Myocardial Differentiation
МИОКАРД: ДИФФЕРЕНЦИРОВКА

В дифференцировку миоцитов вовлечена ретиноевая кислота. На это уkазывает участие в этом процессе ее рецепторов. Было показано, что у эмбрионов мыши преждевременная дифференцировка обнаруживается уже на 8.5 dpc в вентрикулярных миоцитах RXRα (-/-) мутантов.Преждевременная дифференцировка, которая характеризуется присутствием поперечно исчерченных миофибрил, саркоплазматического ретикулема и интеркалированных дисков, обнаруживается на 9.5 dpc примерно у 50% RXRα(-/-) субэпикардиальных миоцитов. В норме эти миоциты остаются морфолоически недифференцированными вплоть до 16.5 dpc. Сходная преждевременная дифференцировка наблюдается на 9.5 dpc в субэпикардиальных миоцитах некоторых RXRβ(-/-) и RARα(-/-) мутантов, а также у эмбрионов с дефицитом витамина А. Пропорция дифференцированных субэпикардиальных миоцитов достигает почти 100% у двойных нулевых мутантов RXRα/RXRβ , указывая на частичное перекрывание ( redundancy) между RXRα и RXRβ. Этот дефект дифференцировки всегда параллелен снижению митотического индекса . Субэпикардиальные миоциты RXRα(-/-), RXRα(-/-)/RXRβ(-/-) or vitamin A deficient, но не RXRβ(-/-) и RARα(-/-) эмбрионов,были часто уплощены и рыхло соединены друг с другом . Таким образом, ретиноиды необходимы для ранних стадий кардиального развития для предупреждения дифференцировки и контроля формы вентрикулярных миоцитов. Оба типа RXRs и RARs рецепторов участвуют в обеспечении этой функции (Kastner al., 1997).	У эмбрионов кур экспрессия кардиальных генов начинается на стадии 7+ (Bisaha , Bader, 1991; (Hanet al., 1992;. (Shiraishi et al., 1998). Индукция их экспрессии скорее всего обусловлена действием регуляторных факторов в самих зачатках сердца. Так, примерно в это же время у эмбрионов мыши, на стадии ранней головной складки (Е7,75), начинает обнаруживаться экспрессия фактора FGF8, в передней части эмбриона в двух сердце-формирующих областях (Crossley ,Martin, 1995). Еще одна группа молекул, участвующих в регуляции морфогенеза сердца, представлена пептидами ростовых факторов, включая транс- формирующий фактор роста-β (TFG-β), основной фактор роста фибробластов и фактор роста сосудистых эпителиальных клеток. В отношении развития сердца лучше всего изучен фактор TGF=β.Изоформы его участвуют в дифференцировке мезодермы в сердечный миокард, в формировании эндокардиальных подушечек и контрактильной функции . Хотя эксперименты in vitro подтверж- дают, что TGF=β изоформы участвуют в развитии сердца. однако in vivo роль этих факторов роста до конца неясна. Известно, что изоформа тяжелой альфа цепи миозина Xenopus (XMHC alpha) обнару- живается в прекардиальных клетках с началом дифференцировки сер- дечной мышцы в результате индукции активином, транскрипционным фактором из семейства ТGF-β . Интересно отметить, что у эмбри- онов кур начиная со стадии 7 начинает экспрессироваться в миокар- диальном клоне рецептор инсулин-подобного фактора роста II/манноза-6-фосфата (IGF-II/M6P), лигандами которого являются М6Р-содержащие факторы роста ТGF-β и активин-А ( McCormick et al., 1996). Другие клеточно=специфичные факторы транскрипции, по-видимому, также играют роль в морфогенезе сердца, взаимодействуя с промоторами и энхансерами генов, экспрессирующихся спецефически в эмбриональном или взрослом сердце ( Argentin et al., 1994); ( Chien et al., 1993); ( Franz et al., 1993); ( Sartorell et al., 1996). Среди активируемых в это время генов выявлены гены, кодирующие сердечный α-актин, тяжелая цепь α-сердечного миозина, тяжелая цепь β-миозина, сердечная форма легкой цепи миозина 2, сердечный тропонин С, сердечный тропонин Т, и атриальный натрийуретический фактор. Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов и энхансеров привел к идентификации и транскрипционных факторов, которые преимуществен- но экспрессируются в ткани сердца, таких как HF=1b ( Zhu et al., 1993) и членов семейства белков миоцит=специфичного энхансера 2 (MEF=2) ( Yu et al., 1992). Белок MEF2C у эмбрионов мыши экспрессируется в сердечной мезодерме с 7,5 дня,т.е. еще до образования примитивной сердечной трубки. Его экспрессия предшествует экспрессии структурных генов для сердечной мышцы таких как ⍕=кардиальный актин и тяжелая цепь миозина ( Yu et al., 1992);( Adolph et al., 1993). По-видимому, активность этих генов регулируется MEF2C, тем более известно, что регуляторная область гена β=тяжелой цепи миозина содержит сайт связывания MEF2. MEF2A и MEF2D также экспрессируются в развивающемся сердце, но лишь с 8,5 дня ( Edmondson et al., 1993). Активность генов MEF2 в сердце, по-видимому, контролируется пока неизвестными белками с bHLH мотивом. ДНК мотив, связываемый MEF-2 белком распознается также белком с цинковыми пальчиками HF-1b, который участвует в регуляции гена легкой цепи-2 миозина ( Zhu et al., 1993) Связывающий сайт MEF2 обнаружен и в гене 945;-миозина тяжелой цепи, рядом с Е боксом, сайтом связывания фактора 2 (BF-2) ( Molkentin , Markham, 1993). У эмбрионов Xenopus между поздней гаструлой (ст.12.5) и ранней нейрулой (ст.14) ст.13,5 впервые обнаруживается мРНК гена XNkx-2.3 и XNkx-2.5 в мезодерме и ассоциированой энтодерме глотки, т.е. начинает экспрессироваться в примордии сердца еще до начала экспрессии маркеров дифференцировки кардиального фенотипа, таких как MLC2 ( Evans et al., 1993) У эмбрионов мыши экспрессируется гомологичный сердце-специфичный гомеобоксный белок Csx/Nkx-2.5 ( Lints et al., 1993), ( Komuro , Izumo, 1993) и его дрозофилийный гомолог Msh-2/NK-4/tinman, которые активны только в миокардиальных клетках . Показано, что у эмбрионов мыши ген Nkx2-5 контролирует активность гена легкой цепи миозина 2V (MLC2V) . NK гомебоксный ген мыши Nkx-2.5/Csx продолжает затем эакспрессроваться в кардиальных миоцитах в течение всего развития. Nkx-2.5 гомеодомен связывается с ДНК посредством serum response element (SRE), который предназначен для связывания serum response factor (SRF). Показано, что SRF связывается с SRE1 и SRE4, a Nkx-2.5 c SRE2, SRE3 в промоторе кардиального α-акти- на ( Chen C. et al., 1996) который они совместно активируют. Другой фактор транскрипции у мышей mTEF=1 также на высоком уровне экспрессируется в сердечной мышце во время эмбриогенеза ( Shimizu et al., 1993) Этот фактор связывает М=САТ последовательности, находяшиеся выше многих генов, экспрессирующихся в тканях сердца. Фактор транскрипции позвоночных Egr=1 экспрессируется в различных тканях, включая и сердце. Изучение in vitro показало, что этот фактор регулирует транскрипцию гена α=миозиновой тяжелой цепи сердца ( Gupta et al., 1991). Ген cripto у эмбрионов мыши кодирует белок, сходный с эпидермальным фактором роста. Во время гаструляции его транскрипты экспрессируются в формирующейся мезодерме, позднее их экспрессия ограничена артериальным протоком сердца ( Dono et al., 1993). Фактор транскрипции ВМР-4 экспрессируется в сердечной мезодерме Xenopus на стадии поздней нейрулы (стадия 23). Экспрессия ВМР-4 не связана с индукцией сердца, т.к. транскрипты обнаруживаются на высоком уровне после детерминации сердца ( Yamagishi et al., 1995). C помощью RT-PCR было установлено ( Cox et al., 1995), что транскрипты гена тяжелой цепи сердечного миозина (CMHC) присутствуют в кардиальной мезодерме Xenopus уже на стадии 13, ранней нейрулы, приблизительно за 30 часов до начала сердцебиений,т.е. вскоре после детерминации клона сердечных миоцитов. Экспрессия гена СМНС индуцируется в эктодермальных клетках анимальной шапочки у эмбрионов на стадии бластулы после инъекции синтетической РНК MyoD или Myf5. Это указывает на то, что ген СМНС содержит регуляторные элементы, реагирующие на эти специфичные для скелетных мышц транскрипционные факторы.У эмбрионов аксолотля на стадии хвостовой почки, 26, пре- кардиальная мезодерма уже экспрессирует миозин ( Erginel-Unaltuna , Lemanski,1994). У эмбрионов кур ген MyoD1 начинает обнаруживаться в сердце на стадии 6, экспрессируется на стадиях 11-13 и исчезает к стадии 17 . На стадии 19 выявлена экспрессия генов для тяжелых цепей миозина, специфичных для предсердий АМНС1 и CCSV2 ( Oana et al., 1995). В сердечной мышце эмбрионов мыши выявлена экспрессия скелетной изоформы МНСβ4_slow миозина. Гены, кодирующие MLC_1V и MLC_1A экспрессируются как в сердечной, так и скелетных мышцах. MLC_1A ген отвечает преимущественно на MyoD и/или миогенеин ( Ontell et al., 1995). У эмбрионов кур на стадии 8 обнаруживается камер-специфическая экспрессия вентрикулярной легкой миозиновой цепи 2 ( O'Brien et al., 1993). Начинается экспрессия белков промежуточных филамент десмина ( Baldwin et al., 1991) и виметина ( Schaart et al., 1989) . На этих стадиях эмбриогенеза продолжается экспрессия всех упомянутых выше генов и собственно начинается органогенез.

У эмбрионов кур экспрессия кардиальных генов начинается на стадии 7+ (Bisaha , Bader, 1991; (Hanet al., 1992;. (Shiraishi et al., 1998). Индукция их экспрессии скорее всего обусловлена действием регуляторных факторов в самих зачатках сердца. Так, примерно в это же время у эмбрионов мыши, на стадии ранней головной складки (Е7,75), начинает обнаруживаться экспрессия фактора FGF8, в передней части эмбриона в двух сердце-формирующих областях (Crossley ,Martin, 1995).
Еще одна группа молекул, участвующих в регуляции морфогенеза сердца, представлена пептидами ростовых факторов, включая транс- формирующий фактор роста-β (TFG-β), основной фактор роста фибробластов и фактор роста сосудистых эпителиальных клеток.

В отношении развития сердца лучше всего изучен фактор TGF=β.Изоформы его участвуют в дифференцировке мезодермы в сердечный миокард, в формировании эндокардиальных подушечек и контрактильной функции . Хотя эксперименты in vitro подтверж- дают, что TGF=β изоформы участвуют в развитии сердца. однако in vivo роль этих факторов роста до конца неясна. Известно, что изоформа тяжелой альфа цепи миозина Xenopus (XMHC alpha) обнару- живается в прекардиальных клетках с началом дифференцировки сер- дечной мышцы в результате индукции активином, транскрипционным фактором из семейства ТGF-β . Интересно отметить, что у эмбри- онов кур начиная со стадии 7 начинает экспрессироваться в миокар- диальном клоне рецептор инсулин-подобного фактора роста II/манноза-6-фосфата (IGF-II/M6P), лигандами которого являются М6Р-содержащие факторы роста ТGF-β и активин-А ( McCormick et al., 1996).

Другие клеточно=специфичные факторы транскрипции, по-видимому, также играют роль в морфогенезе сердца, взаимодействуя с промоторами и энхансерами генов, экспрессирующихся спецефически в эмбриональном или взрослом сердце ( Argentin et al., 1994); ( Chien et al., 1993); ( Franz et al., 1993); ( Sartorell et al., 1996). Среди активируемых в это время генов выявлены гены, кодирующие сердечный α-актин, тяжелая цепь α-сердечного миозина, тяжелая цепь β-миозина, сердечная форма легкой цепи миозина 2, сердечный тропонин С, сердечный тропонин Т, и атриальный натрийуретический фактор.

Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов и энхансеров привел к идентификации и транскрипционных факторов, которые преимуществен- но экспрессируются в ткани сердца, таких как HF=1b ( Zhu et al., 1993) и членов семейства белков миоцит=специфичного энхансера 2 (MEF=2) ( Yu et al., 1992).

Белок MEF2C у эмбрионов мыши экспрессируется в сердечной мезодерме с 7,5 дня,т.е. еще до образования примитивной сердечной трубки. Его экспрессия предшествует экспрессии структурных генов для сердечной мышцы таких как ⍕=кардиальный актин и тяжелая цепь миозина ( Yu et al., 1992);( Adolph et al., 1993). По-видимому, активность этих генов регулируется MEF2C, тем более известно, что регуляторная область гена β=тяжелой цепи миозина содержит сайт связывания MEF2. MEF2A и MEF2D также экспрессируются в развивающемся сердце, но лишь с 8,5 дня ( Edmondson et al., 1993). Активность генов MEF2 в сердце, по-видимому, контролируется пока неизвестными белками с bHLH мотивом. ДНК мотив, связываемый MEF-2 белком распознается также белком с цинковыми пальчиками HF-1b, который участвует в регуляции гена легкой цепи-2 миозина ( Zhu et al., 1993) Связывающий сайт MEF2 обнаружен и в гене 945;-миозина тяжелой цепи, рядом с Е боксом, сайтом связывания фактора 2 (BF-2) ( Molkentin , Markham, 1993).

У эмбрионов Xenopus между поздней гаструлой (ст.12.5) и ранней нейрулой (ст.14) ст.13,5 впервые обнаруживается мРНК гена XNkx-2.3 и XNkx-2.5 в мезодерме и ассоциированой энтодерме глотки, т.е. начинает экспрессироваться в примордии сердца еще до начала экспрессии маркеров дифференцировки кардиального фенотипа, таких как MLC2 ( Evans et al., 1993) У эмбрионов мыши экспрессируется гомологичный сердце-специфичный гомеобоксный белок Csx/Nkx-2.5 ( Lints et al., 1993), ( Komuro , Izumo, 1993) и его дрозофилийный гомолог Msh-2/NK-4/tinman, которые активны только в миокардиальных клетках . Показано, что у эмбрионов мыши ген Nkx2-5 контролирует активность гена легкой цепи миозина 2V (MLC2V) . NK гомебоксный ген мыши Nkx-2.5/Csx продолжает затем эакспрессроваться в кардиальных миоцитах в течение всего развития. Nkx-2.5 гомеодомен связывается с ДНК посредством serum response element (SRE), который предназначен для связывания serum response factor (SRF). Показано, что SRF связывается с SRE1 и SRE4, a Nkx-2.5 c SRE2, SRE3 в промоторе кардиального α-акти- на ( Chen C. et al., 1996) который они совместно активируют.

Другой фактор транскрипции у мышей mTEF=1 также на высоком уровне экспрессируется в сердечной мышце во время эмбриогенеза ( Shimizu et al., 1993) Этот фактор связывает М=САТ последовательности, находяшиеся выше многих генов, экспрессирующихся в тканях сердца. Фактор транскрипции позвоночных Egr=1 экспрессируется в различных тканях, включая и сердце. Изучение in vitro показало, что этот фактор регулирует транскрипцию гена α=миозиновой тяжелой цепи сердца ( Gupta et al., 1991). Ген cripto у эмбрионов мыши кодирует белок, сходный с эпидермальным фактором роста. Во время гаструляции его транскрипты экспрессируются в формирующейся мезодерме, позднее их экспрессия ограничена артериальным протоком сердца ( Dono et al., 1993).

Фактор транскрипции ВМР-4 экспрессируется в сердечной мезодерме Xenopus на стадии поздней нейрулы (стадия 23). Экспрессия ВМР-4 не связана с индукцией сердца, т.к. транскрипты обнаруживаются на высоком уровне после детерминации сердца ( Yamagishi et al., 1995).

C помощью RT-PCR было установлено ( Cox et al., 1995), что транскрипты гена тяжелой цепи сердечного миозина (CMHC) присутствуют в кардиальной мезодерме Xenopus уже на стадии 13, ранней нейрулы, приблизительно за 30 часов до начала сердцебиений,т.е. вскоре после детерминации клона сердечных миоцитов. Экспрессия гена СМНС индуцируется в эктодермальных клетках анимальной шапочки у эмбрионов на стадии бластулы после инъекции синтетической РНК MyoD или Myf5. Это указывает на то, что ген СМНС содержит регуляторные элементы, реагирующие на эти специфичные для скелетных мышц транскрипционные факторы.У эмбрионов аксолотля на стадии хвостовой почки, 26, пре- кардиальная мезодерма уже экспрессирует миозин ( Erginel-Unaltuna , Lemanski,1994).
У эмбрионов кур ген MyoD1 начинает обнаруживаться в сердце на стадии 6, экспрессируется на стадиях 11-13 и исчезает к стадии 17 . На стадии 19 выявлена экспрессия генов для тяжелых цепей миозина, специфичных для предсердий АМНС1 и CCSV2 ( Oana et al., 1995).

В сердечной мышце эмбрионов мыши выявлена экспрессия скелетной изоформы МНСβ4_slow миозина. Гены, кодирующие MLC_1V и MLC_1A экспрессируются как в сердечной, так и скелетных мышцах. MLC_1A ген отвечает преимущественно на MyoD и/или миогенеин ( Ontell et al., 1995).

У эмбрионов кур на стадии 8 обнаруживается камер-специфическая экспрессия вентрикулярной легкой миозиновой цепи 2 ( O'Brien et al., 1993). Начинается экспрессия белков промежуточных филамент десмина ( Baldwin et al., 1991) и виметина ( Schaart et al., 1989) . На этих стадиях эмбриогенеза продолжается экспрессия всех упомянутых выше генов и собственно начинается органогенез.