Протеогликаны клеточной поверхности участвуют в адгезии клеток, в передаче сигналов факторов роста, активности липазы и антикоагуляции. Роль каждого индивидуального вида протеогликана на путях передачи клеточных сигналов известна. Большая трансмембранная группа heparan sulfate proteoglycans, syndecans, играют важную роль как добавочные сигнальные молекулы, модулирующие базирующуюся на интегринах адгезию.

Большинство составляющих клеточного поведения испытывает влияние или контролируется за счет взаимодейстивий с ВКМ. Интегрины, наиболее изученное семейство рецепторов для макромолекул матрикса. Известно, чтосемейство синдеканов, трансмембрнных протеогликано, м. действовать как ко-рецепторы, модулируя интегринами обусловленную межклеточную адгезию. Синдеканы м. контролировать клеточный фенотип и организацию актинового цитоскелета, а определенные события передачи сигналов появляются после связывания синдеканов с помощью heparin-связывающих сайтов в матричных молекулах. Связывание интегринов с матричными лигандами ведет к активации сложных нижестоящих сигнальных путей. Известно, что синдеканы функционируют как ко-рецепторы для сигнальных событий, инициируемых семейством fibroblast growth factor (FGF) и участвуют в др. биологических процессах. Вместе с интегринами они формируют двойную рецепторную систему, активную в соединениях клеток с матриксом и, по-видимому, в межклеточных соединениях.

PIP₂ PKC

Table 1. Functions of syndecans


	Syndecan


Function	-1	-2	-3	-4


Extracellular matrix interaction	+	+	ND^a	+


Anticoagulant interaction	+	ND	ND	+


Extracellular matrix assembly	ND	+	ND	ND


Growth-factor interactions	+	ND	+	+


Actin cytoskeleton regulation	+	ND	ND	+


Adhesion/migration	+	ND	ND	+

^aThere has not been an exhaustive investigation of each syndecan type for each function. In addition, many functions have been investigated using isolated glycosaminoglycan chains, whose extracellular interactions might differ when presented as a complex with the core protein. ND, not determined.

Heparan sulfate proteoglycans in cell adhesion

Протеолитические фрагменты плазматического фибронектина обладают `cell'- или `heparin'-связывающей активностью интактных молекул. Они содержат RGD последовательности, которые связываются с некоторыми интегринами, таким как α5β1. Два сигнала, возникающие в результате взаимодействий с этими двумя доменами, необходимы для формирования специализированных областей клетка-матрикс адгезий (focal adhesions), сопровождаемых организацией актинового цитоскелета в стрессовые волокна. Этот процесс не нуждается в синтезе белка, он лишь связан с перестройкой адгезивных компонентов, таких как vinculin и talin, и с системой микрофиламент. Однако необходимы heparan sulfate glycosaminoglycans на клеточной поверхности, т.к. обработка клеток heparinase предупреждает образование focal adhesions и стрессовых волокон.

Syndecans in signalling and cytoskeletal reorganization

Syndecan-1 был первым heparan sulfate proteoglycan секвенирован, затем syndecan-2 (fibroglycan), syndecan-3 (N-syndecan) и, наконец, syndecan-4 (amphiglycan, ryudocan). Структура синдекана на Рис. 1. Размеры синдекановых белков от ~45 kDa (syndecan-3) до ~20 kDa (syndecan-4). Предполагаемая молек. масса намного выше SDS–PAGE благодаря ассоцииации стержневого белка и гликозаминогликановым заменам. Большая часть стержневого белка вне клетки: синдеканы имеют одиночную трансмембранную область и короткий цитоплазматический домен. Все синдеканы обладают тремя ковалентно присоединенными цепочками heparan sulfate glycosaminoglycan и иногда цепочками chondroitin sulfate. Цепочки glycosaminoglycan как известно соединяются с heparin-связывающими половинками матричных молекул, но роль стержневых белков только начинает выясняться. Четыре syndecans млекопитающих экспрессируются в заивисимости от стади, типа клеток и ткани. Во взрослых тканях syndecan-1, -2 и -3 являются основными синдеканами в эпителиальных клетках, фибробластах и нейрональных клетках, соотв. Во время развития, однако, обнаруживаются колебания экспрессии синдеканов. Напр., имеется временная экспрессия syndecan-1 в презумптивных мезенхимных придатках кожи. Syndecan-4, напротив, обычно присутсвует в меньших количествах, чем основные виды синдеканов, но более широко распределены и только один синдекан постоянно обнаруживается в фокальных адгезиях. Syndecan-4 колокализуется с интегринами в фокальных адгезиях (<Рис. 2) в ряде клеточных типов и на ряде субстратов. Их инсерция в фокальные адгезии, по-видимому, независима от типа интегрина, т.к. колокализуется с интегринами 1 в клетках на фибронектине и с β3 на vitronectin, но зависит от активации protein kinase C (PKC). Фармакологическая активация PKC м. обойти необходимость в гепарин-связывающей активности фибронектина и индуцирует релокацию syndecan-4 в фокальные адгезии, тогда как ингибиторы PKC м. препятствовать образованию фокальных слипчивых соединений.

Figure 1. Diagram of the structure of syndecans; shading indicates regions that are homologous between different syndecans. All syndecan core proteins, which are type 1 membrane proteins, possess unique ectodomains, which bear no homology except at the sites to which three heparan sulfate glycosaminoglycan chains (G) are normally attached. Each core protein also has a highly conserved transmembrane domain (TM). The short cytoplasmic domains contain two highly conserved regions (C1 and C2), between which the sequence is unique (V). The size of syndecan core protein ranges from 20–45 kDa, but they show higher apparent mass by SDS–PAGE owing to core protein self-association and the presence of covalently attached glycosaminoglycan chains.

Figure 2. Syndecan-4 colocalizes in focal adhesions with integrin β1 subunits. Rat embryo fibroblasts were fixed, permeabilized and dual-labelled with antibodies against syndecan-4 cytoplasmic domain (a) and integrin β1 (b). Both antibodies labelled focal adhesions. Bar, 10 µm.

Активация внутриклеточного каскада киназ сопровождается взаимодействиями клеток с матриксом. Интегрины являются первичными рецепторами, а взаимодействия между интегринами и матриксом существенны для прикрепления клеток и полного распластывания. Активация тирозин киназы сопровождается образованием кластеров интегринов или на прикреплениях клеток к фибронектину или вследствие инкубации с антителами против против интегринов, что ведет к фосфорилированию некоторых компонентов фокальных адгезий. В самом деле, ингибирование тирозин киназы предупреждает полное распластывание клеток и образование фокальных адгезий. Однако, PKC также активируется во время распространения клеток и ее ингибирование редуцирует и распластывание (spreading) и препятсвует образованию фокальных адгезий. Одновременное образование кластеров из компонентов фокальных адгезий является иерархическим, некоторые необходимы непосредственно для лигации интегрина, другие потребны для образования кластеров интегрина и еще одни для вовлечения цитосклета. Точная последоваельность активации энзимов и релокации компонентов в собираемые фокальные адгезии неизвестны.

Syndecan-1 м. взаимодействовать с актиновым цитосклетом, если кластрируется с помощью антител и это зависит от интактного цитоплазматического домена. Ассоциация микрофиламент м.б. также индуцирована образованием кластеров с лигандами, такими как basic fibroblast growth factor (bFGF) или коллагеном типа I. Экспрессия syndecan-1 в Schwann клетках драматически увеличивает клеточное spreading и образование стрессовых волокон. Однако, его ко-распределение с микрофиламентами лишь временно во время spreading клеток и он не оказывается включенным в фокальные адгезии. Syndecan-3 также м. ассоциировать с цитоскелетом, если кластирован. Экспрессия syndecan-1, по-видимому, предопределяется эпителиальной морфологией, т.к. трансфекция антисмысловой кДНК для синдекана-1 превращает эпителиальные клетки молочных желез в клетки с морфологией фибробластов и такие клетки м. инвазировать в коллагеновый гель. Это коррелирует со снижением экспрессии E-cadherin, указывая тем самым, что некоторые поперечные связи образуются между рецепторами межклеточной адгезии и синдеканами. Это подтверждается и снижением экспрессии syndecan-1, когда снижается экспрессия E-cadherin. Сходным образом, экспрессия syndecan-1 в лимфоцитах коррелирует со снижением инвазии в коллагеновый гель. Syntenin - адапторный белок, который соединяется с FYA C-терминальными последовательностями syndecan стержневых белков. При избыточной экспрессии в клетках CHO он ко-локализуется с клеточными мембранами, ко-трансфицированными синдеканами, а его избыточная экспрессия индуцирует усиление cell spreading и формированиее мемьранных выпячиваний. Все это указывает на то, что синдеканы м. модифицировать драматически integrin- и cadherin-обусловленную клетка-матрикс и клетка-клетка адгезию.

Molecular interactions with syndecan cytoplasmic domains

Две большие области цитоплазматического домена синдеканов взаимодействуют с цитоплазматическими компонентами и м. участвовать в ассоцииации с цитоскелетом или передаче сигналов в ответ на взаимодействия с матриксом. Синдеканы являются типа I трансмембьрнными белками; N-терминальные эктодомены содержут консенсусные последовательности для прикрепления гликозаминогликанов, но во всем остальном они сильно дивергировали, даже если сравнивать один синдекан у разныха видов. Напротив одиночный трансмембранный домен и короткие цитоплазматические домены четырех синдеканов млекопитающих высоко законсервированы, особенно в C1 и C2 регионах цитоплазматического домена (Рис.1, 3). Регион C2, по-видимому, ответственен за связывание с syntenin, следовательно, это взаимодействие законсервировано у всех синдеканов.

Figure 3. Cytoplasmic amino acid sequences of syndecans and reported interactions. (a) The amino acid sequences are shown by the one-letter code, with spaces for alignment. (b) The constant (C1 and C2 regions) and variable (V) regions are shown, together with demonstrated interactions. Asterisks (*) denote differences, and `B' denotes basic amino acids. Abbreviations: PIP₂, phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate; PKC, protein kinase C.

Между законсервированными C1 и C2 последовательностями имется короткий участок аминокислот (регион V) уникальный для каждого синдекана. Области V syndecan-4 и syndecan-2 имеют разные свойства. Синдекан-4 стержневой белок, когда экспрессируется как GST слитый белок, усиливает в 3-4 раза phospholipid-обусловленную активацию PKC. Это происходит или в смеси очищенных протеин киназ Cαβγ или у рекомбинантной PKCα, которая сама по себе м.б. компонентом фокальных адгезий. Активность, обеспечиваемая с помощью региона V syndecan-4, теряется при укорочении С-терминальных 11 аминокислот и syndecan-4 V область, синтеничная пептидам (LGKKPIYKK), м. замещать весь стержневой белок. Напротив, пептиды представляющие собоей весь цитоплазматический домен синдекана-2 или его область V, не регулируют активность PKC , но сами являются субстратом для этой киназы и для протеин киназы А. Пептиды Syndecan-4 и слитые блеки м. также связываться с и активировать протеин киназу М, постоянно активный каталитический домен протеин киназы Cα, указывая тем самым, что связывание синдекана-4 отличается от такового, которое описано для RACKs (receptors for activated kinase), которые соединяются с регуляторным доменом.

Активация PKC с помощью syndecan-4 fusion белков и пептидов зависит от их олигомеризации. Все синдеканы формируют нековалентные димеры, резистентные к SDS–PAGE. Кроме того, они м. формировать олигомеры высшего порядка благодаря взаимодействиям трансмембранного и ближайшего к мембране эктодоменов. Олигомеризация syndecan-4 V области пептидов указывает на наличие др. сайта само-ассоциации, а анализ с помощью ядерного мегнитного резонанса подтвержает налдичие упорядоченных параллельных рядов(D. Lee et al., pers. commun.). Олигомеризация и способность модулировать активность protein kinase C α теряются, когда в синтетических пептидах производится замена консервативных аминокислот. Степень олигомеризации, по-видимому, коррелирует со степенью активации киназ, указывая, что in vivo, степень кластрирования syndecan-4 core белков в ответ на лиганд м. регулировать активность PKC. Сходным образом димеризация syndecan core белков м. б. необходима для взаимодействия с syntenin.

Syndecan-4 связывается также с phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate [PtdIns(4,5)P₂] через V регион. Это усиливает олигомеризацию цитоплазматического домена syndecan-4 и потенциирует PtdIns(4,5)P₂-обусловленную активацию PKC примерно в 10 раз. PtdIns(4,5)P₂ образуется в результате повышенной активности PtdIns4P 5-kinase сопровождающей лигацию интегрина. Он связывается с регуляторным доменом PKC, тогда как syndecan-4 V область связывается с каталитическим доменом киназ, указывая тем самым на то, что они формируют четвертичный комплекс. Т.о., взаимодействия интегринов с лигандом, которые необходимы для прикрепления и spreading, м. обеспечивать повышенные уровни PtdIns(4,5)P₂ в точках инициального кластрирования интегринов. Это м. взаимодействовать с syndecan-4 и/или PKC. Частичная активация PKC с помощью PtdIns(4,5)P₂ м. затем усиливаться, если syndecan-4 core белок индуцируется к образованию кластеров путем взаимодействия с гепарин-связывающими лигандами. Это м. вести к увеличению степени фосфорилирования или к селективному фосфорилированию др. компонентов фокальных адгезий при сборке адгезивных комплексов. В самом деле, антитела против PtdIns(4,5)P₂ препятствуют образованию интегринами-обусловленных фокальных адгезий, а кластрирование syndecan-4 эктодоменов с антителами м. индуцировать образование фокальных адгезий в клетках pre-spread на субстратах, покрытых фибронектином с интегрин-связывающим доменом. Более того, трансфекция syndecan-4 дикого типа в клетки CHO усиливает распространение клеток и формирование фокальных адгезий и стрессовых волокон, тогда как экспрессия syndecan-4 core белка, укаороченного по V области действует доминантно-негативно для образования фокальных адгезий.

Figure 4. Schematic diagram showing the proposed interactions between the cytoplasmic domains of dimerized syndecan-4, phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PIP₂), protein kinase C (PKC) and syntenin. The proteoglycan core protein, PIP₂ and PKC might form a ternary complex that both localizes PKC to assembling focal adhesions and potentiates its activity. The components are not drawn to scale: one PIP₂ molecule appears to bind to a dimer of syndecan-4 V region, but the stoichiometry of PKC binding is unknown.

Future directions

Синдеканы, по-видимому, модулируют базирующиеся на интегринах процессы клеточной адгезии, возможно с помощью регуляции степени олигомеризации синдекана. Модуляция м.б. связана с некоторыми законсервированными сигнальными системами, по-видимому, с передачей сигналов ростовых факторов, которая также использует синдеканы. Наблюдается фосфорилирование тирозина syndecan-1, хотя эффект этого на клеточную адгезию или олигомеризацию синдеканов неизучен. Syndecan-2 м.б. фосфорилирован PKC, а syndecan-4 м. связывать и активировать PKC; оба эти процесса зависят от степени олигомеризациии синдекана. Известны также взаимодействия между синдеканами и интегринами, или непосредственно через core белок или glycosaminoglycan цепочки, или косвенно через ассоциацию с цитоскелетом. Однако, эти two-receptor system функции, специфичность связывания glycosaminoglycan–ligand должны регулироваться , т.к. гликозилирование всех синдеканов, присутствующих в любом специфическом типе клеток, м.б. сходным, тогда как биологические эффекты синдеканов, по-видимому, отличны.

Kinnunen et al. [J. Biol. Chem. (in press)] продемонстрировали взаимодействие C1 домена syndecan-3 с Src-kinase и cortactin. Horowitz and Simons [J. Biol. Chem. (in press)] сообщили, что фосфорилирование серинового остатка syndecan-4 C1 домена м. регулироваться с помощью bFGF.

)

Синдеканы в сердце