STATS Signaling

STATS: TRANSCRIPTIONAL CONTROL AND BIOLOGICAL IMPACT
David E. Levy & J. E. Darnell
Nature Reviews Molecular Cell Biology 2002 Vol 3 No 9 Р 651-662


Extracellular proteins bound to cell-surface receptors can change nuclear gene expression patterns in minutes, with far-reaching consequences for development, cell growth and homeostasis. The signal transducer and activator of transcription (STAT) proteins are among the most well studied of the latent cytoplasmic signal-dependent transcription-factor pathways. In addition to several roles in normal cell decisions, dysregulation of STAT function contributes to human disease,making the study of these proteins an important topic of current research.


(Рис.1.)  |  Canonical JAK–STAT pathway.


(Рис.2.)  |  Janus kinase domain structure.


(Рис.3.)  |  STAT domain structure and protein binding sites.


(Рис.4.)  |  The negative regulators of STAT proteins.

(Табл.1) | Role of Janus kinases as revealed by gene-targeting in mice

(Табл.2) |Role of SOCS proteins as shown by mouse genetics

(Табл.3) Role of STAT proteins as revealed by gene-targeting in mice

(Табл.4) Tissue-specific roles of Stat3 as revealed by conditional gene targeting in mice

Boxes


(Box 1.)  |  Variations in mechanisms of STAT activation

Box 2 | Transcriptional stimulation without phosphorylation

The first indication that signal transducers and activators of transcription (STAT) proteins might have a role in gene expression as unphosphorylated molecules came from experiments using genetically selected human cancer cells in culture that lacked STAT1 (U3A cells). Such cells did not undergo apoptosis upon challenge until STAT1 expression was restored. The U3A cells lacked a full component of CASPASES, which are present in the U3A cells that express STAT1. However, the apoptotic response did not require wild-type STAT1; a STAT1 Y701F mutant (in which Y is tyrosine and F is phenylalanine), which cannot be phosphorylated on tyrosine, still conferred the ability to respond to apoptotic signals. Subsequently, several other proteins involved in apoptosis were also found to be restored to U3A cells by the STAT1 Y701F mutant.

More recently, gene-array experiments using U3A cells (lacking STAT1) and cells with restored STAT1 were compared without IFN-γ stimulation. A set of genes was found in which the genes were not dependent on IFN and whose mRNAs were present when STAT1 was added back to the U3A cells. One of these genes, termed low molecular weight polypeptide 2 (LMP-2), was studied in detail. STAT1 was constitutively bound to the promoter of this gene in cells not stimulated by IFN and in which no tyrosine phosphorylation of STAT1 could be found. The STAT1 was associated with the promoter, presumably because of its association with interferon regulatory factor-1 (IRF1 — a known binding partner of STAT1) that was also present at the LMP-2 promoter, and can bind DNA on its own. So, it seems clear that unphosphorylated STAT proteins can have a role in transcription, even though it is evident that the main transcriptional stimulation by STATs follows tyrosine phosphorylation, dimerization and nuclear accumulation.



Links



DATABASES
LocusLink: androgen receptor | caveolin-1 | CBP | C/EBP | CIS | c-Jun | EGF | EGF receptor | IFN-α receptor | Ifn-γ | IFN-γ | IFN-γ receptor | IGF-1 | Il-4 | IL-6 | IL-12 | importin-α5 | IRF1 | IRF9 | JAK | Jak1 | JAK1 | leptin | LMP-2 | MCM3 | MCM5 | Nmi | Nup98 | p53 | PIAS1 | PIAS3 | Ptp1b | PTP1B | Socs1 | Stat1 | STAT1 | STAT3 | STAT4 | STAT5A | STAT5B | transforming growth factor-β | TYK2
Flybase: 92E | dPIAS | eve | hopscotch | os
Cancer.gov: head and neck cancer | leukaemia




Kermorgant, S. & Parker, P. J.
Receptor trafficking controls weak signal delivery: a strategy used by c-Met for STAT3 nuclear accumulation.
J. Cell Biol. 182, 855–863 (2008) Article


MET, Tyr kinase рецептор hepatocyte growth factor (HGF), активирует разные сигнальные пути, включая AKT/protein kinase B (PKB), extracellular signal-regulated kinase (ERK), Rac и signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3). Но как эти разные нижесоящие пути специфически регулируются и координируются? Stephanie Kermorgant и Peter Parker описали неожиданную связь между силой сигнальной реакции и доставкой рецепторов и нижестоящих сигнальных компонентов.
STAT3, как полагают, фосфорилируется (и затем активируется) ниже активированных рецепторов на плазматической мембране. Активированный STAT3 транслоцируется в ядро, где он контролиует экспрессию генов. В самом деле, это необходимо для сильной активации STAT3 с помощью cytokine oncostatin M. Напротив, MET вызывает слабую активацию STAT3. Как же может слабый сигнал STAT3 достигать своей цели в ядре? Анализируя живые клетки, авт. установили, что HGF стимуляция заставляет MET и STAT3 ко-локализоваться в эндосомах в околоядерной области, где STAT3 фосфорилируется.
Блокирование трафика эндосом микротрубочками предупреждает фосфорилированые STAT3 от накопления в ядре, но не влияет на транслокацию в ядро ERK1/2 (это указывает на сигнальную специфичность) или oncostatin-M-обусловленное накопление в ядре STAT3. Эти находки указывают на то, что сильный STAT3 сигнал обеспечивается посредством цитозольной диффузии, тогда как слабый сигнал (как видно из этого исследования) для MET нуждается в зависимом от микротрубочек околоядерном накоплении активированных рецепторов. Таким способом MET гарантирует, что её слабый STAT3 продукт будет защищен от инактивирующих фосфатаз, которые находятся между плазматической мембраной и ядром. В согласии с этой гипотезой то, что эндосомный трафик не нужен в присутствие ингибитора фосфатаз. в
Это исследование элегантно показало, как слабые сигналы могут эффективно передаваться в ядро, за счет использования эндосомных компернтментов. Используется ли эта стратегия и др. рецепторами, пока неясно.
Транскрипционные факторы STAT (signal transducers and activators of transcription) являются латентными в цитоплазме до тех пор, пока они активируются внеклеточными сигнальными белками (в основном цитокинами и факторами роста,но и некоторыми пептидами) которые соединяются со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Эти внеклеточные сигнальные белки м. активировать различные тирозин киназы в клетках, которые фосфорилируют STAT белки. Активированные STAT белки накапливаются в ядре и управляют транскрипцией. Продолжительность и степень активации гена находится под строгой регуляцией серии негативно действующих белков (Рис. 1, 2).

Pathways leading to STAT activation


Как и в случае STAT proteins 1 и 2, которые были октрыты как мишени для активации интерфероном, все белки STAT м.б. активированы после взаимодействия одного или нескольких цитокинов со своими cognate рецепторами (Box 1).

Подробности см. ЗДЕСЬ
Базовая модель для таких цитокиновых путей зависит от серии из трех фосфориляций тирозинов, которые осуществляются Janus kinase (JAK), которые нековалентно связаны со специфическими рецепторами (Рис. 1). Димеризация или олигомеризация рецепторов ведет к аппозиции JAK и трансфосфорилированию тирозиновых остатков, высвобождению их внутренней каталитической активности. Фосфорилирование тирозинов активированными JAKs в цитоплазматических доменах цитокин-рецепторов (cytokine-receptor) создает затем сайты для Src-homology-2 (SH2) DOMAIN белков STAT. Белки STAT затем рекрутируются к JAKs, вследствие чего они фосфорилируются по одиночному остатку тирозина (около остатка 700 из их 750–850-amino-acid последовательностей). Взаимодействия и последствия связывания STAT с JAKs хорошо изучены, STAT1, STAT3 и STAT5, по крайней мере, м.б. также активированы с помощью др. рецепторов или тирозин-киназа взаимодействий (Box 1).
Независимо от того, как тирозин STATs фосфорилируется, ясно, что STAT–STAT взаимодействие происходит немедленно благодаря реципрокным взаимодействиям phosphotyrosine–SH2. STAT1, STAT3, STAT4, STAT5A и STAT5B образуют гомодимеры. STAT1 и STAT2, а также STAT1 и STAT3 м. также давать и гетеродиеры в зависимости от природы и концентрации активирующего лиганда. In vitro фосфорилирование тирозина сопровождается количественным образованием димеров. Возможно, что димерная (или более высокого порядка) природа активированных рецепторов ведет к активации соседними стимулами двух молекул STAT — по одной каждым рецептором комплекса — это сопровождается SH2–phosphotyrosine-обусловленной димеризацией STAT, служащей средством отсоединения от рецептора или киназы.

JAKs


JAKs характеризуются С-терминальным каталитическим доменом и родственным, но ферментативно неактивным, соседним псевдо-киназным или киназа-подобным доменом. Они содержат также 5 дополнительных блоков со сходными последовательностями по всей N-терминальной области (Рис. 2). Свойства этих последовательностей и определяют 4 члена семейства JAK (Табл. 1). Сравнение последовательносей генома человека и мыши показывает, что нет др. JAKs. Генный таргетинг у мышей показал. что каждый энзим выполняет в основном неперекрывающиеся функции, которые м.б. в основном — если не полностью — объяснены свойствами передачи сигналов цитокинами. (Табл.1).
Структура JAK еще не установлена. Их киназные домены, помимо обычной их роли в катализе, являются также избирательными мишенями для ингибирования с помощью suppressor of cytokine signalling (SOCS) белков. Более того, псевдо-киназные домены м. также регулировать негативно катализ и м. играть роль в распознавании субстрата. Мутации в этой области, по крайней мере у Drosophila melanogaster, м. приводить leukaemia-подобным клеточно-пролиферативным заболеваниям из-за unopposed киназной активности. Предполагается, что эти белки имеют SH2 домен, хотя функция этого домена остается неясной. Фактически, законсервированный аргинин, который обнаруживается во всех SH2 доменах — водородные мостики которого идут к фосфотирозиновым остатккам во взаимодействующих белках — является гистидином в tyrosine kinase 2 (TYK2) и мутирует к аланину в JAK1 без всяких последствий. Это открывает интересную возможность, что этот домен является сайтом связывания для нечто иного, чем фосфотирозин, что м. регулировать активность JAK.
Более проксимальные N-терминальные области JAK белков непосредственно участвуют в селективных взаимодействиях с цитокиновыми рецепторами. Кроме того, как это было показано interferon α (IFN-α) receptor, а теперь и для некоторых др., это взаимодействие вносит вклад в функцию CHAPERONE, которая облегчает экспрессию комплекса рецептор-киназа на клеточной поверхности. Взаимодействия между некоторыми из этих N-терминальными доменами и каталитическим доменом участвуют также в регуляции ферментативной активности.

Unphosphorylated cytoplasmic STAT proteins


Молекулярное состояние STATs в цитоплазме перед активацией до конца непонятено, описано несколько возможностей, нуждающихся в дальнейшей проверке. Определенно имеются белки, которые м. связывать STATs в цитоплазме, хотя физиологическая роль этих взаимодействий еще нужно уточнять. Идентифицированы взаимодействующие со STAT партнеры, которые м. облегчать присоединение к рецепторам для усиления передачи сигналов. Один из таких белков является также компонентом комплекса RNA-polymerase-II элонгации и м. также облагчать STAT-зависимую транскрипционную активность после транслокации в ядро. Более того, димеризация нефосфорилированных STATs в цитоплазме, возможно в ассоциации с дополнитоельными клеточными белками, также описана и м.б. общим состоянием для нефосфорилированных STAT1 и STAT3. На базе кристаллической структуры фосфорилированного и нефосфорилированного STAT1, эти комплексы могут не иметь одну и ту же структуру в виде димеров, которые связываются с ДНК. STAT3 в клетках HEPATOMA существует в основном в ассоциации с большим белковым агрегатом. Такие комплексы м. обеспечивать механизм секвестрирования STAT белков до активации или служить платформой, которая позволяет эффективный доступ к рецепторам плазматической мембраны.

Effects of crosstalk on STAT activation


Степень STAT активации м.б. изменена с помощью предварительного воздействия на клетки др. стимулов, которые соединяются с др. рецепторами, т.наз. помех (crosstalk). Т.к. клетки в теле часто продуцируют более одного цитокина или ростового фактора, то такое взаимодействие (crosstalk) возможно представляет физиологически важный контроль активности STAT.

Positive crosstalk.
Хорошо известен пример позитивного вмешательства - это эффект type-I IFN (α и β) на передачу сигналов от type-II IFN (γ) receptor и наоборот, и на рецепторы interleukin-6/glycoprotein-130 (IL-6/gp130) семейства. Напр., предварительное воздействие на клетки IFN-γ строго увеличивает последующую реакцию на IFN-α. Это вмешательство м.б., по крайней мере частично, объяснено увеличениме количества interferon regulatory factor 9 (IRF9; первоначально названного p48), продукта IFN-индуцибельного гена, который является частью IFN-α-индуцируемого транкрипционного комплекса, IFN-stimulated gene factor 3 (ISGF-3). Сходным образом, воздействие IFN-α увеличивает количество клеточного STAT1, делая послеюдующую реакцию на IFN-γ более сильной.
Пост-трансляционная модификация STATs также ведет к позитивному вмешательству. Напр., фосфорилирование STAT1 по S727 существенно увеличивает его транскрипционную потенцию. Это фосфорилирование происхдит в ответ на бактериальную инфекцию независимо от фосфорилирования тирозина и является важным компонентом патоген-зависимого INNATE IMMUNE RESPONSES, существенно усиливающего транскрипционную компетентность после последующего воздействия IFN.
Увеличение уровня рецепторного сигнального комплекса также наблюдается, возможно, благодаря присутствию мнощественных цитокиновых рецепторов внутри дискретных доменов плазматической мембраны, известных как LIPID RAFTS. Близость может приводить к усилению передачи сигналов, когда лиганд-зависимая активация одного рецептора приведет к активации соседнего рецептора, возможно, благодаря перекрестному фосфорилированию или подавлению модуляции неспецифических ингибирующих эффектов на передачу сигналов с помощью caveolin-1, основного составляющего липидных платформ.

Negative crosstalk.
Хорошо известны примеры негативного вмешательства, связанные с негативной петлей обратной связи с помощью SOCS белков. Эти цитокин-индуцибельные киназные ингибиторы являются очень разнородными как в отношении их эффекта на индукцию различных цитокинов, так и их способности ингибировать отдельные комплексы рецептор-киназ. Следовательно, индукция SOCS белков с помощью одного цитокина м.б. ингибирована др. путем благодаря уже накопленным большим количествам ингибитора. Негативное вмешательство (crosstalk) со стороны non-STAT сигнальных путей также происходит, хотя лежащие в основе молекулярные механизмы неясны. Напр., стимуляция цАМФ с помощью mitogen-activated protein kinases или glucocorticoid-зависимым сигнальными путями м. вести к ингибированию последующей цитокин-зависимой стимуляции фосфорилирования STAT. Такое вмешательство, возможно, играет роль в нормальном гомеостазе и контроле воспаления. Определение степени и специфичности позитивных и негативных вмешательств необходимо делать и дальше.

Structure of STAT proteins


Было показано, что С-концы STAT содержат TRANSACTIVATION DOMAIN (TAD), которому предшествует SH2 домен и что тирозиновый остаток, который становится фосфорилированным расположен между двумя доменами. Более того, ДНК-связывающий домен расположен в центре молекулы (Рис.. 3b). Это подтверждается кисталлографическими исследованиями стержневых аминокислот (остатки ~130–710) или димерного STAT1 или димерного STAT3, связанных с ДНК, которые обладали очень сходными харатеристиками (Рис. 3a).
Начиная с остатка 130, имеется четерехнитчатая helical coiled coil, которая представляет широкие возможности для межбелковых взаимодействий. Взаимодействия с некоторыми белкаим документированы. ДНК связывающая складка между остатками 320 и 490 содержит различные β-пласты, которые сложены также, как и те, что найдены в ДНК-связывающих доменах транскрипционных факторов, ядерного фактора κB (NF-κB) или p53. Контакт с ДНК ограничен, но происходит как в большой, так и малой бороздах. Напр., в STAT1, N460 и K336 контактируют с большой бороздой, а E421 контактирует с минорной бороздой. (N это asparagine, K - лизин, а E - glutamic acid). Линкерный домен является высоко законсервированной структурой с неизвестной функцией, он находится между остатками 490 и 580. Мутации внутри этого домена затрагивают стабильность связывания ДНК, они ведут к быстрому off-rate и неспособности активировать гены после IFN-γ индукции. Классическая SH2 структура находится между остатками 580 и 680, сопровождается тирозиновым остатком (~700), который фосфорилируется. С-терминальный TAD (38–200 остатки в разных STAT белках), структура, которого неизвестна и м. б. выявлена только после связи с др. белками.
Кристаллическая структура N-конца (остатки 1–130) STAT4 решена независимо от стрежневой структцры и представлена серией из 8 коротких интерактивных спиралей (Рис. 3). N-концы др STAT, по-видимому, имеют сходную струткру, благодаря сходсту структурно важных аминокислотных остатков на их N-концах, но они м. б не полностью эквивалентны. Присутствие фосфотирозинового димера на N-конце STAT белков важно для активации генов. Имеются два STAT-связывающих сайта, разделенные ~20 парами оснований, у большинства генов и они оккупированы тетрамерами (dimer–dimer парами). Без N-конца стержневой STAT м. связывать один сайт, но при этом не образуются тетрамеры и , следовательно, связывание сайтов в тендем не облегчается. Образование тертрамеров существенно усиливает STAT–ДНК взаимодействие соседних сайтов и необходимо для максимальной активации транскрипции на определенных естественных промоторах. N-терминальный домен влияет на индукцию транскрипции дополнительными путями, такими как влияние на распознавание и фосфорилирование рецепторов, транслокацию в ядрои дефосфорилирование.
Неизвестна структура STAT димеров без ДНК DNA, мы не знаем, как N-конец упаковывается со стержневой структурой перед или после связывания ДНК. Любые струткрные изменения, которые происходят после димеризации, остаются низвестными.

Nucleocytoplasmic transport


Importing STAT proteins into the nucleus.
Вскоре после лиганд-зависимого фосфорилирования тирозина и димеризации STATs накапливаются в ядре. Такие большие белковые комплексы (~180 kDa для STAT димера) нуждаются в помощи для транспортировки в ядро. Описано связывание STAT1 с importin-α5, одной из субъединиц нуклеоплазмической транспортной кухни (machinery), а мутагенные исследования установили, что L407, K410 и K413 (внутри ДНК-связывающего домена) в STAT1 являются критическими остатками для ядерного транспорта tyrosine-фосфорилированных STAT1. Когда importin связан, то STAT димеры не м. связаться с ДНК, а если комплекс importin–STAT вступает в ядро, то он м. нуждаться в ДНК exploration, чтобы вытеснить импортин. По крайней мере в некоторых клетках, некоторые (нефосфорлированные) STAT1 м. вступать в ядро и это не затрагивается мутациями L407. Это особенно наглядно в генетически селектированных опухолевых клетках человека, в которых STAT1 полностью отсутствует (U3A клетки; Box 2). Некоторые мРНК, которые необходимы для STAT-управляемого апоптоза в таких клетках, не образуются пока не экспрессируется STAT1. Даже когда STAT1 экспрессируется, рассматриваемые мРНК формируются в отсутствие фосфорилирования тирозина в STAT1; клетки м. затем подвергаться индуцированному апоптозу. Нефосфорилируемые STATs, как полагают, взаимодействуют с др. транскрипционными фактрами на ДНК и помогают стимулировать транскрипцию.

Nuclear export of STAT proteins.
Экспорт STAT1 из ядра, по-видимому, зависит от остатков в COILED-COIL DOMAIN, а также в ДНК-связывающем домене. Находятся ли эти остатки, участвующие в нуклеоцитоплазматическом транспорте, в аналогичной позиции у др. STATs неясно, неизвестно и какое структурное состояние принимают STAT белки во время транзита. Дефосфорилирование STATs происходит в ядре и важным является сигнал для экспорта обратно в цитоплазму. Для STAT1 и STAT3 получены доказательства, что в процесс вовлечена TC45 (ядерная тирозин фосфатаза)в качестве STAT ядерной фосфатазы. Клетки без этого энзима хранят фосфорилированные по тирозину STAT1 значительно дольше, чем нормальные клетки, а избыточная экспрессия TC45 ведет к дефосфориляции STAT5. Однако, TC45 участвует также в регуляции цитоплазаматических событий дейосфорилирования, таких ка дефосфорилирование JAK1 и JAK3. Др. фосфатазы, такие как SH2-containing phosphatase 1 (SHP1), SHP2 и protein-tyrosine-phosphatase 1B (PTP1B) также участвуют и в качестве цитоплазматических регуляторов фосфорилирования JAK или STAT.
Прорисовывается общая схема ядерноцитоплазматического транспорта STAT1 после воздействия IFN на клетки: фосфорилирование тирозина и димеризация способствуют связыванию импортина, вообще-то за счет изменений конформации, в результате чего открывается область, содержащая L407. Затем происходит связывание импортина и ГТФ-зависимая транслокация. Или из-за того, что tyrosine-phosphorylated STAT1 теперь обладают конформацией, которая менее благоприятна для белков экпортной конторы (machinery), таких как chromosome region maintenance protein (Crm1 — белок ядерного экспорта), или из-за того, что фосфорилированные STAT1 ассоциированы обратимо с ДНК и задействуют необходимые сайты связывания — которые закупоривают необходимый сигнал для экспорта — tyrosine-phosphorylated STAT1 димер остается в ядре до тех пор, пока он не потеряет свой фосфорилированный тирозиновый остаток, тогда он возвращается в цитоплазму. На базе ингибирования staurosporin дальнейшего фосфорилирования тирозина, время цикла (активация-инактивация) для индивидуальных STAT1 молекул в EUPLOID фибробластах ~20 мин. Это указывает на то, что некоторые циклы фосфорилирования STAT, миграции в ядро, дефосфорилирования и экспорта и ре-фосфорилирования и ре-импорта происходят во время полного транскрипционного ответа на стимуляцию цитокином. Продолжительность фосфорилирования STAT (и , следовательно, транскрипционная активность) регулируются с помощью баланса рецепторами управляемой JAK каталитической активности и конституитивного ядерного дефосфорилирования.

Cytoplasmic tyrosine phosphatases.
Имеется несколько типов негативных регуляторов белков STAT в цитоплазме клеток. Дефосфорилирование тирозина рецепторных или киназных сайтов с помощью SHP1, SHP2 или PTP1B ограничивает дальнейшее фосфорлирование тирозина в STAT. Так, отсутвие Ptp1b у мышей ведет к leptin гиперчувствиетельности и усиливает фосфорилирование тирозина в Stat3; это, по-видимому, обусловлено нарушением дефосфорилирования Jak1.

SOCS proteins block continued signalling.
Известно, что SOCS белки предупреждают дальнешую передачу сигналов с помощью связывания рецепторных сайтов и/или JAK каталитических сайтов так, что это блокирует дальнейшую активацию STAT-белков. Эти цитокинами-индуцируемые белки ранее были названы как супрессоры suppressor of cytokine signalling (SOCS), JAK-binding proteins (JABs), STAT-induced STAT inhibitors (SSIs) или cytokine-induced SH2 (CIS) белками.
Эти SOCS белки, гены для которых индуцируются транскрипционно в ответ на стимуляцию цитокинами, рекрутируются в активные рецепторные комплексы, чтобы вызывать ингибирование. SOCS белки м. также вызывать белковый обмен рецепторов посредством UBIQUITIN–PROTEASOME-обеспечиваемого процесса. Множественные функции большого семейства SOCS представляют обширное поле дя изучения необходимого для сбалансировнной транскрипции STAT во время развития и у взрослых (Табл. 2). Напр., STAT4 индукция с помощью IL-12 является критической для дифференцировки T HELPER 1 (TH1) клеток, тогда как STAT6 индукция с помощью IL-4 необходима для T HELPER 2 (TH2) клеточной индукции. Уровни активности STAT в клетках двух типов, по-вивдимому, обеспечиваются с помощью SOCS — так, SOCS1 экспрессируется на уровне в 5 раз более высоком в TH1 клетках, чем в TH2 cells, в то время как TH2 клетки экспрессируют SOCS3 в концентрации в 23-раза выше, чем TH1 клетки.
Socs1-knockout (Socs1-/-) мыши характеризуются перинатальной летальностью, которая не регулируется Stat1 активностью, благодаря в основном unopposed действию Ifn-γ и Il-4. Животные нулевые и по Socs1 и по Stat1 или нулевые по Ifn-γ и Socs1 устойчивы к печеночной дегенерации, которая ассоциирует с постоянно высоким уровнем активности Stat1 у Socs-нокаутных животных. Делеция Socs2 гена ведет к дисрегуляции insulin-like-growth-factor-1 (IGF-1) пути, это обусловливает гигантизм. Потеря Socs3 вызывает эмбриональную летальность благодаря нарушениям HAEMATOPOIESIS и дефектам плаценты, все это подчеркивает важность негативной регуляции для собственно действия цитокинов. Потеря Socs6 вызывает задержку роста благодаря потребности в этом белке для собственно регуляции нижестоящего субстрата инсулиновых рецепторов.

Nuclear regulators.
Упомянутая выше негативная регуляторная функция оперирует в цитоплазме. Имеется также, по крайней мере, два негативных регулятора. Имеются белки для ядерного дефосфорилирования активированых STAT с коротким периодом полу-жизни в 10-15 мин. Устранение такого дефосфорилирования будет приводить к продолжительной активации STAT и возможно к неблагоприятным последствиям. Известны белки, названные PIAS — proteins that inhibit activated STATs. PIAS1 и PIAS3 взаимодействуют только с фосфорилированными по тирозину STAT1 и STAT3, соотв. и блокируют при этом связывание с ДНК in vitro. После трансфекции и избыточной экспрессии увеличение транскрипции PIAS генов блокирует также и активные STAT1 и STAT3.
Генетическое взаимодействие между одиночным Drosophila PIAS геном (dPIAS) и одиночным Drosophila STAT геном (92E) показывает, что PIAS м. модулировать активность STAT in vivo. Путь JAK–STAT необходим для развития глаз у мух. Избыточная экспрессия PIAS уменьшает размеры глаз, а удаление из соматических клеток PIAS предупреждает дифференцировку хрусталика. Более того, гиперактивный аллель JAK, tumorous lethal (tuml), вызывает у мух 'leukaemia', выраженность которой возрастает со снижением уровня PIAS и выраженность ее уменьшается при избыточной экспрессии PIAS.
Белки PIAS участвуют также в различных процессах, которые напрямую не связаны со STAT белками, включая индукцию апоптоза, модуляцию ионных каналов,взаимодействия с андрогенными рецепторами и взаимодействия с RNA HELICASE. Некоторые белки PIAS обладают E3-ligase-подобной активностью для малого, родственного убиквитину, модификатора SUMO. Белки PIAS обеспечивают конъюгацию SUMO с некоторыми белками, включая и p53 и c-Jun,и это репрессирует их активность. Однако, биологическая роль модификации SUMO остается неизвестной как и взаимосвязь между этой энзиматической активностью и негатиной регуляцией STATs.

Naturally occurring truncated STATs.
Первые очистки STAT1, укороченной с С-конца молекулы (STAT1β), выявили, что она не м. управлять IFN-γ-индуцированной и STAT1-homodimer-зависимой транскрипцией генов. Однако, STAT1β м. участвовать в IFN-α-индуцированной транскрипции как часть взаимодействия между тремя белками STAT1β, STAT2 и IRF9. Это первое доказательство С-терминальных TADs. Затем было установлено, что STAT3 и STAT5 также имеют альтернативные С-терминально укороченные формы. Эти укаороченные белки функционируют как DOMINANT-NEGATIVES, если избыточно экспрессируются в культивируемых клетках. У мышей с целенаправленным нокаутом Stat3β, которые все еще имеют полную длину Stat3α, паттерн Stat3-индуцированной транскрипции нарушен, это вызывает нарушение восстановления после ENDOTOXIC SHOCK.
Естественно возникашая укороченная форма Drosophila Stat92E лишена первых 130 аминокислот и возникает в результате таранскрипции с альтернативного сайта старта. Два различных первичных транскрипта в результате дифференциального сплайсинга дают или форму полной длины в 86-kDa или 71-kDa форму. Короткая форма действует как негативный регулятор длинной формы. Напр., экспрессия полной длины Stat92E, необходимая для экспрессии even-skipped (eve) в полосках 3 и 7 у развивающихся эмбрионов Drosophila. Напротив, избыточная экспрессия короткой формы Stat92E супрессирует экспрессию eve в полосках 3 и 7. Очевидно, что сбалансированная транскрипционная активность STAT-белков необходима во многих точках развития и у взрослых и их сбалансированная транскрипция требует участия негативных регуляторов.
Когда STATs достигают ядра, то разные STAT белки активруют разные гены. благодаря, по крайней мере частично, различиям в связывающем сродстве к естественным сайтм и частично благодаря использованию различных ко-активаторов.
Ряд генов активируется с помощью определенных STAT путей. Использование DNA MICROARRAYS для изучения активации STAT1 и STAT2, показало, что IFN-α или IFN-γ увеличивают концентрацию мРНК нескольких десятков различных генов более чем в 4 раза и удваивает концентрацию продуктов еще 50–100 генов. Сюда входят и мРНК 10 или около этого генов, которые как известно транскрибируются значительно более быстро после действия IFN. Эксперименты gene-array с использованием клеток без STAT1 или клеток с восстановленным дикого типа или мутантным STAT1, ясно показали важность фосфорилированного STAT1, но и нефосфорилированного STAT1 тоже для экспрессии генов (Box 2).
Известно, что STAT белки связывают ДНК и что они ассоциируют с др. транскрипционными факторами и ко-активаторами (Рис. 3), но детали неясны.

Post-translational modification.
Пост-трансляционные химические модификации и фосфорилирование тирозина STAT белков показывают, что они затрагивают управляемую STAT транскрипцию. Метилирование аргинина на N-терминальном домене увеличивает эффективность транскрипции за счет блокады ассоциаций STATs с белками PIAS. Ацетилирование STATs с помощью ассоциированных ко-активаторных белков также м. увеличивать их транскрипционную активность. Наконец, фосфорилирование серина внутри TAD определенно необходимо для раскрытия полной транскрипционной потенции, по крайней мере, STAT1, STAT3 и STAT4. С-терминальные области STAT1, STAT3, STAT4 и STAT5 содержат по одиночному сериновому остатку, который фосфорилирвется лиганд-зависимым образом для полной транскрипционной активации с помощью STAT белков. Т.к. фосфорилирование серина м. осуществляться независимо от фосфорилирования тирозина, то синергичность между двумя активирующими сигналами достигается за счет комбинированного фосфорилирования серина и тирозина. Напр., фосфорилирование серина STAT1 стимулируется в MACROPHAGES в ответ на бактериальные продукты, которые приводят к усилению последующей транскрипционной реакции IFN-γ.

Co-activator–STAT interactions.
Транскрипционная активность всех STATs зависит от С-терминального TAD, который связывает ко-активаторы. Др. области (таие как N-конец) м. также связывать такие ко-активаторы. Установлено, что TADs STAT2 и STAT6 обнаруживают, по крайней мере. в 10 раз большую стимулирующую активность, чем TADs др. STAT белков. Все STAT TADs м.б. замещены в STAT1 в IFN-стимулируемой транскрипции, которая указывает на незначительную или облигатную генную специфичность, обеспечиваемую С-терминальным TAD.
Механизм, лежащий в основе усиления транскрипционной активности фосфорилированных по серину STAT белков связан с избирательным привлечением ко-активаторов. Некоторые белки, включая minichromosome maintenance 5 (MCM5) и MCM3 соединяются с большей жадностью с TAD STAT1, когда он фосфорилирован. MCM белки, как известно, функционируют в репликации ДНК в качестве helicases, но как они м. участвовать в синтезе РНК, неизвестно.

STATs and HATs.
Подобно многим эукариотическим транскрипционным факторам С-терминальные TADs у STAT1, STAT2, STAT3, STAT5 и STAT6 взаимодействуют с ко-активаторами HISTONE ACETYLTRANSFERASES (HATs), особенно с p300/CBP (CREB-binding protein). По крайней мере STAT2, по-видимому, отклоняется от обычного пути активации транскрипции. Этот белок активируется с помощью IFN-α> ? чтобы обеспечить защиту против инфекции. Следовательно, STAT2 м.б. способен функционировать в стрессовых условиях вирусной инфекции. STAT2 поставляет acetyltransferase белок GCN5 (general control non-repressed), который ведет к ацетилированию HATs HISTONES на промоторах IFN-α-регулируемых генов. Оказалось, что STAT2 м. стимулировать транскрипцию и посредством комплекса, в котором отсутствюут некоторые из обзих белков инициации транскрипции, таких как TATA-связывающий белок, который делает возможнм продолжение STAT2-обусловленной транскрипции в условиях, при которых обычно транскрипция в клетках-хозяевах ингибируется.
Одним из распространенных ко-активаторов у эукариот (включая и млекопитающих) является т.наз. медиаторный комплекс, группа из 20 или более белков. которые законсервированы от дрожжей до человека. Этот комплекс возможно взаимодействует и со STAT белками.

STATs and other DNA-binding proteins.
STAT белки, возможно случайно. действуют в одиночку при активации транскрипции, но большинство др. активаторов действуют в сочетании с др. сайт-специфическими ДНК-связывающими белками (Рис. 3). Взаимодействия, необходимые для максимальной STAT-зависимой транскрипции, установлены между: STAT1, Sp1 и выше стоящим стимулирующим фактором; STAT5 и glucocorticoid receptor (GR); STAT6 и CCAAT/enhancer связывающим белком (C/EBP); некоторыми STAT белками и N-Myc interactor (Nmi); и STAT3 с различными др. белками, включая c-Jun, GR, androgen receptor и similar to mothers against decapentaplegic (SMAD; SMAD белки являются группой белков, которые отвечают на transforming growth factor-β). Первым примером такого типа взаимодействия м. служить IFN-α-индуцируемый STAT1–STAT2 гетеродимер с IRF9, который контактирует с STAT1. Этот тримерный комплекс контактирует с составным ДНК элементом, состоящим из juxtaposed связывающих сайтов для IRF9 и STAT1.

STAT proteins side-by-side.
STAT взаимодействуют также др. с др. на тандемных ДНК сайтах для достижения максимальной стимуляции транскрипции. N-конец необходим для этих димер-димер взаимодействий, которые происходят со всеми STATs кроме STAT2. Взаимодействий dimer–dimer не происходит между разными STAT белками, которые активируются разными лигандами и имеют разные мишени.
Хотя белковые сегменты взаимодействующих партнеров и даже специфические аминокислоты, важные для взаимодействия, и локализованы, но мы не знаем в точности как такие взаимодействия увеличивают скорость инициации. Неясно, как STAT белки позиционируются точно в ген-активирующем кластере белков, но известно, что STATs физически присутствуют в хроматине во время активации транскрипции. CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION (ChIP) ASSAYS dszdbk IFN-зависимое присутствие STAT2 на промоторе ISG54 (interferon-stimulated-gene 54), STAT1 на промоторе IRF1 (interferon-regulatory-factor 1) и промоторе class-II transactivator (CIITA) и STAT3 на промоторе α2-macroglobulin.

Influence of STATs on biological functions


Не является сюрпризом то, что STAT белки широко используются в онтогенетических решениях.

Stat92E in Drosophila.
Drosophila имеет только одну JAK (hopscotch) и один STAT (Stat92E). Известен один лиганд, outstretched (os) или unpaired (unp), и недавно обнаружены рецепторы, удаленно напоминающие рецепторы цитокинов. Открытие онтогенетических путей, которые затрагиваются мутациями STAT, позволило установить, что нулевые аллели летальны. Роль в раннем онтогенезе установлена благодарая локальной экспрессии — белков или мРНК в полосках 3, 5 и 7, которые уменьшены или отсутствуют в HYPOMORPHIC ALLELES. Затем лист тканей (структур) был расширен, но не ограничен крыловыми жилками, трахеями, MONOCYTES, глазными дисками и развитием глаз, а также включал детерминацию пола и зародышевых клеток.
Особый интерес обнаружен к роли Stat92E. Во-первых, стволовые клетки в Drosophila тестисах нуждаются в JAK–STAT передаче сигналов для само-обновления, но не для дифференцировки. Затем, активность Stat92E необходима для миграции бордюрных (border) клеток в развитии оварий — избыточная экспрессия лиганда unpaired или Drosophila JAK, hopscotch, вызывает повышенную миграцию. В свете того факта, что STAT3 и STAT5 are постоянно активны в большинстве инвазивных опухолей человека, эти результаты по клеточной миграции у Drosophila особенно интересны.

Lessons from mice.
Первоначально роль для 7 STAT белков млекопитающих были определены с помощью тканевого распределения, специфических клеточных реакций in vitro и целенаправленного удаления генов у мышей. Табл. 3 суммирует основные фенотипы, выявленные с помощью этих процедур. Но отсутствовала полная картина клеточно-специфических ролей STAT белков у мышей. Напр., даже полное удаление Stat5A и последуящая неспособность тканей груди к развитию, не позволяют установить все значение Stat5A. Ранние эмбрионы с отсутствием Stat5A слабо анемичны, но если взрослые, лишеные Stat 5A и Stat 5B, подвергались стрессу кислородного голодания, то последующее увеличение ERYTHROPOEITIN неспособно стимулировать продукцию эритроцитов. Stat5A кроме того играет роль в пролиферации T-клеток и его отстуствие вызывает тяжелую autoimmunity, которая также м. вносить вклад в наблюдаемую анемию. Stat5A необходим также для лимфомиэлоидной репопуляции супрессированного костного мозга.
Stat3 единственный член семейства, чья потерф ведет к эмбриональной гибели. Удалние Stat3 из индивидуальных тканей с помощью CRE–LOXP метода, с помощью которого обходится проблема эмбриональной летальности, выявил роль Stat3 в широком круге тканей (Табл.4). Фенотипы, возникающие в результате потери Stat3 во взрослых тканях, включают неспособность клеток выживать, нарушение процессов апоптоза, потерю регуляции с помощью петли обратной связи, нарушение миграции клеток и заживления ран. Как один транскрипционный фактор вносит вклдад в столь различные и противоположные процессы, отсается невыясненым на молекулярном уровне.

Role in infection.
Некоторые STAT белки у млекопитающих играют критическую роль в защите хозяина (Табл. 4). Stat1 и Stat2 в основном ограничены обеспечением эффектов IFNs; Stat4 и Stat6 обеспечением эффектов Il-12 и Il-4, соотв.; а Stat3 обесмпечением эффектов Il-6 и др. gp130 лигандов. Животные, у которых отсутствет или Stat1 или Stat2 чрезвычайно чувствиетльны к микробной инфекции, а слабые мутации в STAT1 у людей ведут к снижению резистентности к микобактериальной инфекции. Отсутствие STAT6 блокирует дифференцировку TH2клеток, а отсутствие STAT4 нарушает IFN-γ продукцию T клетками и развитие NATURAL KILLER CELLS во время бактериальной и вирусной инфекций.
Удаление с помощью Cre–loxP-метода STAT3 обусловливает некоторые биологические эффекты. Напр.: во взрослой печени отсутствие STAT3 ведет к существенному нарушению реакций на активаторы острой фазы, обычно ассоциированные с бактериальной инфекцией; в thymus оно нарушает выживаемость T-lymphocyte; в макрофагах нарушет устойчивость к кишечным микробам и у HAEMATOPOIETIC PROGENITORS, это ведет к повышенному накоплению гранулоцитов.
Некоторые вирусы выбираютt STAT или JAK белки для деградации или ингибируют их активацию др. путями. Вирус Vesicular stomatitis ингибирует ядерную транслокацию белков, но STAT1-обусловленная индукция белка ядерных пор Nup98 преодолевает этот блок. PICORNAVIRUSES ингибируют клеточную транскрипцию путем таргетинга транскрипционных факторов для деградации, но STAT2-зависимая транскрипциякаким-то образом остается резистентной к этому эффекту.

Role in growth control.
Сигнальные пути, которые начинаются на клеточной поверхности и посылают активные транскрипционные белки в ядро, часто дисфункциональны в опухолевых клетках. STAT белки не являются исключением. Мыши без Stat1 значительно более чувствительны к химически индуцируемым первичным опухолям и опухолям, которые легко трансплантируются, и опухолевые клетки людей часто теряют STAT чувствительность к IFN, которая обычно отвечает за ограничение роста.
Интересна постоянная активность STAT3, которая обнаруживается у широкого круга опухолей человека. Более того, STAT3 м. с помолщью экспреиментальных мутаций быть преварщен в онкоген. Постоянно активный белок необходим, т.к. внесение доминантно-негативной формы STAT3 в клетки head and neck cancer или во множественные клетки MYELOMA вызывает апоптоз в реципиентных опухолевых клетках. Персистирующая активность STAT3 в опухолях головы и шеи ассоциирует с мутациями в epidermal growth factor (EGF) рецепторах или с мутациями, которые продуцируют избыток лиганда или нормального рецептора. В некоторых multiple myelomas, избыток продукции IL-6 м. лежать в основе дефекта. Установлено, что в hepatocellular carcinoma, принуждение к молчанию локуса гена SOCS3 с помощью метилирования ассоциирует с постоянной активацией STAT3. Затем показано, что потеря PIAS3 выявляется при лейкемии, при которой постоянно активен STAT3. Итак, мутации, которые вызывают продолжающуюся передачу сигналов или неэффективную негативную вышестоящую регуляцию STAT3, по-видимоу, важны для возникновения опухолей. Скорее всего. что мутации в самом STAT3 не участвуют в возникновении персистирующей активности при раке.

Conclusions and perspectives


Знание того, как STAT белки влияют на регуляцию транскрипции является важным как базовая информация для понимания скоординировнного контроля в клетках млекопитающих. Более того, из практических соображений — когда фармакологическая интервенция специфических транскрипционных активностей будет достигнута — необходимо знать о наиболее распространенных взаимодействующих партнерах специфических активаторов. Следовательно, множество экспериментов будет проделено — и делается — чтобы м. было бы заставить работать мутагенизированные STAT белки, которые неспособны функционировать на разных ступенях транскрипционной активации, а экспреименты по STAT–STAT и STAT–белок взимодействиям очень м.б. определят мишени для лекарственного воздействия.


Сайт создан в системе uCoz