет причин считать, что такие дефекты не могут возникать в более ранние периоды жизни (у тех же новорожденных). Могут также встречаться нейрональные аномалии другого типа. Например, при INDB обнаружены воспалительные клетки в кишечных сплетениях. При нарушениях целостности ЦНС такие клетки и, особенно, активированные макрофаги секретируют нейротрофические факторы: brain-derived neurotrophic factor (BDNF) и glia-derived neurotrophic factor (GDNF), которые активно способствуют росту нервов в области воспаления. Сходная экспрессия таких факторов воспалительными клетками в ЖКТ сообщалась при гиперплазии ЭНС. Доказательством того, что INDB является самостоятельным заболеванием, служат исследования на животных.
Мыши с мутацией Hox11L1 имеют патологию, сходную с INDB: у них увеличено число нейронов в ободочной кишке [Hatano M.et al.,1997]. Человеческий гомолог этого гена известен, но к настоящему времени не сцеплен со случаями, диагностированными как INDB или HSCR [Costa M.,2000]. Не обнаружено мутаций генов, обычно мутирующих при HSCR, при некоторых случаях INDB болезни. Изучение процессов, в которых участвует ген Hox11L1 (например, генов модулируемых Hox11L1 белками), позволит выделить гены-кандидатами для INDB и, соответственно, выявить диагностические маркеры.
Другие нарушения морфогенеза, встречающиеся у больных с INDB или с INDB-подобными аномалиями, также могут быть не результатом нарушений развития, а вторичной реакцией на ряд кишечных и абдоминальных расстройств, некоторые из которых могут возникать во время развития. В любом случае, отсутствие согласованности среди клиницистов при INDB является препятствием для генетических исследований.

Лечение HSCR и INDB


Диагноз HSCR основан на результатах биопсии [Kapur R.,1999]. Обычно берут два кусочка ткани, один замораживают и окрашивают гистохимически на ацетилхолинэстеразу и для контрастности гематоксилином. Другой заключают в парафин, готовят гистологические срезы и окрашивают гематоксилин-эозином для выявления ганглиозных клеток. Лечение HSCR заключается в резекции аганглионозного сегмента и в реанастомозе, проводимом в два этапа. Часто после оперативного удаления дистальной части кишечника появляются функциональные аномалии. Одной из причин этого является то, что у некоторых больных наиболее дистальный сохранный (после резекции) сегмент содержит ганглии, но это транзитарная зона и такой дистальный сегмент структурно и функционально напоминает аномалии при INDB. После резекции у больных с HSCR, ассоциированной с INDB, восстановление функции происходит медленнее, чем при обычном аганглионозе, в связи с чес часто требуется повторное вмешательство. Главной задачей при хирургическом вмешательстве является точная оценка уровня резекции и минимальное удаление ткани, чтобы оставшаяся часть кишечника оставалась нейрофизиологически компетентной. По возможности следует избегать хирургического вмешательства и попытаться "выстроить" ЭНС в пораженном сегменте, например, засевая его нейральными клетками-предшественниками. Стволовые клетки человека, способные к нейральной дифференцировке могут быть получены на постнатальных стадиях [Alvarez-Buylla A. et al., 2000]. Эксперименты на птицах показали, что это возможно. У здорового человека ЭНС не сформирована окончательно к моменту рождения, она обладает определенной пластичностью и это дает возможность для проведения манипуляций у плода in utero и даже в постнатальный период. Но для этого необходимо изолировать, размножить и манипулировать стволовыми клетками и расширить знания по генетике и клеточной биологии развития ЭНС.
Лечение INDB на первом этапе консервативное и заключается в приеме слабительных средств и клизм. В большинстве случаев проблемы разрешимы и поддаются лечению. Продолжительные и тяжелые случаи лечатся хирургически, трудность заключается в оценке длины пораженного сегмента. Рекомендуется длительное наблюдение за больными, т.к. исход в некоторых случаях непредсказуем, и это не связано с первичной гистологической оценкой тяжести проявлений при INDB.

Происхождение HSCR


Общим признаком HSCR-сходных ЭНС синдромов у человека и животных является поражение наиболее дистальной области кишечника. Изначально недифференцированная кишечная трубка препаттернированна вдоль своей оро-анальной оси, в это время происходит экспрессия различных Hox генов [Pitera J.,1999]. Это может свидетельствовать о том, что региональные нарушения ЭНС связаны с регионально препаттернированным кишечником. Однако степень нарушений ЭНС по длине кишечника значительно варьирует. Как показали генетические исследования, у человека коротко- и длинносегментарные формы HSCR скорее всего являются одной и той же нозологической единицей. У мышей с мутацией ls в неонатальном периоде аганглионоз захватывает только несколько миллиметров дистальной части ободочной кишки, у мутации Sl около половины ободочной кишки, у крыс с мутацией sl всю ободочную кишку и в разной степени область ileocecal. Нокаутные гомозиготные мыши Ret, gdnf, и gfrα1 , напротив, имеют тотальное отсутствие ЭНС во всем кишечнике дистальнее желудка. Это означает, что причины дистального аганглионоза не имеют отношения к региональному препаттернированию, определяющему различные сегменты ЖКТ.
Паттерн интестинального аганглионоза непосредственно указывает на нарушения росто-каудального паттерна нормального развития ЭНС. Нарушения при HSCR вероятно связаны с блокадой росто-каудальной миграции клеток нервного гребня в ЖКТ. Дефекты, которые изменяют процессы клеточной миграции, могут возникать в клетках самого нервного гребня или его окружении, в исходном участке примордиума ЦНС, в миграционном пути до того как они достигнут кишечника, в кишечнике в целом или в аганглионозной зоне. В нервном гребне мутации могут затрагивать: образование клеток, предназначенных для миграции, деление, выживаемость, или дифференцировку.

Гены и молекулы, участвующие в развитии ЭНС и дисплазиях


В последнее десятилетие идентифицировано множество генов, мутации или делеции которых влияют на развитие ЭНС. Многие из них были идентифицированы на основании клинических и молекулярно-генетических исследований HSCR . Наиболее важными являются гены, кодирующие элементы двух cell-cell сигнальных систем (GDNF-Ret/GFRα1 и ET-3-ETB). Их функции интенсивно изучаются при HSCR. Гены для элементов Hedgehog сигнального пути, известные из фундаментальных исследований по развитию, также представляют интерес, т.к. обнаружилось их влияние на формирование ЭНС у моделей. Определенное влияние на развитие ЭНС оказывают транскрипционные факторы (Mash1, Phox 2a и 2b, Pax 3, Sox10 и Hox11L1), но их функции еще плохо изучены. В Табл.1 представлены гены, участвующие в развитии ЭНС. На Рис.2 представлены возможные пути их взаимодействия.

Табл. 1
Генетические модели. Фенотип животных, обусловленный мутациями, контролирующими развитие ЭНС


1. Модели с мутациями в генах GDNF-Ret-GFRα1 сигнальной системе
Ret+/-
Ret -/- (нокаут): неонатальная гибель, агенез почек, отсутствие ЭНС в тонком и толстом кишечниках, отсутствие верхних симпатических и цервикальных ганглиев.
gdnf+/-: гаплоганглионоз
gdnf -/- : неонатальная гибель, агенез почек, отсутствиеЭНС в тонком и толстом кишечниках
neurturin-/- (нокауты) и gfrα2-/- (нокауты):- снижена плотность холинергических нейронов ЭНС
gfrα1-/- (нокауты): тотальный аганглионоз ЖКТ дистальнее пищевода.

2.Модели с мутациями в генах эндотелиновой сигнальной системы
S1(piebald lethal) (мыши) обусловлен утратой функции эндотелина из-за инактивации EtB рецепторного гена; дефект пигментации, аганглионоз дистального отдела кишечника
sl spotting lethal (крысы): нарушения пигментации, аганглионоз поражает всю ободочную кишку
ls (lethal spotting) (мыши): аганглионоз поражает несколько мм дистальной части ободочной кишки, нарушения пигментации.
Ece-1 (мыши) отсутствует Ece-1 (эндотелин-конвертирующий фермент). У животных имеются аномалии черепа, кардиологические дефекты, отсутствуют эпидермальные меланоциты и энтерические нейроны в дистальной части кишечника
Et-1 и EtА (мыши-нокауты) дефекты те же, что и у Ece-1-/-

3. Модели с мутациями в генах, кодирующих транскрипционные факторы
Phox2a-/- (мыши) не имеют дефектов ЭНС
Phox2b-/- (мыши) отсутствие ЭНС нейронов во всех отделах ЖНТ, полное отсутствие периферической нервной системы
Phox2b (мыши-нокауты) клетки нервного гребня присутствуют в переднем кишечнике, но далее не мигрируют
Sox-/- (мыши) гибель клеток-предшественников ЭНС перед их эмиграцией в передний кишечник
Pax3+/- (мыши) белые пятна на животе, нет дефектов ЭНС.
Pax3-/- (мыши) гибель на средних стадиях внутриутробного развития. Дефекты нервной трубки и сердца. Отсутствие энтерических нейронов каудальнее желудка.
Mash1-/- (мыши) гибель в течение 48 ч после рождения, отсутствие и симпатических энтерических нейронов в пищеводе, отсутствие нервных волокон в нижнем сфинктре пищевода, Энтерические нейроны присутствуют в желудке и кишечнике, но отсутствуют некоторые типы нейронов (серотонинергических).
Hox11L1-/-, Еnx, Ncx, Tlx2 (мыши) имеют INDB-подобный синдром (мегаколон с гиперплазией ЭНС в ободочной кишке и гипоплазией в подвздошной кишке с последующей гибелью нейронов.

4. Модели с мутациями в генах Hedgehog сигнальной системы
Ihh -/- (мыши) гибель на ранних стадиях эмбрионального развития.
Shh-/- (мыши) гибель на ранних стадиях эмбрионального развития.
Ihh+/- гибель сразу после рождения. У мышей в поздний плодный период расширена ободочная кишка, стенка которой аномально истончена, часто наблюдают отсутствие энтерических нейронов в части тонкого кишечника и в расширенной области ободочной кишки. Присутствие ЭНС в нерасширенной части ободочной кишки свидетельствует, что предшественники энтерических нейронов мигрируют в кишечник, но не выживают и/или не дифференцируются в отсутствие Ihh.
Shh-/- нет отсутствия ЭНС в какой-либо части кишечника, но тельца нервных клеток присутствуют внутри слизистой, под эндодермальным эпителием и в lamina propria ворсинок, т.е. в тех местах, где в норме они должны отсутствовать.


GDNF-Ret-GFRα1 сигнальная система
Этот сигнальный путь важен для субпопуляций периферических и центральных нейронов. В исследованиях in vivo и in vitro показано, что он способствует выживаемости нейронов, митозу нейральных клеток-предшественников, дифференцировке нейронов и их расселению. Эта система необходима и для развития почек (по крайней мере, у мышей).
RET ген и белок
Обе формы HSCR сцеплены с дефектом в участке хромосомы10q11.2, конкретно с RET геном. Вероятно, что около 50% семейных или спорадических случаев HSCR возникают в результате мутации RET. Сиквенс-анализ показал, что он кодирует единственный membrane pass cell surface molecule с цитоплазматическим доменом, содержащим тирозин киназу. Ранее RET относили к орфановым рецепторам. Значительное сходство между фенотипами Ret-/- и gdnf-/- мышей (у обеих мутаций есть почечный агенез и отсутствие ЭНС в тонком и толстом кишечниках) дало возможность предположить, что Ret и производимый глией нейротрофический фактор (glial-derived neurotrophic factor - GDNF; see GDNF Gene and Protein Family) вовлечены в один и тот же сигнальный путь. GDNF не действует прямо через Ret, для этого нужна дополнительная молекула GFRα , связанная с GDNF и необходимая для передачи сигнала. Сейчас известно, что лиганды для RET являются более сложными, чем для GDNF и включают другие члены GDNF семейства.
Многочисленные мутации RET гена, вызывающие HSCR (преждевременные stop codones и делеции в домене киназы), инактивируют киназу. Возникающие в результате аганглионоз и функциональные нарушения вариабельны, и результатом одной и той же мутации в одном семействе могут быть и длинно- и короткосегментарные формы HSCR с тяжелыми нарушениями моторики кишечника, умеренными запорами или нормальными функциями ЭНС. Однако, у младенцев с длинносегментарной формой HSCR процент RET мутаций, особенно в домене тирозин киназы, выше по сравнению с младенцами с короткосегментарной формой HSCR. При редкой форме HSCR , тотальном интестинальном аганглионозе, энтеральные нейроны отсутствуют в толстом и тонком кишечниках. Показано, что один больной с этой формой HSCR является гомозиготой по специфическому RET мутантному аллелю (кодон 969), у гетерозигот по тому же мутантному аллелю имеется аганглионоз дистальнее тонкого кишечника. У мышей гетерозиготных поRet нет признаков аганглионоза и мегаколона. Гомозиготные Ret нокаутные мыши имеют тотальное отсутствие ЭНС во всех регионах ЖКТ, кроме пищевода, т.е. нормальное развитие ЭНС зависит от продукта RET гена. Люди, находящиеся на границе "гаплонедостаточности", т.е. с белковым продуктом только одного функционального гена RET, близки к минимуму, необходимому для выполнения задачи по развитию. У мутации Ret мышей также отсутствуют верхние цервикальные симпатические ганглии, имеется агенез почек. RET экспрессируется в развивающихся почках человека, но больные HSCR, даже с тотальной формой интестинального аганглионоза, редко имеют почечные нарушения.
У эмбрионов курRet mRNA может определяться при гибридизации in situ на вагальном (vagal-относ. к блуждающему нерву) уровне нервного гребня до начала клеточной миграции, но у мышей Ret mRNA не определяется до проникновения клеток в передний отдел пищевода. Пока неизвестно имеется ли достаточное количество Ret белка на ранних стадиях развития птиц. И у птиц, и у мышей клетки нервного гребня не реагируют на Ret лиганд (GDNF), когда впервые эмигрируют из нервной трубки, они становятся реактивными незадолго до или сразу после вхождения в передний отдел ЖКТ.Ret ген и белок экспрессируются в клетках ЭНС во время миграции через кишечную мезенхиму у мышей, крыс, цыплят и человека, и позже - в дифференцированных энтерических нейронах. Энтерические нейроны, продуцируемые нервным гребнем, реагируют на GDNF в клеточной культуре: увеличивается их рост, выживаемость, они дифференцируются и способны к хемотаксической миграции [Young H.,2001]. Фактически, все клетки нервного гребня (нейральные и глиальные предшественники) в кишечнике сначала экспрессируют Ret, эта экспрессия сохраняется в диффиренцирующихся нейронах, но она снижается в дифференцирующихся глиальных клетках.
Разные мутации, особенно те, которые делают киназы конститутивно активными, даже в отсутствие GDNF, не обязательно вызывают HSCR, но могут вызывать семейную медуллярную тироидную карциному (FMTS) и множественные эндокринные неоплазии (MEN) 2А и 2В типа. Из этого следует, что мутации, инактивирующие киназу, могут быть причиной гипоплазии клеточной популяции ЭНС и, соответственно, причиной HSCR фенотипа. Сложность заключается в том, что около 5% больных HSCR имеют MEN 2A или FMTS и в клетках некоторых из этих больных (с мутацией, активирующей RET) экспрессируется меньше RET белка, чем у нормальных лиц. Возможно, что конститутивная активность достаточна для возникновения эндокринной неоплазии, но тотальная активность RET недостаточна для поддержания нормального морфогенеза ЭНС.
GDNF ген и семейство белка
Лигандом для Ret рецептора является GDNF [Robertson K. et al.,1997]. GDNF ген локализован на 5р12-13.1 хромосоме человека. Сама по себе гетерозиготная мутация этого гена не вызывает признаков HSCR, но, возможно, что мутация GDNF гена в сочетании с другими генами, контролирующими HSCR, может вносить определенный вклад в степень тяжести заболевания. Описан гаплоганглионоз у gdnf+/- мышей. Гомозоготных мутаций по GDNF гену у человека не обнаружено, но у мышей gdnf-/- интестинальный фенотип идентичен гомозиготам Ret-/- мышей - у них отсутствует ЭНС каудальнее желудка, имеется почечный агенез и неонатальная гибель.
GDNF ген кодирует секреторный ростовой фактор, представляющий собой димер, связанный дисульфидными связями между остатками цистеина. Это димеризованный продукт, так называемый цистеиновый "кнот" (knot), является характерным признаком трансформирующего ростового фактора β (TGF-β) семейства ростовых факторов. Сиквенс анализ показал, что GDNF отличается от членов этого семейства, он функционально отличен от TGF-βs тем, что передает сигнал через рецептор тирозин киназы, тогда как все другие члены семейства используют консервативную группу рецепторов серин-треонин киназы. Путь сигнальной трансдукции, инициируемый GDNF через RET не выполняется SMAD семейством, использующим другие TGF-β рецепторы.
Идентифицированы другие члены семейства GDNF - neurturin (локализован на хромосоме человека 19р13.3), artemin и persephin. Каждый из них имеет свой собственный лиганд-связывающий корецептор (GFRα), но в то же время все они используют в качестве рецептора Ret. Мутации гена, кодирующего NEURTURIN не вызывают HSCR, хотя возможно, что мутации GDNF-родственных факторов могут вносить определенный вклад в тяжесть HSCR, обусловленной другими мутациями. У мышей-нокаутов, гомозиготных по генам, кодирующим или neurturin, или его лиганд-связывающую молекулу gfrα2, снижена плотность холинергических нейронов в ЭНС, отсутствуют почечные аномалии, мыши выживают и размножаются. Мутации ARTEMIN и PERSEPHIN не оказывают влияния на HSCR человека или мышей.
Гибридизация in situ показала, что gdnf mRNA экспрессируется в эмбриональной кишечной мезенхиме. Ее низкий уровень определяется у мышей на 10.5 день эмбрионального развития (E10.5), что соответствует примерно 30-дневному эмбриону человека (считая от момента оплодотворения). Это происходит сразу после вхождения в передний кишечник первых ЭНС-предшественников, т.е. vagal клеток нервного гребня, и с этого момента уровень gdnf mRNA быстро увеличивается по всей длине ЖКТ. Некоторые данные свидетельствуют о проксимо-дистальной волне экспрессии gdnf mRNA в продвижении или миграционной волне клеток вагального нервного гребня. Нет количестенных данных о более сильной экспрессии гена в отдельных сегментах ЖКТ.
GFR корецепторы
Для передачи сигнала через Ret необходимы корецепторы (лиганд-связывающие молекулы) GFRα семейства [Airaksinen et al.,1999], являющиеся гликозилиноситолфосфатами (glycosylinositolphosphate), связанные с клеточной поверхностной мембраной в клетках, экспрессирующих Ret и имеющих одно и то же происхождение из нервного гребня. Все четыре известных GDNF-родственных лиганда (GDNF, neurturin, artemin, и persephin) имеют свои собственные предпочтительные корецепторы. GDNF передает сигнал преимущественно через GFRα1 (локализован у человека на хромосоме 10q26). Связь между Ret и GFRαs в отсутствии какого-либо GDNF-родственного лиганда неясна. Или GDNF, или его родственные лиганды сначала связываются с соответствующим GFRα и этот комплекс затем связывается и стимулирует аутофосфорилирование RET. Возможно, что GFRαs образует приассоциированный комплекс с Ret, который действует как связывающий сайт для GDNF или его родственных лигандов [Saarma M.,2000]. GFRαs локализуются на липидных "плотиках" (rafts) клеточной мембраны. Оказалось, что связывание GDNF с GFRα1 "вербует" Ret (на липидных плотиках) и инициирует связь с адаптером сигнальной трансдукции motif Scr, необходимым для нижестоящей (downstream) сигнализации, ведущей к нейрональной выживаемости и дифференцировке.
Мутации в GFRα1 не связаны с HSCR, хотя иногда наблюдают полиморфизм. У нокаутных мышей, гомозиготных по GFRα1 имеется тотальный аганглионоз ЖКТ дистальнее пищевода, сходный с таковым у нокаутных мышей Ret и gdnf [Tomac A. et al.,2000]. Имеется, однако, небольшая популяция ЭНС нейронов в самом дистальном участке ободочной кишки этих мышей, которая может относиться к сакральным (крестцовыми?) клеткам, происходящим из нервного гребня. Мутации GFRα3 , гена, кодирующего лиганд-связывающую молекулу для artemin, также не ассоциируются с HSCR.

Функции RET-GDNF-GFRα1 системы


Клетки, образующиеся из нервного гребня, т.е. клетки эмбриональных сенсорных и симпатических ганглиев, экспрессируют RET-GFRα рецепторный комплекс, а GDNF обеспечивает их выживаемость и рост аксонов. Исследование эмбриональных клеток у птиц, мышей и крыс in vitro показало, что GDNF действует на ранние предшественники ЭНС как митоген, стимулирует их дифференцировку в нейроны и рост аксонов (Рис.3А,В). В органной культуре мышиной интестинальной ткани, содержащей клетки ЭНС, GDNF может направленно притягивать (привлекать) мигрирующие клетки-предшественники ЭНС (Рис.4). Интересно, что у других клеток, имеющих происхождение из нервного гребня, отсутствует такая направленная миграционная реакция. Предполагается, что такая реакция на GDNF, который является "нижестоящим" (downstream) по отношению к Ret/GFRα рецепторному комплексу, может проявляться дифференцированно в зависимости от типа клеток. В том же эксперименте установлено, что вагальные клетки нервного гребня предназначены для образования ЭНС, но при тестировании на более ранних стадиях, когда они эмигрируют из нервной трубки, реакция на GDNF отсутствовала. Т.о., изменения по мере развития происходят в вагальных клетках нервного гребня либо перед непосредственным их вхождением в передний кишечник, либо после того как они были обработаны "кишечным микроокружением" таким образом, что они становятся GDNF-реактивными.

Эндотелин-эндотелин рецепторная система


Эндотелины (ET-1, ET-2 и ET-3) являются межклеточными локальными курьерами (messengers), действующими через рецепторы клеточной поверхности, ETA и ETB. Эндотелиновая система у взрослых организмов важна для регуляции кровяного давления, контролируя тонус микрососудистой сети. Во время раннего эмбриогенеза она играет важную дополнительную роль в регуляции морфогенеза, что было обнаружено при изучении нокаутных мышей. Например, нокаутированный Et-1 ген у мышей приводит к тяжелым краниофациальным и кардиологическим дефектам. Этот ген контролирует дисморфогенез множества структур, являющихся производными нервного гребня.
Эндотелиновый рецептор В (ETB)
Изучение семейной формы HSCR дало возможность идентифицировать ETB рецептор как ген, который в инактивированном состоянии может вызывать HSCR. У человека около 3%-7% HSCR возникает в результате ETB мутации. Обычно обнаруживается доминантное наследование с неполной пенетрантностью, т.к. у гетерозигот поражается только 21% лиц и около 25% лиц с мутацией в гомозиготном состоянии здоровы. ETB рецепторный ген локализован на хромосоме человека 13q22 и кодирует G белок-спаренный рецептор с семью трансмембранными доменами. EtB рецептор экспрессируется в нервном гребне и клеточных линиях, имеющих происхождение из нервного гребня, включая клетки, образующие ЭНС. Этот рецептор экспрессируется очень рано в нервных складках (folds), еще до эмиграции клеток нервного гребня и эта экспрессия сохраняется, когда клетки нервного гребня мигрируют к тканям-мишеням.
Таргетированная делеция EtB рецепторного гена вызывает сходные HSCR -подобные состояния и дефекты пигментации у мышей. Piebald lethal мутация (Sl) у мышей и spotting lethal (sl) мутация у крыс также обсловлены утратой ET функции из-за инактивации ETB рецепторного гена. В изящном эксперименте с использованием индуцибельной системы, модулирующей экспрессию EtB у трансгенных мышей Shin с coaвт. [1999] показал, что для предупреждения дистального аганглионоза EtB должен экспрессироваться с E10, т.е. в сроки, близкие к вхождению ЭНС предшественников в кишечник (к E12.5). Последнее интересно тем, что полное заселение кишечника не происходит до E14.5. Предполагается, что или EtB mRNA и/или белок персистируют примерно 2 дня, либо то, что последний участок заселения ободочной кишки относительно слабо реагирует на EtB активность.
Эндотелины (ET)
ET-1, ET-2 и ET-3 являются секреторными молекулами, продуцируемые как крупные, инактивированные молекулы предшественники. Они должны быть разделены в двух позициях, чтобы образовались небольшие 21 аминокислотные активные пептиды. И хотя EtB связывается с Et-1, -2 и -3 с одинаковой аффинностью, принципиальным лигандом для EtB рецептора клеток-предшественников ЭНС является Et-3, т.к. это единственный эндотелин, продуцируемый в значительных количествах мезенхимными клетками ЖКТ [Brand M.,1998]. Мутации в ET-3 гене человека (локализован на хромосоме 20q13.2-13.3) отвечают примерно за 5% HSCR. Мутации мышиного Et-3 гена, как, например, у lethal spotting мышей (ls) вызывают пигментацию и фенотип, сходный с EtB мутацией, но с менее тяжелыми проявлениями - длина англионозного сегмента кишечника у них короче. Предполагается, что это обусловлено частичной компенсацией низкого уровня Et-1, на который рецептор реагирует в той же степени.
Эндотелин-конвертирующий фермент-1 (ECE-1)
Протеазы, осуществляющие вторичное расщепление для образования функциональной ET являются эндотелин-конвертирующими ферментами (ECE-1). Ген для этого фермента локализован на хромосоме 1p36.1, он мутирован у пациентов, составляющих группу сложных нейрокристопатий, характеризующихся поражениями сердца, черепно-лицевыми дефектами, дисфункциями АНС и интестинальным аганглионозом. Предполагают, что множественные аномалии происходят из-за нарушения функции ET-1 и ET-3, т.к. ECE-1 действует как активирующая протеаза для крупных молекул ET-1 и ET-3. Мыши с отсутствием Ece-1 имеют черепно-лицевые и кардиологические аномалии, очень сходные с аномалиями наблюдаемыми у Et-1 и EtA нокаутных мышей, у них также отсутствуют эпидермальные меланоциты и энтерические нейроны в дистальном кишечнике, которые сходны с аномалиями у мышей с отсутствием Et-3 или EtB.
Функции ET-3-ETB системы в ЭНС клетках
Эффекты передачи сигналов во время развития очень тонкие. Клетки-предшественники ЭНС были выращены в клеточной культуре после иммунноселекции из кишечника ранних эмбрионов птиц с использованием антител к маркеру нервного гребня HNK-1. Добавление только одного ET-3 к этим клеткам не оказывало на них значимого эффекта, но ET-3 резко снижал дифференцировку нейронов, которые "управлялиcь" (driven) GDNF (Рис.3C,D). Выживаемость и митогенный эффект GDNF не были нарушены. То же самое наблюдали у мышей, клетки-предшественники которых иммунноселектировали из кишечника. ET-3 снижал число образующихся в культуре нейронов. Такое дифференцированное ингибирование или эффект задержки ET-3 сигнализации является неспецифическим, поскольку он не ограничивается поражением дифференцировки, управляемой особым фактором, таким как GDNF. Например, нейрональная дифференцировка клеток-предшественников ЭНС у крыс in vitro может быть стимулирована цилиарным нейротрофическим фактором (ciliary neurotrophic factor, CNTF), но CNTF- индуцированную дифференцировку также снижает ET-3. Кроме того, эффект ET-3 не ограничивается подавлением единственного направления дифференцировки, энтерального нейрогенеза. Например, клетки торакального нервного гребня эмбрионов птиц, культивируемые в присутствии экстракта куриного эмбриона дифференцируются в меланоциты из-за присутствия не охарактеризованного индуктора в эмбриональном экстракте, а добавление ET-3 задерживает, но не предотвращает появление меланоцитов. Такой парадоксальный эффект увеличения числа меланоцитов присутствует в культуре. Причиной этого является более высокая скорость митотического деления в недифференцированных клетках нервного гребня, чем в меланоцитах. Следовательно, поддержание клеток в недифференцированном состоянии в течение долгого периода времени увеличивает, в конечном итоге, число клеток, способных к дифференцировке в меланоциты. Сходные результаты наблюдали в культуре предшественников Шванновских клеток эмбрионов крыс (линия также получена из нервного гребня). В этом случае дифференцировка в зрелые Шванновские клетки контролируется β-нейрорегулинами, дополненными ростовым фактором фибробластов-2 (fibroblast growth factor-2, FGF-2), но эта дифференцировка задерживается при добавлении ET-3, действующего через EtB рецептор.
Эти результаты указывают, что действие ET-3 на клетки, происходящие из нервного гребня, заключается в предотвращении или задержке дифференцировки в целом, независимо от того относится это к меланоцитам, Шванновским клеткам или ЭНС нейронам. Т.к. факторы, индуцирующие дифференцировку (β-нейрорегулин, FGF-2, GDNF и CNTF), действуют через неродственные рецепторы, тормозящий эффект ET-3 на дифференцировку может быть на общей нижестоящей (downstream) точке этих рецепторов. Таким общим моментом может быть активность транскрипционного фактора Sox10 и, возможно, Pax3. Оба фактора, действуя синергично, способствуют дифферецировке меланоцитов, Шванновских клеток и ЭНС нейронов. Возможно, что прямо или косвенно, ET-3 подавляет экспрессию или активность этих молекул.
Две независимых группы исследователей предположили, что когда EtB-Et-3 сигнальный путь ингибирует или задерживает дифференцировку нейронов, то в отсутствие передачи сигнала через этот путь, популяция энтерических нейронов-предшественников дифференцируется слишком рано и слишком полно в нейроны, еще до заселения дистальной части заднего кишечника. В результате должен образоваться дефицит пролиферирующих и мигрирующих клеток для завершения колонизации дистальной части кишечника. Этим можно было бы объяснить отсутствие нейронов в дистальном отделе заднего кишечника у мышей или человека с мутациями в гене, кодирующем EtB или Et-3.
Эта гипотеза согласуется с результатами экспериментов, в которых эксплантант кишечника с энтерическими предшественниками нейронов в терминальном участке подвздошной кишки (но не в заднем кишечнике) мыши был удален и выращен в органной культуре. В контрольной культуре колонизация заднего кишечника имела место, но в присутствии EtB антагониста, который блокирует Et-3-EtB передачу сигнала, возникал терминальный аганглионоз. Однако недавно было показано, что экспрессия EtB не является необходимой для колонизации дистального заднего кишечника. Такие разногласия могут быть связаны как с методическими особенностями эксперимента, так и с точностью определения стадии колонизации. Функция EtB пептида подавляется с E11.5 у мышей, в то время как у трансгенных мышей утрата экспрессии гена EtB происходит на стадии Е12.5 или позднее.

Hedgehog signaling system


Члены hedgehog семейства являются секреторными белками, участвующими в жизненно важных процессах развития. Два члена этого семейства Indian hedgehog (Ihh) и Sonic hedgehog (Shh) могут влиять на развитие ЭНС. Оба (Ihh и Shh) белка связываются с трансмембранным белком Patched (Pts). В норме Pts репрессирует передачу сигнала от молекулы клеточной поверхности Smoothened (Smo). Связывание hedgehog ингибирует Pts и дерепрессирует Smo передачу сигнала. Передача сигнала через Ihh или Shh активизирует транскрипционный фактор Gli1 и индуцирует скелетный морфогенетический белок 4 (bone morphogenetic protein 4, BMP4) из семейства TGF-β . Гены Shh и Ihh экспрессируются в эндодерме кишечника, гены Ptc, Gli и Bmp4 экспрессируются в мезенхиме кишечника. Гомозиготы Ihh или Shh у мышей погибают на ранних стадиях эмбрионального развития, гетерозиготы погибают почти сразу после рождения [Ramalho-Santos M.et al.,2000]. У Ihh+/- мышей в поздний плодный период расширена ободочная кишка, стенка которой аномально истончена и у них часто наблюдают отсутствие энтерических нейронов в части тонкого кишечника и в расширенной области ободочной кишки. Присутствие ЭНС в нерасширенной части ободочной кишки у Ihh+/- мышей свидетельствует, что предшественники энтерических нейронов мигрируют в кишечник, но не выживают и/или не дифференцируются в отсутствие Ihh. Доказательством роли hedgehog в развитии ЭНС являются данные о сверхэкспрессии GLI гена человека у мышей. Такие трансгенные мыши имели расширенную ободочную кишку и отсутствие энтерических нейронов в части ободочной кишки. Однако неясно, почему Gli1 свехэкспрессия мимикрирует Ihh "недоэкспрессию".
У мышей Shh+/- нет отсутствия ЭНС в какой-либо части кишечника, но тельца нервных клеток присутствуют внутри слизистой, под эндодермальным эпителием и в lamina propria ворсинок, т.е. в тех местах, где в норме они должны отсутствовать. Shh, секретируемый эндодермой кишечника, активирует экспрессию Ptc и Bmp4 в соседней не мышечной мезенхиме и ингибирует нейрональную и гладкомышечную дифференцировку. Предполагают, что передача сигнала через Shh важна для радиального паттернирования кишечной трубки, чтобы гладкомышечные клетки и нейроны дифференцировались только во внешних слоях, отдельно от эндодермы. Присутствие энтерических нейронов близко к просвету кишечника у Shh+/- согласуется с этой гипотезой, хотя и требует объяснения тому, какие механизмы индуцируют миграцию предшественников энтерических нейронов в области, тесно прилегающие к просвету, т.к. у животных дикого типа миграторные и постмиграторные недифференцированные клетки (производные нервного гребня) отсутствуют в мезенхиме, близко прилегающей к эндодерме. IHH и SHH вероятно являются генами-кандидатами, определяющими дефекты развития ЭНС у человека, но широкое распространение этой системы в черепно-лицевых областях, ЦНС и зачатках конечностей может свидетельствовать о том, что дефекты ЭНС являются лишь частью гораздо более сложных аномалий развития.

Neurotrophin signaling systems


Давно известно, что члены семейства нейротрофина (NT) и нейротрофные факторы (NGF, BDNF, NT-3 и NT4/5) играют важную роль в дифференцировке, росте и выживаемости многих частей нервной системы, включая симпатические нейроны и нейроны дорсальных корешковых ганглиев. Действие нейротрофинов опосредуется главным образом через Trk-рецепторные тирозин киназы. Хотя все нейротрофины (за исключением NT4/5) и все три Trk рецептора (TrkA, TrkB, и TrkC) присутствуют в развивающейся ЭНС многих видов, включая человека, пока нет доказательств, что нейротрофины играют какую-либо роль в раннем развитии ЭНС, за исключением NT-3. Исследования in vitro показали, что NT-3 способствует дифференцировке ЭНС предшественников, иммунноселектированных их эмбрионального кишечника, росту аксонов и дифференцировке нейронов в отдельных ганглиях крыс в постнатальный период [Saffrey et al.,2000]. Мыши с отсутствием NT-3 или его рецептора TrkС имеют сниженное число миэнтерических и подслизистых нейронов, а мыши, у которых имеется сверхэкспрессия NT-3, характеризуются повышенным числом миэнтерических, но не подслизистых, нейронов. Вероятно, что NT-3 необходим для развития субпопуляций энтерических нейронов [Chalazonitis A. et al. 2001].
Транскрипционные факторы
Транскрипционные факторы - это белки, регулирующие экспрессию генов посредством связывания с регуляторными элементами ДНК, стимулируя или репрессируя транскрипцию этих генов. Сами транскрипционные факторы часто связываются с ДНК-последовательностью относительно неспецифично, но в норме они комбинируются с другими транскрипционными факторами и формируют молекулярный комплекс, который таргетирует регуляторные элементы специфических генов или специфических наборов генов.
Phox2b
Гены, кодирующие Phox2a и Phox2b очень сходны, но не сцеплены и в геноме человека, и в геноме мыши. Ген, кодирующий PHOX2a локализован на хромосоме 11q13, PHOX2b - на 4p12 [Adachi et al.,2000]. Phox2a и Phox2b являются спаренными боксовыми гомеодоменными транскрипционными факторами, экспрессируемыми многими дифференцированными автономными нейронами, черепными ганглиями и ядрами заднего мозга. Оба белка экспрессируются всеми норадреналинергическими и некоторыми не норадреналинергическими нейронами, включая энтерические и парасимпатические нейроны. Phox2a ген, но не Phox2b ген, являются нижестоящей (downstream) мишенью другого транскрипционного фактора - Mash1 (Mash1 - Mammalian Achaete-Suite Homologue), но оба (Phox2a и Phox2b) регулируют экспрессию Ret (часть рецептора для GDNF) и экспрессию ферментов, участвующих в синтезе норадреналина - тирозин гидроксилазу и дофамин β-гидроксилазу. Phox2a-/- мыши не имеют явных дефектов в ЭНС, но у Phox2b-/- мышей отсутствует ЭНС во всех отделах ЖКТ. Фактически, у Phox2b-/- мышей полностью отсутствует периферическая автономная нервная система. У Phox2b нокаутных мышей клетки нервного гребня достигают переднего кишечника, но далее не мигрируют, что вероятно связано с отсутствием экспрессии Ret. Данные о связи мутаций PHOX2a или PHOX2b с дефектами ЭНС у человека отсутствуют.
Sox10 (доминантный ген мегаколона)
Гены большого Sox (Sry-box) семейства кодируют транскрипционные факторы, характеризующиеся общей последовательностью, названной high mobility group (HMG) box. Они являются основными в отношении ДНК-связывающей способности генов этого семейства. Несмотря на то, что все Sox гены имеют законсервированный HMG домен, каждый из них имеет набор уникальных нижестоящих (downstream) генных мишений, в зависимости от процессов (от детерминации пола до роста скелета), которые нарушаются при нокаутировании разных Sox генов. Такое специфическое ДНК-распознование связано с Sox белком, действующим как часть транскрипционного комплекса. Идентификация генов, контролирующих активность Sox белков, затруднена. Sox гены включаются в специфическое время в специфичных типах клеток и, следовательно, они имеют точные вышестоящие (upstream) регуляторы, которые пока неизвестны.
Имеется 4 типа синдрома Waardenburg (WS) с дефектами развития в клетках и структурах, происходящих из нервного гребня и др. зачатков нервной системы. Мутация в SOX10 (ген локализован на хромосоме 22q13) может вызвать Waardenburg-Shah синдром (WS4у человека) [Southard-Smith E. et al.,1999] и доминантный мегаколон у мышей [Southard-Smith E. et al.,1998], в обоих случаях с дефектом меланоцитов и ЭНС клеток (имеющих происхождение из нервного гребня). Причинами WS4 являются также мутации в ET-3 и ETB генах. Другой вариант WS может быть обусловлен мутацией генов двух других транскрипционных факторов - микрофтальмия-ассоциированным транскрипционным фактором (microphthalmia-associated transcription factor, MITF) при WS2 и Pax3 (paired box) при WS1 и WS3 соотв.
Имеется сообщение о больном с frameshift мутацией в SOX10, страдающем от хронической интестинальной псевдо-обструкции, глухоты и периферической нейропатии, ассоциированной с периферической гипомиелинацией, но без депигментации. Биопсия кишечника показала, что тельца нервных клеток и волокон присутствовали в миэнтерическом и подслизистом сплетениях, но осталось неясным, утрачена ли специфическая субпопуляция энтерических нейронов и в каком количестве присутствуют энтерические нейроны и глиальные клетки. В линии Шванновских клеток (происходящих из нервного гребня) Sox10 положительно регулирует промотор гена myelin protein zero P0, основного белка периферического миелина. Предполагается, что многие аномалии у больного с frameship мутацией в SOX10 (периферическая нейропатия, например) могут быть результатом дефекта в P0 белке. Но неясно, каким образом дефект в P0 белке может вызвать хроническую интестинальную псевдо-обструкцию, когда энтерические нейроны не миелинизированны, и, хотя некоторые vagal преганглионарные волокна миелинизированны, не сообщалось, что билатеральная ваготомия вызывает интестинальную псевдо-обструкцию.
Sox10 также активирует MITF промотор, его активность далее усиливается Pax3 белком. Sox10 и Pax3 также активируют Ret, играющую центральную роль в образовании ЭНС. Также как и у мышей Ret-/-, у мышей с отсутствием Sox10 вагальные клетки, происходящие из нервного гребня, гибнут перед самым вхождением в передний кишечник.
Sox10 экспрессируется в мигрирующих клетках нервного гребня и их производных у человека, мышей и цыплят. У птиц он экспрессируется сразу после экспрессии транскрипционного фактора типа цинковых пальцев (Slug), но неизвестно, активирует ли Slug белок Sox10. Slug относится к генам, побуждающим миграцию клеток нервного гребня.
Pax3
Pax3 относится к членам paired-box-containing семейства транскрипционных факторов. Больные с WS без HSCR обычно имеют мутации в PAX3 гене [Baldwin C.et al.1992]. Больные являются гетерозиготами по PAX3 гену, гомозиготы по этому гену летальны. У мышей Pax3 экспрессируется многими клетками-производными нервного гребня, включая энтерические нейроны и предшественники меланоцитов. Гетерозиготные мыши по Pax3 мутации имеют белые пятна на животе (Splotch фенотип), но не имеют дефектов ЭНС. Гомозиготы по этому гену погибают на средних стадиях внутриутробного развития, они имеют дефекты нервной трубки и сердца и отсутствие энтерических нейронов каудальнее желудка [Lang et al., 2000]. Pax3 необходим для инициации Ret экспрессии предшественниками энтерических нейронов (Рис.2), поэтому у Pax3-/- мышей отсутствует экспрессия Ret каудальнее желудка.

Mash1 (mammalian achaete-scute homologue 1)


Mash1 кодирует транскрипционный фактор, принадлежащий к basic helix-loop-helix (bHLH) семейству белков. У мышей он временно экспрессируется во время эмбриогенеза в ЦНС и во многих клетках, образующихся из нервного гребня, включая клетки, заселяющие кишечник. Mash1 у млекопитающих является гомологом achaete-scute комплекса Drosophila, участвующим в нейрогенезе центральной и периферической нервных систем. Mash1-/- мыши гибнут в течение 48 часов после рождения, у них отсутствуют симпатические и энтерические нейроны в пищеводе. У нокаутных мышей отсутствуют также нервные волокна, опосредующие релаксацию нижнего сфинктера пищевода, но присутствует внешняя иннервация пищевода из ствола мозга. У Mash1-/- мышей энтерические нейроны присутствуют в желудке, тонком и толстом кишечниках, хотя некоторые типы нейронов (например, серотонинсодержащие нейроны) отсутствуют в этих частях кишечника [218]. Во время развития Mash1-/- мышей клетки нервного гребня мигрируют и правильно локализуются в кишечнике, но не дифференцируются в нейроны. Т.е. Mash1 необходим для дифференцировки предшественников нейронов, но не требуется для миграции клеток нервного гребня. Mash1-/- мыши отличаются от фенотипа Ret-/-, gdnf-/- и gfrα мышей тем, что у них отсутствуют энтерические нейроны только в пищеводе, тогда как у мышей с отсутствием GDNF сигнального пути (см. выше) нейроны в пищеводе присутствуют, но отсутствуют в тонком и толстом кишечниках. Такие региональные различия фенотипов вызывают удивление, т.к. имеются доказательства, что Mash1 и Ret принадлежат к одному и тому же сигнальному каскаду (Рис.2) и большинство или все предшественники энтерических нейронов, независимо от области кишечника, экспрессируют и Mash1 и Ret. Предполагают, что региональные различия присутствия нейронов у различных нокаутных мышей могут быть связаны с различным росто-каудальным уровнем происхождения эзофагеальных нейронов из энтерических нейронов, которые присутствуют в более каудальных областях ЖКТ.
Человеческий гомолог Mash1, который на 95% гомологичен крысиному Mash1, изолирован и назван HASH1 (human acheaete-scute homologue 1). HASH1 экспрессируется предшественниками симпатических нейронов достаточно рано в эмбриональном развитии, на 6-7 неделе и в плодных легочных эндокринных клетках. Он также экспрессируется в опухолевых нейроэндокринных клетках при медуллярном тиреоидном раке (MTC), в малых клетках при раке легкого и при феохромацитомах. HASH1 ген содержит множественные повторяющиеся копии тринуклеотида CAG, которые уникальны для гена человека и не сохранились у гомолога грызунов. Повторы триплета CAG могут проявлять мейотическую нестабильность, такую как у FMR-1 гена при синдроме фрагильной X-хромосомы и у андрогенного рецептора человека при болезни Кеннеди. В настоящее время структурные изменения в HASH1 не связаны с каким-либо заболеванием человека.
Mash1-/- мыши с отсутствием нервных волокон в нижнем сфинктре пищевода имеют признаки, сходные с ахалазией пищевода человека. Ахалазия - заболевание, при котором нижний сфинктер пищевода не расслабляется в ответ на продвижение пищевого комка, что связано с нехваткой нервных волокон в мышце сфинктера, внешние нервные волокна не поражены. Ахалазия впервые проявляется у взрослых людей. Поскольку Mash1 экспрессируется только транзиторно во время эмбрионального развития и необходим для нейрональной дифференцировки, то мало вероятно, что такой дефект функции Mash1 лежит в основе ахалазии пищевода.

Hox11L1


Hox11 семейство (Hox11, Hox11L1, Hox11L2) состоит из генов, содержащих 180 гомеобоксных пар оснований, характеризующих их как транскрипционные факторы. Они экспрессируются не перекрывающимся путем в развивающейся нервной системе и других системах мышиного эмбриона. Hox11L1 ген локализован на хромосоме человека 2p13.1 [64] и экспрессируется в нейронах развивающейся ЭНС и других нейронах, являющихся производными клеток нервного гребня. Мыши с мутацией Hox11L1 гена (обозначаемые также как Tlx2, Enx и Ncx) развивают INDB -подобный синдром (мегаколон с гиперплазией ЭНС в ободочной кишке и гипоплазией в подвздошной кишке с последующей гибелью некоторых нейронов). Эти дефекты развития ЭНС не являются вторичными по отношению к другим аномалиям, т.к. ген экспрессируется в нейронах ЭНС. И хотя в настоящее время некоторые элементы этих генов были определены, нет никакой информации о генах, которые регулируют его не на транскрипционных мишенях HOX11L1. Такие гены могли бы быть кандидатами для INDB человека.

SIP1


Некоторые больные с HSCR, страдающие микроцефалией, субмукозной расщелиной неба и небольшим ростом имеют мутации SIP1 гена, локализованного на хромосоме 2q22. Предполагают, что дефекты являются результатом гаплонедостаточности SIP1, из-за нулевой мутации в одном аллеле. Исследования у мышей показали, что Sip1 - это Smad1-, 2-, 3- и 5-интерактивный белок, являющийся членом δEF1/Zfh-1 семейства цинковые пальцы/гомеодоменных белков. Smad белки являются основными для трансдукции TGF-β (включая Bmp-4) сигналов в ядра. Sip1 является репрессором транскрипции и может препятствовать транскрипционной активности, проходящей через Smad путь. Нет никаких сообщений о фенотипе мышей с отсутствием этого белка и о влиянии SIP1 мутации на фенотип HSCR.

Заключение


ЭНС формируется из мигрирующих клеток нервного гребня эмбриона. Аномалии в процессе образования ЭНС приводят к HSCR у человека. При этом состоянии наблюдается отсутствие энтерических нейронов в вариабельном по длине наиболее дистальном участке кишечника. Лечение заболевания в настоящее время сводится к хирургической резекции, которая хорошо отработана и отличается лишь некоторыми деталями. Другим врожденным заболеванием, связанным с нарушение развития ЭНС, вероятно является INDB, но его диагностика, лечение и даже само существование этой болезни вызывает споры и сомнения. В некоторых случаях известны генетические причины HSCR, обычно это мутации генов в GDNF или ET-3 сигнальных системах. Генетические основы INDB остаются неясными. Несмотря на достаточно глубокие исследования HSCR, многие случаи этого заболевания не могут быть описаны в системе известных генов. Кроме того, гено-фенотипические связи для HSCR не являются простыми и могут быть поняты только после глубокого изучения биологии развития ЭНС. Это является предметом обсуждения второй части обзора (Newgreen D, Young HM. Enteric nervous system: development and developmental disturbances-part 2. Pediatr Dev Pathol 2002;5:329.
Сайт создан в системе uCoz