The past: limb organizer centres

.1 Организующие центры конечностей. Эмбрионы кур, инкубированные в течение 2 (a) и 3-х (b) дней.

Взаимодействия между клетками обуславливают то, что конечности развиваются с предетерминированной переденезадней и дорсовентральной асимметрией.

Этими сигналами являются (Fig 1d, e): (1) эктодермальные клетки 4 5, покрывающие почку конечностиЮ которые на ранних стадиях контролируют дорсовентральную асимметрию будущей конечности; (2) специализированный эпителий, расположенный на верхушке растущей почки конечности (apical ectodermal ridge (AER))6 7 8 , который вместе с подлежащими клетками, (3) т.наз. прогрессивной зоны (PZ)9, управляет ростом конечности вдоль проксимодистальной оси; и (4) группа мезодермальных клеток, расположенная на заднем крае почки конечности, называемая зоной поляризующей активности (ZPA)10 или поляризующей областью, которая контрорлирует рост конечности вдоль переднезадней оси.

The present: the molecular basis of limb development

Transcription factors

Одним из наиболее важных свойств транскрипционных факторов является их экспрессия в строго определеннных областях конечностей, подразделяя их на ряд различных доменов (Fig 2a-i).Тот факт, что эти домены возникают до морфологической дифференцировки подтверждает, что их экспрессия фактически отвечает за спецификацию их и тем самым за формирование паттерна конечности Box A).

.2 Паттерны экспрессии генов различных транскрипционных факторов (слева) и сигнальных молекул (справа) во время формирования почки конечности.

Гомеодомен-содержащие трнаскрипционные факторы обнаруживают паттерн экспрессии nested генов вдоль переднезадней и проксимодистальной осей конечности (Fig 2a-c). Пространственно-временная экспрессия Hox генов коррелирует с их расположением (positional order) в геноме, так что гены, расположенные в 5' хромосомы экспрессируются раньше и в более передних или проксимальных областях развивающейся конечности (пространственная и временная колинеарность (co-linearity)11 12). Hox гены подразделяют конечность вдоль проксимодистальной и переднезадней осей и актививруют подчиненные им гены-мишени в соответствии со своим положением вдоль осей 13 14 15 (Box A).

Мыши с отсутствием определенных Hox генов характеризуются отсутствием специфических скелетных элементов. В каждом случае отсутствующий элемент происходил из ткани, в которой обычно экспрессируется отсутствующий ген (see Ref. 16). Тяжесть мутантного фенотипа выражена сильнее у двойных или тройных Hox мутантов 17 18 19 20.Было установлено, что размер и количество пальцев зависит от уровня наиболее задних членов (11, 12 and 13) Hoxa и Hoxd комплексов. Паттерн Hox белков в конечностях позвоночных обеспечивается скорее количественным и дозово-зависимым способом, чем Hox кодом, в котором разные гены выполняют качественно различные функции ( 21).

Lmx1 и engrailed-1 два гомеодоменовых транскрипционных фактора, чья экспресия ограничивается дорсальной мезодермой и вентральной эктодермой почки конечности, соотв.(Fig 2d, e). Они специфицируют дорсовентральную ось конечности. Показано, что Lmx1 достаточен и необходим для спецификации дорсальных частей (dorsality)22 23 (Box A and R. Johnson, pers. commun.). Мыши с отсутствием engrailed гена имеют конечности с частичными bidorsal характеристиками 24 (Box A).

Ряд других транскрипционных факторов экспрессируется в наиболее дистальной мезодерме PZ и в AER. Это AP2, NF-κ B, Lef1/ β -catenin и Lhx2 (Fig 2)25 26 27 28 29. Снова паттерн экспрессии коррелирует с функциональными свойствами

TBX гены представляют наиболее загадочное семейство транскрипционных факторов. Tbx5 и Tbx4 ограничены мезодермой передних и задних ног соотв. (Fig 2h, i). Некоторые мутации у человека в TBX генах 30 31 32, вместе с паттерном экспрессии 11, трансплантациями и индукцией эктопических конечностей у эмбрионов кур (33 34 and C. Tabin, pers. commun.), подтверждают, что эти гены отвечают за качественные особенности (identity) передних и задних конечностей.

Signalling molecules

Известно, что ретиноевая кислота (RA) вызывает зеркальное удвоение элемнтов конечностей (Box A), as well as generally interfering with limb outgrowth 35 36 37 38 39. Hox гены являются нижестоящими генами-мишенями для RA. В частности, Hoxb8 экспрессия индуцируется RA в отсутствие синтеза белка 40 41 42, а эктопическая экспрессия Hoxb8 обусловливает сходные с индуцируемыми ретиноевой кислотой удвоениями (Ref. 14). RA участвует в закладке переднезадней оси, т.к. она способна индуцировать экспрессию также Sonic hedgehog43.

Sonic hedgehog (Shh) транскрипты обнаруживаются довольно рано в развитии на задней стороне incipient почки конечности позвоночных. Shh экспрессия ко-локализуется с переднезадним организующим центром (organizer centre), ZPA (Fig 2j). Эктопическая экспрессия Shh в передней части почки конечности обусловливает удвоение элементов конечности вдоль переднезадней оси(Box A). Удвоению предшествует активация генов, обычно локализованных в заднедистальной обасти конечности (напр. Patched, Bmp and Hoxd genes)43 44 45 46 47, и подавление генов, обычно локализхованных в передней части конечности. Предполагается 48, что регуляция формирования переднезаднего паттерна с помощью Shh базируется на сходном механизме, который обеспечивается генами Bmp.Следовательно,Shh является критическим для функции

Shh ген кодирует белок клеточной поверхности, который связан с клетоной мембраной с помощью холестерола. Механизм НН сигнальной трансдукции неясен, но передача сигналов НН ассоциирует с двумя другими генами: Patched и Smoothened, которые кодируют трансмембранные белки, ассоциирующие друг с другом и, по-видимому, формирующими комплекс. Предполагается, что НН связывает Patched, меняя рецепторный комплекс, который обеспечивает передачу сигналов посредством Smoothened и ведет к активации транскрипциии генов 49, по крайней мере, генов Fused, serine-threonine киназы, Costal2, родственного кинезину белка и Cubitus interruptus, a zinc-finger-содержащего транскрипционного фактора.

Два гена играют важную роль в формировании AER: Radical fringe (R-fng) и engrailed (En1)24 55 56. R-fng сначала экспрессируется в дорсальной эктодерме почки конечности затем ограничивается AER на поздних стадиях (Fig 2k). En1 экспрессируется комплементарно в вентральной эктодерме и вентральной половине AER (Fig 2d). Эктопическая экспрессия этих двух генов показывает, что AER развивается на границе ткани, которая экспрессирует высокие уровни R-fng, с соседней тканью, которая не экспрессирует R-fng, этоR-fng⁺/R-fng^- граница. Эктопическая экспрессия R-fng на вентральной стороне конечности, где он обычно не экспрессируется, создает новые R-fng⁺/R-fng^- границы, которые дают эктопические AERs. Эктопическая экспрессия En1 в дорсальной эктодерме ведет к репрессии R-fng и тем самым к появлению эктопических R-fng⁺/R-fng^- границ и эктопических гребней

Другой гомоеобокс-содержащий ген, Lhx2, экспрессируется в прогрессивной зоне почки конечности (Fig 2f) и, по-видимому, регулирует экспрессию R-fng в покрывающей дорсальной эктодерме и AER. Показано, что активация R-fng с помощью Lhx2 может опосредоваться членами Fgf (fibroblast growth factor) и Wnt семейств сигнальных молекул.

The Wnt гены кодируют большое семейство внеклеточных белков, 7 из которых экспрессируются в конечностях 57. Wnt7a экспрессируется в дорсальной эктодерме (Fig 2l) и,по-видимому, ответственнен за индукцию экспрессии Lmx1 в подлежащей мезодерме. Кажется, что Wnt7a играет ключевую роль в обеспечениии судьбы дорсальных клеток (образование бидорсальных конечностей)22 23. Устранение геновWnt7a или Lmx1у мышей ведет к образованию biventral конечностей 58 (R. Johnson, pers. commun.).

Wnt3a экспрессируется в AER (Fig 2). Wnt3a эктопическая экспрессия индуцирует эктопическую экспрессию других молекул, обычно экспрессирующихся в AER 27. Передача сигналов Wntобеспечивается цитоплазматическим белком β-catenin. Обычно β-catenin фосфорилирует и в результате деградирует. В присутствииWnt лиганда фосфорилирование ингибируется, что позволяет β-catenin взаимодействовать с HMG-подобным белком, LEF1 и формировать активнуют транскрипционную регуляторную единицу 59. Известно, что Wnt3a активирует экспрессию Fgf8 посредством β-catenin-LEF1 пути. Сигнальный каскад, с помощью которого Wnt7a активирует Lmx1 в мезенхиме неизвестен, но по-видимому, независит от β-catenin и LEF1 (27).

The fibroblast growth factors (FGFs) также экспрессируются в почке конечности, в дистальной мезодерме или AER. Они действуют через рецепторы, которые регулируют тирозин-киназные сигнальные пути. FGFs инициируют целую программу развития конечностей и могут заменять функцию AER, взаимодействуя с др. сигнальными молекулами 45 60 61 62 63 64 65 66 67.

Нарушения экспресси некоторых FGFs или их рецепторов веддет к ряду тяжелых фенотипов. Известно как регулируется экспрессия Fgf8(Fig 2p). R-fng, играет роль в позиционировании и индукции AER и тем самым в индукции экспрессииFgf8. Известно, что Fgf10 экспрессируется в мезодерме конечности 67, а два др. гена экспрессируются в AER, Notch-1 и Wnt3a, и могут индуцировать экспрессию Fgf8 27. Известно, что R-fng и Wnt3a реципрокно активируют др. др. Notch1 активирует Wnt3a, а Wnt3a или активирует или подавляет Notch1,в зависимости от тканевого окружения. Все эти гены могут активировать Fgf8 . Следовательно, не существует простого каскада экспрессии генов и что перекрестные взаимодействия между сигнальынми молекулами играют центральную роль в развитии позвоночных.

The future

Ясно что некоторые FGFs нарушают паттерн экспрессии некоторых Hox генов и что FGFs могут индуцировать эктопическое образование конечности. Данные по мутантным Hoxb5 мышам указывают на то, что имеется взаимосвязь между положением, где возникает конечность и специфической комбинацией экспрессируемыхHox генов 68 69. Более того переднезадняя информация в почке конечности уже существует в латеральной пластинке мезодермы задолго до того как начнется формирование почки конечности и до появления Shh транскриптов. Сходным образом Wnt7a и En1 участвую в формировании дорсовентральной оси , однако спецификация этой оси, по крайней мере у эмбрионов кур, первоначально детерминируется мезодермальной тканью, которая не экспрессирует ни Wnt7a ни En1.

События, происходящие на поздних этапах развития конечности изучены слабо, особенно регуляция морфогенеза (размера и пропорций конечностей) и клеточно дифференцировки (в мышцы, сухожилия, хрящи, кровеносные сосуды, нервы и т.д.). Гены, используемые во время формирования почек кончностей, по-видимому, использую.тся и на этих борлее поздних стадиях развития. Напр., гены, связанные с дифференцировкой хряща (Indian hedgehog, a relative of Shh, and Bmp2, Bmp4 и большинство Hox генов)15 70 71 а также те, что регулируют развитие почек перьев (Shh, Wnt7a, Notch, Delta and Serrate; 72 73 74).

Имеется несколько примеров взаимодействий между сигнальынми молекулами и метаболическими процессами. Напр., в результате инициального процессинга N-терминальной части HH белок прикрепляется к клеточной мембране посредством cholesterol moieties. В результате, если синтез холестерола нарушается возникает фенотип, сходный с тем, что возникает у мышей с отсутствием Shh (Refs 78 79 80). Следовательно, передача сигналов НН зависит от доступности холестерола. Др. пример, передача сигналов Wnt и действие FGF тесно связаны с гепаран сульфат протеогликанами и гепарином 75 76. Эти и др. данные указывают на существование биохимических взаимодействий, которые используют, во многих случаях, организованные комплексы белков между компонентами разных сигнальных путей.

Key experiments from two eras of studying limb development

.3 Диаграмма представляет некоторые ключевые эксперименты на эмбрионах кур и мышей, позволившие выявить клетки и гены, контролирующие ранние стадии развития конечностей

PATTERN DORSOVENTRAL of LIMBs

ПАТТЕРН ДОРСО-ВЕНТРАЛЬНЫЙ (конечностей) (Chen, Jhonston, 1999)

Дорсовентральная асимметрия является характерным свойством анатомии конечностей позвоночных. У большинства видов кожа, покрывающая дорсальную и вентральную поверхность конечностей уникально специализирована, например, вентралные подушки и эккриновые (потовые) железы у мышей, дорсальные ногти и увеличенная плотность волосяных фолликулов у млекопитающих, а также расположение перьев и чешуек у птиц. Внутренние ткани конечностей, такие как скелет, мышцы, сухожилия, кровеносные совуды и нервы дифференциально ранжированы в дорсальной и вентральных частях конечностей.

Парные конечности позвоночных впервые обнаруживаются в виде почек, формируемых утолщениями латеральной пластинки мезодремы. Покрывающая поверхность конечностей в является одиночным слоем эпителия. В результате формирования почки происходит быстрая пролиферация, обусловливающая выпячивание почки из стенки тела. Скелетная и соединительная ткань дифференцируется из латеральной пластинки мезодермы, сначала в проксимальной части почки конечности и постепенно во все более дистальных регионах. Паттерн мышц также закладывается в проксимо-дистальной последовательности. Эктодерма почки конечности вносит вклад в производные интегумента, такие как волосы, ногти, потовые железы, перья и чешуйки в результате реципрокной передачи сигналов между клетками эктодермы и подлежащей мезенхимы.

Ранние события: возникновение дорсовентральной полярности в презумптивной почке конечности

Во время развития позиционная информация впервые предопределяется вдоль дорсовентральной оси кончности. Дорсовентральная полярность возникает как в презумптивной мезодерме, так и эктодерме до выпячивыания почки конечности из тела. Эксперименты по инверсии почки показали, что у кур мезодерма уже на ст. НН 12 имеет стабильную дорсовентральную полярность. Кроме того мезодерма способна менять дорсовентральную полярность в эктодерме. Эксперименты по рекомбинации показали, что эктодерма нуждается в дорсовентральной полярности в подлежащей мезодерме до выпячивания почки конечности ( приблизительно до ст НН 15).

Однако недавно было показано, что ротации на ст. НН 13 не меняют дорсовентральной оси. Michaud et. al., (1997) полагают, что отличие м.б. обусловлено влиянием сомитов или латеральной соматоплевры на дорсовентральную полярность поля конечности. Уже раньше предполагалось, что сигналы от окружения детерминируют дорсовентралную полярность поля конечности. Показано, что сомиты участвуют в предопределении этой оси. Показано, что индуктивные сигналы исходят из сомитов, влияя на трансплантированные между двумя рядами сомитов презумптивные ткани конечности и обусловливают формирование би-дорсальных конечностей. Вставление фильтра между латеральной соматоплеврой и презумптивной областью конечности также ведет к формированию би-дорсальных конечностей. Это указывает на то, что оппозитные вентрализующие сигналы исходят из латеральной соматоплевры. Возможно, что при ранней мезодермальной ротации некоторые сомиты и/или соматоплевральная мезодерма включается в трансплантант и эта ткань влияет на дорсовентральную полярность трансплантанта.

Неожиданно эктодерма, которая должна давать дорсальную эктодерму почки конечности первоначально обнаруживается в медиальном положении по отношению к презумптивной мезодерме почки конечности. По мере роста зачатка эктодермальные клетки мигрируют латерально, покрывая дорсальную поверхность конечности. Сходным образом презумптивная вентральная эктодерма занимает территорию латеральную по отношению к мезодерме почки конечности. Очевидно презумптивная экодерма запрограммирована до миграции и что дорсовентральная полярность мезодермы формируется в результате комбинации сигналов от эктодермы к мезодерме и миграции эктодермальных клеток. Эта интерпретация может объяснить, почему фильтр между латеральной соматоплеврой и мезодермой презумптивной почки конечности дорсализуюет почку конечности.Фильтр препятствует презумптивной вентраьной эктодерме достигнуть почки конечности и она покрывается исключительно дорсальной эктодермой.

Апикальный эктодермальный гребень (АЭГ) и формирование дорсовентрального паттерна: одно или два события?

Расположение АЭГ детерминируется еще до выпячивания почки конености примерно в то же время, когда закладывается дорсовентральныйпаттерн. Позиционирование АЭГ м.б. связано с механизмом дорсалной и вентральной поляризации эктодермы. Однако имеются некоторые указания на то, что эти процессы разделены. Более того неправильная экспрессия wnt7a или lmx1b, генов участвюущих в спецификации судьбы дорсальрых клеток, не влияют на расположение и морфологию АЭГ. Ген radical fringle, экспрессирующийся в дорсальной эктодерме и АЭГ, по-видимому, играет первичн4ю роль в позиционировании АЭГ. Сопоставление клеток, экспрессирующих и не экспрессирующих тот ген, обусловливает локализацию АЭГ. Возможно, что первоначально дорсовентральная спецификация и позиционирование АЭГ модулируются одиночным событием, но позднее их пути расходятся. Транскрипционый фактор en-1, экспрессируемый в вентральной экодерме, по-видимому, координирует оба эти процесса. En-1 одновременно репрессирует экспрессию дорсализуюдего сигнала wnt7a и АЭГ-позиционирующего сигнала radical fringle.

Поздние события - спецификация дорсовентральной полярности почки конечности

На стадии пред-почки дорсовентральная позиционная информация находится в сомитной мезодерме и/ или в презумптивной почк еконечности. Однако после образования почки конечности дорсовентральная позиционная информация переносится в эктодерму. Инверсия эктодермы вдоль дорсовентральной оси начиная со ст НН 15 инвертирует дорсовентралный паттерн дистальной мезенхимы и эктодермы. Установлено, что инвертированная эктодерма оказывает влияние только на клетки прогрессивной зоны, группы клеток на дистальном конце почки конечности, которая еще не детерминирована к определенным дорсовентральным позиционным значениям.

Идентифицирован молекулярный каскад из секретируемых сигнальных молекул и транскрипционных фаторов: wnt7a, секретируемого гликопротеина; en-1, гомеобоксного фактора транскрипции; и lmx1b, LIM-доменового фактора транкрипции.. Первые экспрессируются в дорсальной и вентральной эктодерме, соответственно, а последний в дорсальной мезенхиме почки конечности. Предполагается, что en-1 репрессирует wnt7a транскрипцию в вентральной эктодерме. Wnt7a индуцирует экспрессию lmx1b в дорсальной мезенхиме, который специфицирует судьбу дорсальных клеток.

Имеются указания, что wnt7a и en-1 необходимы для дорсовентральной спецификации паттерна конечностей в ограниченной дистальной области, тогда как активность lmx1b необходима в более широкой обалсти. Lmx1b играет более важную роль, так как специфицирцет дорсовентральную судьбу клето в мезенхиме всей конечности.

Морфогенез и дифференцировка вдоль дорсовентральной оси

В отсутствие дорсальной позиционной информации, как это происходит у wnt7a и lmx1b мутантов, конечности оказываюбтся симметричными с вентральынм проявлением. Очевидно вентральный паттерн является изначальным (defаult), а система дорсальной спецификации лишь модифицирует этот изначальный паттерн. Мышцы конечностей возникают в результате миграции клеток из латеральных дермамиотомов сомитов в почку конечности. До миграции миобласты не специфицированы в отношении паттерна мышц. Отдельные мышцы формируются в результате процесса расщепления мышечной массы миобластов для образования более мелких единиц до тех пок пока не возникнут единицы для каждой отдельной мышцы.. Этот процесс расщепления онтогенетически регулируется в дорсальной и вентральной частях почки конечности и зависит от присутствия или отсутствия lmx1b. Сходным образом паттерн моторных и сенсорных нейронов отличен в дорсальной и вентральной части почки конечности и, по-видимому, также зависит от lmx1b.

Ногти, волосяные фолликулы, подушечки пальцев и эккриновые железы формируются в результате комбинации эктодермальной и мезодермальной ткани. У мутантных lmx1b мышей затрагивается образование ногтей, плотность волосяных фолликулов, число и расположение ладонных подушек, но не происходит эктопического образования потовых желез. Напротив потовые железы отсутствуют у en-1 мутантных мышей. Следовательно, спецификация эккринных желез зависит от дорсовентральной позиционной информации в эктодерме, тогда как спецификация остальных зависит в первую очередь от статуса мезодермальных сигналов.

PATTERN of MESODERM

ПАТТЕРН МЕЗОДЕРМЫ

У эмбрионов кур бластодермальные клетки на стадии 3 или 4 НН дают энтодермальные и эндотелиальные и красные кровяные клетки, а на стадии 5 продуцируют эндотелиальные и миокардиальные клетки. Было показано, что фактор стволовых клеток и TGF α меняет клеточные фенотипы в результате стимулирвания дифференцировки эритроцитарных клеток и миокардиальных, соответственно. Способность этих ростовых факторов сдвигать профиль дифференцировки агрегированных культур указывает на пластичность ранних эмбриональных клеток . Меченные QCE-6 клетки вводили в культуры бластодермальных агрегатов .Ранее было показано, что эти перепелинные мезодермальные клетки обладают характеристиками ранней недифференцированной мезодермы и могут быть индуцированы к экспрессии или миокардиальных или эндотелиальных клеточных фенотипов. В данной работе было показано, что они дифференцируются в полностью контрактильные кардиомиоциты или эндотелиальные или эритроцитарные клетки. QCE-6 cells перепела дифференцируются в эритроцитарные клетки, если культивируются с бластодермальными клетками 3 или 4-й стадии развития, но не с клетками 5-й стадии. Соответственно, дифференцировка QCE-6 клеток в сокращающиеся кардиомиоциты происходит только тогда, когда эти клети инкорпорируются в агрегаты бластодермальных клеток стадии 5 . Идентичные паттерны сортировки и дифференцировки QCE-6 и бластодермальных клеток указывают на то, что образование дифференцированных типов клеток в ранней мезодерме управляется окружающей средой без непосредственного предопределения клеток ( immediate cellular commitment). Кроме того эти результаты указывают на то, что QCE-6 клетки являтся мультипотентными мезодермальными стволовыми клетками (Eisenberg, Markwald, 1997).

Сигналы фактора FGF участвуют в формированиии паттерна мезодермальных и нейральных клонов во время раннего развития позвоночных на это указывает вовлечение в этот процесс его рецептора FGFR-1

Embryology of Vertebrate Limb Development

Конечности развиваются из небольших зачатков, появляющихся на соотв. месте вдоль краниально-каудально оси эмбриона и состоящих из недифференцированных мезенхимных клеток, покрытых эктодермой. Зачатки затем растут и меняют форму. В то же время клетки дифференцируются, чтобы сфрмировать различные ткани конечностей в прокисмо-дистальной последовательности, начиная от т.наз. прогрессивной зоны. Экспериментами по трансплантации установлено, что миогенные клетки происходят из отдельного источника, сомитов, и мигрируют в кончность-формирующие области. Происходждение соединительной ткани конечностей неизвестно.

Согласно концепции позиционной информации (Wolpert, 1969) клетки в зачатке конечности сначала информируются о их положении и затем эта информация интерпретируется клетками в виде образования соотв. структур.

Существует три набора межклточных взаимодействий в развивающейся конечности, связанных с информированием клеток об их положении: формирование проксимо-дистальной, передене-задней и дорсо-венральной осей (Рис. 2). В каждом таком взаимодействии определена популяция клеток, продуцирующая сигналы, которые действуют на мезенхиму зачатка конечности. Эти сигнальные области следующие: апикальный эктодермальный гребень, отвечающий за проксимодистальную ось; эктодерма, покрывающая боковые стороны зачатка, управляющие дорсо-вентральным паттерном; и поляризующая область, контролирующая передне-задний паттерн.

Signals that Mediate Cell-Cell Interactions in Vertebrate Limb Buds

Довольно небольшое количество семейств сигнальных молекул отвечает за межклеточные взаимодействия в эмбриональном развитии, но некоторы из этих семейств содержат 20 и более членов. Основные семейства сигнальных молекул, важных для развития конечностей, приведены в Табл. 1, это fibroblast growth factors (FGF's), hedgehogs (Hh's), bone morphogenetic proteins (Bmp's) и Wnt's (семейство родственное int1 прото-онкогенам позвоночных и wingless гену дрозофилы). Некоторые члены этих семейств действуют и в др. областях эмбриона.

Идентифицированы рецепторы и пути внутриклеточной передачи. Теперь очевидно также, что сила и размах передачи сигналов модулируются внеклеточными антогонисатми и за счет связывания белками клеточных мембран и внеклеточного матркса. Др. генеральным свойством является то, что сигналы действуют вместе и, более того, временая последовательность, в которой сигналы оперируют, м.б. важной.

Предполагается, что взрослые стволовые клетки м.б. более пластичными, чем это предполагалось (Morshead and van der Kooy, 2001). Поэтому детеальное знание временных и пространственных параметров действия сигналов м. привести к новым подходам получения клеток для репарации и замещения тканей.

Apical Ridge Signaling

Члены семейства FGF's играют несколько ключевых ролей с развитии конечностей (Martin, 1998; Tickle and Munsterberg, 2001). Некоторые из Fgf's экспрессируются в апикальном эктодермальном гребне (АЭГ), утолщенном крае эктодермы на кончике почки конечности; Fgf8 экспрессируется очень рано по всему АЭГ, тогда как FGf4, -9 и -19 экспрессируются позднее и только в более задних частях гребня. Эксперименты на эмбрионах кур показали. что Fgf-смоченные кусочки м. замещать F"U и обеспечивать рост конечности в длину. Условный нокаут Fgf4 не нарушал развития конечностей. но условный нокаут Fgf8 приводил к скелетным дефектам, причем передние и проксимальные структуры были повреждены наиболее сильно. Эти результаты указывают на то, что др. Fgf's? экспрессирующиеся в гребне м. до некоторой стпени, восстанавливать развитие конечностей. Более того, потеря проксимальных структур у Fgf8 нокаутов м.б. обусловлена ранней гибелью клеток.

Fgf's обеспечивают не только рост почки, они участвуют также и в инициации конечности. Fgf10 экспрессируется в мезенхиме ранних конечноти-формирующих областей. У Fgf10 нулевых мышей конечности или сильно редуцированы или отсутствуют. Fgfr2IIIb , изоформа рецептора, через которую Fgf10, по-видимому, пердает свои сигналы, экспрессируется в эктодерме конечностей. Когда Fgfr2IIIb функционально инактивирован, то снова конечности не развиваются. Следовательно, перадача сигналов Fgf между мезенхимой и эктодермой является центральным событием для инициации конечностей.

На поздних ст. развития конечностей Fgf's контролируют морфогенез и рост скелета. Важность передачи сигналов Fgf в этих процессах следут и из исследований клинических генетиков. Различные мутации в рецептрах Fgfr3, Fgfr1 и Fgfr2 ответственны за ахондроплазию, наиболее распространенную форму скелетной дисплазии, и синдром Pfeiffer и Apert, при которых пальцы сливаются (Табл. 1). Работа с антогонистом Fgf sprouty у эмбрионов кур, который сам индуцируется с помощью передачи сигналов Fgf, показала, что неправильная экспрессия sprouty ведет к укорочению длинных костей конечностей. Это указывает на возможную роль генов sprouty в обеспечении эффектов мутаций Fgfr3 у пациентов (Minowada et al., 1999).

Ectoderm Signaling

Wnt7a является важным для формирования дорсо-вентралного паттерна. Wnt7a экспрессируется в дорсальной эктодерме, но не в апикальном гребне или вентральной эктодерме, а лапы у Wnt7a нокаутных мышей имеют двойной вентральный фенотип (Parr and McMahon, 1995).

Wnt3a экспрессируется в раннем АЭГ эмбрионов кур и, как полагают, участвует в формированиеи АЭГ. Недавние исследования подтвердили, что Wnt's и Fgf's м. чередоваться др. с др. в сигнальных каскадах, что ведет к инициации конечности и формированию АЭГ с помощью сигналов Wnt, индуцирующими экспрессию сигналов Fgf (Kawakami et al., 2001). Подобно Fgf's Wnt's также экспрессируются в мезенхиме помимо эктодермы, а Wnt5a экспрессируется градиентно в мезенхиме зачатка конечности, его транскрипты более обильны на кончике зачатка. Wnt5a нокаутные мыши имеют очень редуцированные кончности, причем более дистальные области затрагиваются прогрессивно сильнее, так что отсутствуют дистальные фаланги пальцев (Yamaguchi et al., 1999).

Polarizing Region Signaling

Производное витамина А , ретиноевая кислота, вместе с sonic hedgehog и Bmps ассоциированы с передачей сигналов поляризующей области, области мезенхимы на заднем крае почки конечности. Сигнальные свойства этой области выявлены давно (Saunders, 1977). Мезенхимные клетки ранних конечности-формирующих областей эмбрионов кур экспрессируют ген, который кодирует retinal dehydrogendse (Raldh2), фермент, который конвертирует retinal в ретиноевую кислоту (Swindell et al., 1999). Shh и Bmps, в частности Bmp2, экспрессируются в поляризующей области (Рис. 2). Более того, кусочки, смоченные или ретиноевой кислотой или Shh (или клетки, экспрессирующие Shh), помещенные в передний край почки крыла поспроизводят эффекты поляризующей области, индуцируюя удвоения пальцев (Pearse and Tabin, 1998). Более того, многие мышиные polydactykous мутации обнаруживают эктопическую экспрессию Shh на переденем крае зачатка конечности.

Shh экспрессия индуцируется, если ретиноевая кислота действует на передний край зачатка крыла цыпленка. Shh и Bmps, по-видимому, образуют сигнальный каскад, сходный с тем, что обнаруживатся при развитии крыла дрозофилы, который вовлекает Hh и Dpp (который очень близок к Bmp2 и Bmp4). Shh индуцирует экспрессию Bmp2 в зачатке крыла птиц (Yang et al., 1997), считается, что последовательная передача сигналов с помощью Shh и Bmp2 ведет к формированию передне-заднего паттерна пальцев (Drossopoulou et al., 2000). В этой модели Shh контролирует ширину зачатка конечности и тем самым предопределеяет количество пальцев, тогда как Bmps действуют на клетки уже после Shh и предопределяют тип пальцев. Согласно этой идее Bmps являются молекулами, отвественными за передачу позиционной информации в отношении идентификации пальцев. это верно и для зубов (Tucker et, al., 1998).

Несомненно участие ретиноевой кислоты в установлении поляризующей области и формировании паттерна проксимальных частей конечности. У Shh нулевых мышей проксимальные структуры конечностей развиваются нормально. Если вооздействуют антогонистом ретиноида на эмбрионов кур на ранних стадиях инициации конечностей (Helms et al., 1996; Stratford et al., 1996) или функционально инактивирован ген, кодирующий Raldh2, то зачатки конечностей не развиваются (Niederreither et al., 1999). Следовательно, ретиноевая кислота скорее всего формирует паттерн проксимальных сегментов конечностей ( пояса конечностей, плечо или бедро), тогда как Shh и Bmps кооперативно формируют паттерн средних и дистальных сегментов.

Coordination of Signaling

Имеется связь между сигнальными каскадами, базирующимися в поляризующей области, и передачей сигналов Fgf в АЭГ, которые ваздны для контроля за толщиной зачатка конечносте. Передача сигналов Fgf поддерживает экспрессию Shh в подлежащей мезенхиме и в свою очередь Shh поддерживает экспрессию Fgf в задней части АЭГ. Поддержание экспрессии Fgf4 в гребне обеспечивается с помощью гена Gremlin, антогониста Bmp (Zuniga et al., 1999). Wnt7a также, по-видимому, играет роль в поддержании экспрессии Shh, а Fgf's в поддержании экспрессии Wnt7a. Т.о., передача сигналов вдоль всех трех осей конечности скоординирована так. что каждый сегмент конечности закладывается корректно относительно дорсо-вентральной и передене-задней оси.

Genes Expressed in response to Positional Signals

Гены, отвечающие на позиционную информацию: члены двух Нох комплексов генов, Ноха и Hoxd, Spalt, Meis, Lmx1 и Tbx2 и -3, все они кодируют транскрипционные факторы (Табл. 1). Ноха9-13 и Hoxd9-13 гены находятся на 5' концах соотв. кластеров генов, они экспрессируются в перекрывающихся доменах ранних зачатков конечностей, чем дальше от 5' конца ген, тем он экспрессируется позднее и более дистально (Рис. 3). По мере роста зачатка конечности Ноха13 и Hoxd13 экспрессия поддерживается в области кончика, а позднее обнаруживается более сложные и динамические паттерны экспрессии Нох генов (Johnson and Tabin, 1997). Когда сигналы поляризующей области помещаются на передений край зачатка крыла птиц. то эктопическая серия перекрывающихся доменов экспрессии генов Ноха и Hoxd индуцируется, но для этого необходимы сигналы АЭГ. Болеее того, поддержание нормаьных доменов экспрессии Hoxd13 и Ноха13 на кончике раннего зачатка, по-видимому, зависит от передачи сигналов Fgf от апикального грабеня. Функциональная инактивация этих Нох генов у мышей указывает на то, что вместе паралоги Ноха и Hoxd играют основную роль в контроле развития структур конечностей вдоль проксимо-дистальной оси. Т.о., когда и Ноха11 и Hoxd11 функционально инактивированы, то затрагиваются средние сегменты кончностей, тогда как пальцы затрагиваются, когда инактивированы и Ноха13 и Hoxd13. Гены, кодирующие транскрипционные факторы, которы содержат связывающие мотивы цинковые пальчики, родственны гену Spalt дрозофилы, они также экспрессируются на кончиках ранних зачатков конечностей и м. участововать в формирование паттерна пальцев. У эмбрионов кур, экспрессия одного из таких генов, Csal1 , регулируется комбинацией сигналов Wnt и Fgf (Farrell and Munsterberg, 2000).

Два др. очень близких содержащих гомеобокс гена Meis1 и Meis2, по-видимому. связаны развитием проксимальных сегментов конечностей (Capdevilla et al., 1999; Mercader et al., 1999, 2000). Эти сначала экспрессируются по всему раннему зачатку конечности, но затем экспрессия выключается на кончике зачатка конечности и ограничивается более проксимальными частями. Meis2 впервые обнаружен при скрининге генов, чувствительных к ретиноидам, а эксперименты с антагонистами ретиноидов показали, что Meis гены регулируются передачей сигналов эндогенных ретиноидов в зачатках конечностей кур. В противоположность Нох, гены Meis негативно регулируются Fgf. Когда гены Meis экспрессируются неправильно в зачатках крыльев птиц, то проксимальные структуры распространяются более дистально.

Куриный ген Lmx1 (у мышей он известен как Lmx1b ) кодирует гомеодоменовый транскрипыионный фактор и участвует в формировании дорсо-вентрального паттерна. Lmx1 (Lmx1b) экспрессируется в дорсальной мезенхиме зачатка с очень ранних стадий развития конечностей (рис. 3). Экспрессия Lmx1 м.б. индуцирована в вентральной мезенхиме эмбрионов кур путем имплантации клеток, экспрессирующих Wnt7a, но имеются противоречащие сообщения. В зачатках конечностей кур эктопическая экспрессия Lmx1 в вентральной мезенхиме ведлет к дорсализации. Более того, если функция Lmx1 репрессирована в дорсальной части зачатка крыла птиц или функционально инактивирована у эмбионов мыши, то возникают конечности с двойным вентральным паттерном (Schwabe et al., 1998).

Hoxd экспрессия учатвует в формировании передне-заднего паттерна кроме того в формировании проксимо-дистального паттерна. Экспрессия Hoxd13 в ранних почках крыла птиц ограничена задними и дистальными частями (Рис. 3). Если Hoxd11 экспрессируется эктопически в зачатке конечностей кур, то это вызывает изменения в передне-заднем паттерне, включая и образование дополнительных пальцев. Однако, установлены перекрывающиеся домены экспрессии Hoxd генов в отсутствие компонентов сигнального каскада поляризующей области, напр., у Shh нулевых мышей. Сравнительно недавно выявлены родственные Tbx2 и Tbx3 гены, которые являются членами семейства генов Tbx, которые кодируют транскрипционные факторы и участвуют в формировании передне-заднего паттерна. Оба гена экспрессируются в виде полос на переденем и заднем краях зачатка конечности (Рис. 3) (Gibson-Brown et al., 1998).

Patterning Mechnisms and Resultant Limb Phenotype

Неясно, как транскрипционные факторы, описанные выше генерируют точную анатомию конечности и как их действие интегрируется. Неясно также, как мутации в генах человека (Табл. 1) ведут к определенным фенотипам конечностей. И еще один специфический вопрос, как возникают анатомические различия между верхними и нижними конечностями. Сигнальные молекулы, которые формируют паттерн верхних и нижних конечностей являются одними и теми же и имеют сходные паттерны экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы. Выявлены гены Tbx5 и Tbx4, которые экспрессируются специфически в верхних и нижних конечностях, соотв. Исследования по эктопической экспрессии у эмбрионов кур показали, что гены м. контролировать паттерн типа конечности. Если, напр., Tbx4 экспрессируется в зачатке крыла, то некоторые аспекты формирующегося крыла выглядят ногообразно. Как в точности гены Tbx вносят свой вклад в процессы формирования паттерна конечностей, неясно.

Паттерн-формирующие процессы, описанные выше, специфицируют не только скелет, но и ассоциированны с ним мышцы и сухожилия, обеспечивая тем самым скоординированное развитие столь разных тканей конечностей. Когда сигналы поляризующей области помещают впереди, то паттерн мышц, помимо хрящевых элементов, удваивается (Shellswell and Wolpert, 1977; Robson et al., 1994; Duprez et al., 1999). Позднее, когда заложен глобальный паттерн конечности, причем увеличивается размер и сложность конечности, то, по-видимому, закладываются новые локальные наборы межклетоных взаимодействий, котрые оперируют в определенных тканях и/или паттерн-специфических областях конечности. Напр., ген, который, как кажется, действует в ограниченных типах тканей, это гомеобоксный ген Mox2. Если Mox2 функционально инактивирован у трансгенных мышей, то это ведет к аномалиям мускулатуры конечностей, но склетк при этом развивается нормально (Mankoo et al., 1999). Идентифицированы и др. гены, которые специфически затрагивают сигнальные каскады, отвечающие за формировние суставов (Storm and Kingsley, 1999; Hartman and Tabin, 2001).

Сайт создан в системе uCoz