Установлено, что cERNI начинает экспрессироваться на стадии пред-первичной полоски во всей области, которая вносит вклад в образование нервной системы. На ст. первичной полоски (3+/4) его распределение совпадает с границами проспективной нервной пластинки. Вскоре после этого экспрессия его уменьшается к центру нейральной пластинки и становится ограниченной ее границами; транскрипты исчезают на ст. ранних сомитов.

Гензеновский узелок перепела (ст.3+/4) индуцирует экспрессию cERNI во внеэмбриональном эпибласте кур в течение 1-2 ч. После 5 ч индукция наиболее интенсивна, а после 8 ч начинает уменьшаться от центра, образуя кольцо, соответствующее границам нейральной пластинки. Это один из самых ранних маркеров нейральной индукции, экспрессируется раньше Sox3 в ответ на сигналы узелка. Было установлено, что организатор и его клетки-предшественники продуцируют FGF сигналы, которые могут инициировать и обязательны для нейральной индукции. Было показано, что FGF8 индуцирует экспрессию сERNI строго и быстро как и узелок в течение 1-2 ч, не индуцируя мезодермальных маркеров brachyury или Tbx6L. Эктопическая экспрессия сERNI никогда не наблюдалась после эктопической экспрессии ВМР антогонистов, хордина, ноггина или cerberus или BMP4 или HGF/SF. FGF8 строго индуцирует экспрессию Sox3, но не позднего нейрального маркера Sox-2. Клетки, секретирующие химерный FGF рецептор, заметно снижают свою способность к индукции узелком экспрессии Sox3 и cERNI. Сходный эффект в присутсви ингибторов FGF. Следовательно, сигналы FGF являются обязательным компонентом нейральной индукции с помощью организатора, активность которых не м.б. объяснена антогонизмом к ВМР сигнальному пути.

Экспрессия cERNI и Sox3 обнаруживается задолго до гаструляции, когда даже узелок еще не сформирован, но 2 популяции клеток, вносящие свой вклад в его образование, уже присутствуют. Это группа клеток среднего слоя ("задние клетки"), ассоциированная с Koller's sickle, которая позднее движется к центру эмбриона на верхушкe удлинняющейся первичной полоски (ст. 2-3). Вторая популяция, обозначаемая как "центральные клетки", располагается в эпибласте, покрывающем задние клетки вплoть до ст.Х, но перемещающаяся к центру области pellucida до начала формирования первичной полоски (ст. XI-XIII). Гензеновский узелок образуется, когда две популяции соединяются.

Лишь задние клетки эмбрионов кур индуцировали qERNI и Sox3 спустя 5 ч, но не индуцировали Sox2 и chordin. Комбинация обеих популяций клеток индуцирует как Sox2, так и chordin. Следовательно, задние, а не центральные клетки индуцируют ERNI и Sox3. Комбинация двух популяций клеток дает функциональный организатор и обеспечивает экспрессию поздних нейральных маркеров. На ст. Х именно задние клетки экспрессируют FGF8, хотя и на низком уровне. В присутствие FGF ингибитора, SU5402, индукция ERNI и Sox3 задними клетками устраняется.

Neural induction: a bird's eye view
Andrea Streit and Claudio D. Stern
Trends in Genetics 1999, 15:20-24

У позвоночных нейральная пластинка возникает во время гаструляции, когда эктодерма подразделяется на нейральный и не-нейральный домен. Пограничная область между ними позднее даст цементную железу (у амфибий), клетки нервного гребня и сенсорные плакоды головы. Spemann and Mangold установили, что нейральная пластинка индуцируется в эктодерме сигналами от дорсальной губы бластопора амфибий, от области называемой "организатором". Организатор, трансплантированный в эктопическое положение изменяет судьбу соседней эктодермы от эпидермальной к нейральной.
The 'default model' and the evidence supporting it

Согласно этой модели ( Рис.1) клетки эктодермального слоя гаструлы лягушки имеют автономную тенденцию дифференцироваться в нейральную ткань, которая ингибируется bone morphogenetic proteins (BMPs) - в частности, BMP4.

Рис. 1. Простая модель. У Xenopus, эктодермальные клетки имеют естественную тенденцию дифференцироваться в нервную ткань, но ингибируются под влиянием ВМР сигналов. Эндогенные антогонисты ВМР хордин, ноггин, фоллистатин и Xnr3 экспрессируются в организаторе и первые 3 из них связываются с ВМР непосредственно. Ингибирование сигналов ВМР с помощью инъекций доминантно-негативного ВМР рецептора (δBMPR) также ведет к нейральной дифференцировке. Помимо эпидермальной (анти-нейральной) индукции ВМР играет также роль в вентрализации мезодермы. (a) Предполагаемый путь. (b) Пространственные взаимоотношения этих сигналов на стадии бластулы.ранней гаструлы. AN, animal; VG, vegetal; D, dorsal; V, ventral; *, положение будущей цементной железы (передний край нейральной пластинки). Область организатора показана оранжевым, проспективная нейральная ткань - красным, эпидермис - голубым и пограничная область - пурпурным цветом.

Fig. 1. The default model. In Xenopus, ectoderm cells have a natural tendency to differentiate into neural tissue, but are inhibited from doing so under the influence of BMP signalling. The endogenous BMP antagonists chordin, noggin, follistatin and Xnr3 are expressed in the organizer and the first three of these bind to BMP directly. Inhibition of BMP signalling by injection of a dominant-negative BMP receptor (δBMPR) also causes neural differentiation. In addition to epidermal (anti-neural) induction, the BMPs also play a role in ventralization of the mesoderm. (a) The proposed pathway. (b) Spatial relationships of these signals at late blastula/early gastrula stages. AN, animal; VG, vegetal; D, dorsal; V, ventral; *, position of the future cement gland (anterior border of neural plate). The organizer region is shown in orange, prospective neural tissue in red, epidermis in blue and the border region between the latter two in purple.

Идея, что высвобождения ингибирующих сигналов достаточно для нейрального развития в эктодерме ('autoneuralization') первоначально была выдвинута на основании наблюдений, что у амфибий диссоциация анимальной шапочки на стадии гаструлы ведет к формированию нервной ткани. Этот процесс мог быть подавлен с помощью BMP4 или одного из эффекторов BMP4 (msx1 или smad1), следовательно, нейральный путь естественно ингибируется ВМР-подобной активностью. Паттерн экспрессии BMP4 у Xenopusподтверждает анти-нейральную функцию: на ст. ранней гаструлы BMP4 транскрипты широко экспрессируются во всей эктодерме и затем исчезают из будущей нейральной пластинки в то время, когда появляется организатор. Эта модель получила дальнейшее подтверждение в экспреиментах, в которых ВМР4 сигнальный путь ингибировался (Рис.2). Анимальная шапочка, взятая от эмбрионов, которым инъецирована РНК, кодирующая доминантно-негативный рецептор, связывающий BMPs, или нерасщепленная форма BMP4 или 7 или антисмысловая BMP4 РНК, адоптирует нейральную судьбу вместо эпидермальной.

Рис. 2. Эксперименты на лягушках. Эксперимент начинается одним из 3-х путей (верхний ряд диаграммы). РНК или ДНК, кодирующя noggin, chordin, follistatin или BMPR инъецируется или в анимальный полюс всех бластомеров на стадии 4-х клеток (слева) или вентральную вегетативную сторону одного бластомера на ст. двух клеток (середина). Эти эмбрионы росли до ст. бластулы или ранней гаструлы, затем анимальная шапочка вынималась и созревала in vitro до использования reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Или анимальные шапочки вырезались из поздних бластул или ранних гаструл. Шапочки обрабатывались хордином или ноггином или диссоциировались, обрабатывались ВМР4 и реагрегировали. После уальтивирования они анализировались. Таблица показывает типичные результаты, полученные в каждом экспреименте. C, control (uninjected embryos or untreated caps); E, experimental. + в скобках напротив brachyury указывает на то, что высокие концентрации BMP4 действуют как мезодермальный индуктор. Маркеры цементной железы экспрессируются после всех воздействий как и в контроле.

Fig. 2. Assays in the frog. The assays begin in one of three ways (top row of diagrams). RNA or DNA encoding noggin, chordin, follistatin or BMPR is injected either into the animal pole of all blastomeres at the four-cell stage (left) or into the ventral vegetal side of one blastomere at the two-cell stage (middle). These embryos are allowed to grow to the late blastula or early gastrula stage, the animal cap excised and matured in vitro before assaying for various markers by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Alternatively, animal caps are excised from late blastula or early gastrula embryos. The caps are either treated with chordin or noggin protein, or dissociated, treated with BMP4 and reaggregated. Following culture, they are assayed as above. The table shows typical results obtained for each of these experiments. C, control (uninjected embryos or untreated caps); E, experimental. The + in brackets under brachyury refers to the finding that high concentrations of BMP4 act as a mesoderm inducer ⁸. Note that cement gland markers are expressed after all treatments as well as in controls.

Существование нескольких эндогенных молекул, которые выступают антогонистами ВМР, указывает на то, что ингибирование ВМР играет роль in vivo. Гены, кодирующие секретируемые факторы noggin, chordin, follistatin и Xnr3 все экспресисруются в организаторе Xenopus на стадии гаструлы, когда происходит нейральная индукция. У Xenopus эктопическая экспрессия любого из них после инъекции РНК или ДНК обусловливает развитие нейральной ткани в анимальной шапочке со стадии бластулы. Chordin, noggin и follistatin все противодействуют BMP сигналам в результате прямого связывания BMP2, 4 и 7, что не позволяет им взаимодействовать с собственными рецепторами. Кроме того транскрипция BMP РНК поддерживается с помощью активности ВМР белка, это объясняет исчезновение BMP4 и 7 экспрессии вблизи организатора (который секретирует ВМР ингибиторов) на стадии гаструлы.

Помимо его участия в нейральной индукуции организатор может также формировать паттерн мезодермы на стадии гаструлы ('dorsalization'). Эта активность также может быть связана с ингибированием ВМР. BMPs может модифицировать дорсальную мезодерму, давая вентральные типы клеток, т.к. их ингибиторы могут генерировать хорду и мышцы из вентральной мезодермы. Ингибиторы BMP могут также регулировать дорсовентральную полярность всего эмбриона перед гаструляцией. Кромето получены доказательства того, что BMPs и их модуляция с помощью эндогенных ингибиторов участвуют во всех проявлениях организатора, включая возникновение нейральног и не-нейрального доменов в гаструле Xenopus.

Additional complexity in neural induction

Один феномен, который простая модель ( default model) не способна объяснить, является 'homoiogenetic induction' (индукция нейральной пластинки с помощью ранее индуцированной нейральной пластинки). Нейральная пластинка не экспрессирует каких-либо ВМР-антогонистов и ,следовательно, отсуствует молекулярная основа для их индуцирующей активности.

Другие результаты выявили неожиданные различия в свойствах различных BMP антогонистов. Например, chordin и noggin отличаются своим сродством к BMP4 белку: chordin имеет K_D of 300 pM, тогда как noggin связывает тот же лиганд с K_D of 20 pM . Нейральная индукция ноггином в 10-20 раз менее эффективна, чем хордином, т.е. противоположна ожидаемому исходя из их сродства к BMP4. Это указывает на то, что ситуация более сложна, чем рисуется простой моделью.

Хотя ни ноггин, ни хордин не являются мезодермальными индукторами, оба могут модифицировать состояние клеток, ранее воспринявших мезодерм-индуцируювщие сигналы. Имеются некоторые доказательства того, что слабые мезодерм-индуцирующие сигналы достигают анимальной шапочки на стадии гаструлы и что ноггин может усиливать это при продукции дорсальной мезодермы. Конечно многие авторы тщательно изучали экспрессию панели мезодермальных маркеров в вырезанной анимальной шапочке. Однако маркеры редко включали гены, экспрессирующиеся в энтодерме.

Имеются доказательства того, что FGF может действовать как прямой нейральный индуктор в вырезанной анимальной шапочке на ст. гаструлы, сходные данные получены у эмбрионов кур. Оказалось, что нейрализующая активность chordin и noggin в анимальной шапочке нуждается в интактном FGF сигнальном пути. Однако оказалось, что когда FGF сигналы ингибированы в целом эмбрионе нервная ткань все же образуется. Все вместе это указывает на то, что некоторая форма FGF signalling участвует в нейральной индукции вместе с ингибиторами BMP . Ноггин и хордин способствуют дифференцировке энтодермы, это открывает дополнительную возможность того, что энтодерма обеспечивает некоторые аспекты нейральной. Передняя энтодерма Xenopus также экспрессирует cerberus,другой секретируемый фактор с нейрально-индуцирующей активностью.

Интересно, что многие вырезанные анимальные шапочки или коротко обработанные средой с низким содержанием кальция и магния, активируют FGF сигнальный путь и, по крайней мере, временно индуцируют экспрессию маркера цементной железы XAG1 и раннего нейрального маркера Sox2 (Y. Sasai, pers. commun.). Возможно, что частичная потеря клетками контактов активрует другие внутриклеточные реакции (как это показано для FGF signalling), которые затем усиливаются BMP ингибиторами, ведь одной диссоциации достаочно для запуска нейральной дифференцировки.

Полученные результаты могут указывать на то, что дорсальная эктодерма получает некоторые нейрально-индуцирующие сигналы до гаструляции и обязательно необходимы дополнительные пермиссивные или стабилизирующие сигналы (такие как ингибирование ВМР) для окончания их дифференцировки в нейральном направлении.

Multiple cooperating signals from the organizer

Недавние исследования на эмбрионах кур подтвердили идею, что ингибирования ВМР недостаточно для нейральной индукции, а скорее оно действует ниже или в содружестве с другими сигналами из организатора. Эктопическая экспрессия или хордина или ноггина во внеэмбриональной или в эмбриональной, но ненейральной эктодерме не генерирует эктопической нейральной пластинки или нейральные маркеры. Однако эктопическая экспрессия хордина до формирования первичной полоски обусловливает образование второй примитивной полоски, экспрессирующей маркеры организатора. Более того в отличие от Xenopus, диссоциация клеток эпибласта не вызывает нейральной дифференцировки, но способствует развитию мышц.

Рис. 3. Эксперименты на курах. (a) Эктопическая экспрессия chordin, noggin и BMP4 на стадии первичной полоски, анализируется в терминах экспрессии нейральных маркеров Sox2 и Sox3. (b) Результаты эктопической экспрессии на стадии до примитивной полоски, анализируется в отношении нейральных (Sox2, Sox3) и мезодермальных маркеров(bra, brachyury для мезодермы первичной полоски; Not1 для организатора; оранжевый цвет). EEP, extraembryonic epiblast; EP, embryonic epiblast; H, hypoblast; KS, Koller's sickle; NNE, non-neural ectoderm; PNP, проспективная нейральная пластинка (красный). Проспективная территория нервный гребень/плакода показана пурпурным цветом.

Fig. 3. Assays in the chick. (a) Mis-expression of chordin, noggin and BMP4 in the primitive streak stage, analyzed in terms of the expression of the neural markers Sox2 and Sox3. (b) Results of mis-expression at pre-primitive streak stages, analyzed with neural (Sox2, Sox3) as well as mesodermal markers (bra, brachyury for primitive streak mesoderm; Not1 for organizer; orange). EEP, extraembryonic epiblast; EP, embryonic epiblast; H, hypoblast; KS, Koller's sickle; NNE, non-neural ectoderm; PNP, prospective neural plate (red). The prospective neural crest/placode territory is shown in purple.

Паттерн экспрессии BMPs и их ингибиторов у эмбрионов кур и мышей: ни BMP2, 4 ни 7 не экспрессируются в будущей нейральной пластинке на стадии ранней первичной полоски, когда начинается нейральная индукция. Follistatin не экспрессируется в узле мышей, и лишь слабо у эмбрионов кур. Куриный noggin начинает экспрессироваться в узелке как только его индуцирующая активность начинает уменьшаться, и хотя chordin присутствует в узелке кур до этой стадии, его экспрессия сохраняется и даже увеличивается в течение долгого времени после того как узелок потерял свою нейрально-индуцирующую способность. Эти паттерны экспрессии не объясняют изменений в нейрально-индуцирующей активности организатора и указывают на то, что эти ингибиторы могут быть необходимы для других онтогенетических процессов.

Мутанты с потерей функции для BMPs, их рецепторов и ингибиторов не помогают определтить роль BMPs в нейральной индукции. Noggin мутанты формируют нормальную нейральную пластинку и обнаруживают дефекты паттерна только на поздних стадиях. Нулевые мутанты по follistatin, BMP7 или BMP2 не имеют раннего нейрального фенотипа. Часть мутантов с отсуствием BMP4 погибает до гаструляции, но немногие выжившие не обнаруживают увеличение нервной системы или отсутствие эпидермиса. Мутации рецептора BMP (Bmpr-Ia) ведут к очень ранней гибели и неинформативны.

Дальнейшие экспреименты на курах подтвердили предположение, что ингибирование ВМР хордином эффективно в нейральной индукции только тогда, когда клетки получили уже другие продуцируемые организатором сигналы. Эктопическая экспрессия хлордина неспособна индуцировать экспрессию нейральных маркеров во внеэмбриональной области opaca. Однако он способен стабилизировать экспрессию Sox3, если клетки экспозируются трансплантантом Гензеновского узелка в течение 5 часов (достаточно для индукции нейральной пластинки), и узел затем удаляется и замещается хордин-прордуцирующими клетками. Все это говорит о том, что ингибирование ВМР действует ниже (после) или в содрудестве с другими нейрально-индуцирующими сигналами организатора.

A role for BMP signalling at the edge of the neural plate

У эмбрионов кур край между нейральной и не-нейральной эктодермой виден только в области, которая может отвечать эксцессом (excess) BMP4 или его ингибированием (Рис.3). Проспективная нейральная пластинка, выделенная с помощью этой границы, не ингибируется BMP4 или 7, а не-нейральная эктодерма вне границы не индуцируется хордином или ноггином. Напротив эктопическая экспрессия хордина на границе ведет к расширению нейральной пластинки, тогда как эктопическая экспрессия BMP4 в той же области ведет к сужению нейральной пластинки.

У Xenopus передняя граница (проспективная цементная железа) локализуется на анимальном полюсе эктодермы на ст. 7-9. Но в других исследованиях она картируется более дорсально, следовательно, нужна более детальная карта зачатков на стадии гаструлы. Во время конвергенции и экстензионных движений (которые начинаются на ст. 9-10), эта граница сдвигается кпереди (в направлении исходной вентральной стороны эмбриона (Рис.4). Следовательно, возможно, что анимальная шапочка вырезаемая на ст.9-10 содержит эту границу. Болоее того, выделенная анимальная шапочка от UV-ventralized эмбрионов экспрессирует маркер цементной железы XAG1 в отсутствие ингибирования BMP .

Рис. 4. Движение передней границы нейральной пластинки. Движение нейральной пластинки (красная) и положение цементной железы (*) по краю между нейральной и не-нейральной территориями (пурпур)со стадии поздней бластулы (ст. 9) до поздней гаструлы/ ранней нейрулы (ст. 12.5). AN, animal; VG, vegetal; D, dorsal; V, ventral; O, organizer (orange).

Fig. 4. Movements of the neural plate anterior boundary. Movements of the neural plate (red) and the position of the cement gland (*) at the border between neural and non-neural territories (purple) according to Zhang and Jacobson ³⁸ from the late blastula (stage 9) to late gastrula/early neurula (stage 12.5). AN, animal; VG, vegetal; D, dorsal; V, ventral; O, organizer (orange).

Интересно в этом контексте вернуться к различиям в паттернах экспрессии BMPs у amniotes и anamniotes. У лягушек и рыбок данио BMP2 и 4 экспрессируются повсеместно в эктодерме до гаструляции и затем исчезают из проспективной нейральной пластинки. У кур и мышей экспрессия отсутствует или незначительна в центральном эпибласте до гаструляции. Во время ранней нейруляции экспрессия BMPs в обеих группах становится строго локализованной границами нейральной пластинки. Следовательно, хотя паттерны экспрессии отличаются на ранних стадиях, они конвергируют сразу после появления нейральной пластинки, указывая тем самым, что роль BMP в этой горанице является важной и строго законсервирована в эволюции.