Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes
GILBERTO R. SAMBRANO, IAIN FRASER, HEPING HAN, YAN NI, TIM O'CONNELL, ZHEN YAN JAMES T. STUL Nature420, 712 - 714 (12 December 2002); doi:10.1038/nature01306
Cardiac myocytes have a complex network of signals that regulates their essential role in the rhythmic pumping of the heart. This network is an appealing model system in which to study the basic principles underlying cellular signalling mechanisms. Progress in this effort has come through the establishment of standardized myocyte isolation and culture procedures and characterization of important signalling responses.
Сердце является органом, приспособленным для перекачки крови. которое в соотвествии с нуждами м. модифицировать контрактильную силу и скорость сердцебиений1. Кардиальные миоциты являются самыми важными клетками сердца; они координируют контракцию и обладают способностью чувствовать большое количество гормональных, нейральных, электрических и механических импульсов посредством многочисленных рецепторов клеточной поверхности и ядра2-9. Миоциты являются также мишенями для экстраординарного количества физиологических и фармакологических агентов, которые необходимы для регуляции силы контракции и скорости сердцебиений и которые вовлечены в некоторые середнососудистые заболевания.
Сигналы, передаваемые с помощью G-протеин-зависимых и др. путей, образуют высокоо скооперированную сеть взаимодействующих молекул1. Эта сигнальная сеть регулирует множество сложных функций, которые поддерживают ритмическое перекачивание крови сердцем, но м. также приводить к патологическим состояниям, в частности к гипертрофии и недостаточности миокарда.
Кардиальные миоциты увеличиваются в размерах (гипертрофия) как компенсаторная адаптивная реакция, также как скелетные мышцы, увеличивающиеся при тренировке10,11. Сердечнососудистые заболевания, такие как гипертензия или нарушения клапанов, увеличивают нагрузки на стенки желудочков и запускают гипертрофическую реакцию, которая первоначально является компенсторной, но миокард постепенно декомпенсирует (приводя к сердечной недостаточности)12. Механизмы, ответственные как за физиологическую, так и патофизиологическую гипертрофию, зависят от влияния Ca2+ и дополнительных сигнальных путей. Установлена связь между недостаточностью сердца и относительно распространенными полиморфизмами генов, кодирующих β1- и α2c-адренергические рецепторы13. Прогрессирование от гипертрофии к недостаточности сердца м. в дальнейшем приводить к апоптозу кардиальных миоцитов10-12.
Понимание взаимоотношений между сигнальными путями, которые управляют этими отдельными реакциями, м. привести к выявлению, как как физиологическое событие становится патологическим. По этой причине Alliance for Cellular Signaling (AfCS) избрал кардиальные миоциты взролсых мышей в качестве модельной системы для исследования того, как клетки интерпретируют сигналы. Знания, полученные с использованием этой модели, помогут ответить на некоторые более фундаментальные вопросы, связанные с клеточными сигнальными сетями (см статью ). Наша цель - понять, как варьирующие, но сцепленные реакции связаны в слодной сети сигнальных путей в этом типе клеток.
A cardiac myocyte model system
Кардиальные миоциты представляют собой привлекательную клеточную модель для изучения и ставят уникальные задачи. Так, прежде всего контрактильная клетка сердца является высоко специализированной и отвечающей на чрезвычайно разнообразный спектр стимулов. Побуждаемые ранними наблюдениями, что цАМФ обеспечивает β-adrenergic стимуляцию контрактильности14, многие физиологические и биохимические исследования пытались изучить сигнальные механизмы в сердце. Миоциты, изолированные от разных видов стали предметом обширных исследований передаи сигналов, но использование модельных мышей стало возможным лишь недавно.
Новые инструменты позволили фенотипически охарактеризовать интактных мышей и изолированные сердца после устранения генов или в случае мутаций или избыточной экспрессии критичпских белков. Эти подходы пролили свет на механизмы развития сердца, сопряжение excitation–contraction (EC) (клеточная контракция в ответ на электрическую стимуляцию), рецепторами-опосредованную передачу сигналов и миокардиальную гипертрофию. Но научные заключения о лежащих в основе механизмах передачи сигналов лишены определенности из-за модифицирующих гемодинамических и гормоналтьных влияний в дополнение к важным взаимодействиям между миоцитами и интерстициальными клетками. Необходима изолированная и разработанная модельная система кардиальных миоцитов взрослых мышей, чтобы решить более специфические вопросы о клеточных механизмах, не пытаясь воспроизвести всю сложность ситуации in vivo.
Чтобы адаптировать модельные миоциты для изучения сигнальных сетей, был разработан план экспериментов, созданы воспроизводимые процедуры для выделения и поддержания мышиных кардиальных миоцитов в культуре и начата характеристика варьирующих сигнальных реакций в этих клетках.
Isolation and culture of cardiac myocytes
Первичные клетки, выделенные из интактного сердца, стали важной моделью для исследования, т.к. не существует клеточных линий, поддерживающих уникальную палочко-образную морфологию и набор белков, необходимый для EC coupling (сопряжения). В бессывороточной культуре взрослые кардиальные миоциты от морских свинок, крыс и кроликов являются обычно покоящимися и сохраняют свою жизнеспособность и уникальную палочковидную морфологию в течние нескольких дней. Эти клетки сохраняют высоко организованные мембраны и миофибриллярные структуры, которые поддерживают контракции, индуцированные электическими или фармакологическими стимулами, и пригодны для вирус-опосредованной экспрессии экзогенных белков15-17. Однако, сходные культуры кардиальных миоцитов мыши вязаны с большими проблемами из-за трудностей энзиматического выделения здоровых миоцитов и уникальной вариабельности относительно долговременных культур.
Во время попыток AfCS получить такие культуры, некоторые исследователи сообщили о прогрессе в деле выделения и культивируования кардиальных миоцитов мыши18,19. Принимая во внимание современный интерес к мышиной генетике мышинные модели становятся очень удобными. Следовательно, наша пероначальная цель создать процедуру выделения жизнесопособных палочковидных кардиомиоцитов, которая м. сохраняться в культуре в течение 24 ч, следовательно, получать поуляцию клеток, пригодных для изучения кратковременных реакций на лиганды, была достигнута. Теперь необходимы процедуры поддержания миоцитов в течение 72 ч или дольше, чтобы сделать возможными манипуляции с экспрессией генов в культуре с использованием антисмысловых нуклеотидов и RNA interference. Эти палочковидные миоциты д. сохранять механизмы EC coupling и реагировать на активацию рецепторов, особенно на события фосфорилирования белков, которые затрагивают контрактильность и гипертрофию2-9.
AfCS разработала и стандартизировала процедуру выделения вентрикулярных кардиальных миоцитов от взрослых мышей, модифицировав уже имеющиеся протоколы18,19. Исследователи AfCS Laboratory for Development of Signaling Assays сконцентрировались на инициальной разработке протоколов выделения и на выявлении путей реакций с помощью фосфорилирования белка фосфоспецифическими антителами. Тем временем исследователи из AfCS Cell Preparation and Analysis Laboratory оценивали реакции EC coupling путем измерения изменений цитозольного Ca2+ и контракции после электрической стимуляции. Объединение этих усилий привело к созданию пригодного и воспроизводимого метода, дающего клетки качественно и количественно достаточные для изучения передачи сигналов в культуре. Удалось получать около одного миллиона палочковидных миоцитов на сердце, из которых 80% оставались палочковидными после извлечения. Высокий процент клеток сохранял функцию и палочковидную морфологию свыше 24 ч после извлечения, и при расширенном культивировании свыше 72 ч. (90% и 75% клеток, соотв.). Детали экспериментов будут вскоре опубликованы в Signaling Gateway ().
Characterization of cellular responses
Клетки, культивируемые таким образом, обладают важными реакциями, которые указывают на сохранение in vivo функциональных аттрибутов, а также подходящих сигнальных endpoints для будущих исследований (см ). Кроме того, лишь небольшие изменения в профилях экспрессии мРНК наблюдались между миоцитами, культивированными в течениме 24 ч, и толко что выделенными. Эти результаты подтверждают, что наша модел myfz система готова к дополнительным исселдованиям и мы м. начать выяснение сложности сигнальной сети. И наконец, широкий скрининг сигнальных реакций на примерно 30 лигандов будет вскоре начат с помощью измерений кратковременных изменений в накоплении цАМФ, цитоплазматических концентраций Ca2+, фосфорилирования белков, контракции и экспрессии генов. Эти измерения выявят спектр реакций для сравнения действия индивидуальных лигандов и для детекции взаимодействий между комбинациями лигандов.
Характеристика этих функциональных реакций после увеличения времени культивирования также теперь становится возможной. Исследователи из AfCS лабораторий наблюдали, что рутинное использованиев для изолированных кардиальных миоцитов 2,3-butanedione monoxime (BDM) помогает поддерживать палочковидные функциональные миоциты в культуре в течение 72 ч или более. BDM используется для ингибрования гиперсократимости миоцитов во время изоляции и во время восстановления Ca2+ в среде. Он также используется как компонент cardioplegic растворов для защиты от ишемических повреждений23. BDM затрагивает ряд клеточных процессов, включая базирующуюся на миозине контракцию, токи ионов и высвобождение кальция24. Т.к. BDM или ITS (insulin, transferrin и selenium) по одиночке недостаточны, то включение обоих в культуральную замедляет округление миоцитов, обычно наблюдаемое спустя 48–72 ч ().
Figure 1 Long-term culture of cardiac myocytes.
(56k)
Хотя механизм(ы) защитного действия неясны, миоциты, культивируемые в течение 72 ч с BDM и ITS обнаруживают нормальные сигнальные реакции: типичные β-adrenergic и muscarinic реакции (т.е., накопление цАМФ и фосфорилирование phospholamban) а также Gq-coupled фосфорилирование и активацию внеклеточных сигналами регулируемых киназ. После удаления BDM и ITS на 30 min,большинство культивируемых миоцитов контрактирует в ответ на электрическую стимуляцию и обнаруживает нормальную позитивную inotropic реакцию на isoproterenol (a β-adrenergic агонист; Рис. 1). Кроме того, успешная направляемая аденовирусами экспрессия β-galactosidase репортерного белка в культивируемых миоцитах мыши указывает на то, что мы способны манипулировать сигнальными путями за счет экспрессии доминантно негативных, конституитивно активных и взаимодествующих с др. и репортерными формами ключевых белков.
Профили транскриптов изменяютя медленно с увеличением культивирования, осоебнно если сравнивать с только что выделенными клетками; однако, значение внесения BDM или ITS в эти изменения неясно, т.к. большинство культивируемых клеток в их отсутствии к 72 ч нежизнеспособны. Тем не менее наш коллективный анализ показывает, что базовые элементы EC coupling и сигнальных реакций, по-видимому, сохраняются в кардиальных миоцитах спустя 72 ч в культуре с BDM и ITS, что делает эти клетки пригодными для дополнительных исследований после манипуляций с экспрессией генов или внесения экзогенных белков.
Making network connections
Для выяснения сложность сигнальных сетей в кардиальных миоцитах необходимо скомпилировать 'parts list' имеющих к делу отношение сигнальных молекул и идентифицировать возможные взаимодействия среди них. Создание parts list уже начато с поиском белков по литературным источникам, которые участвуют в передаче сигналов в кардиальных миоцитах и с конструкции простых карт передачи сигналов, концентрирующихся на insulin, cAMP, Ca2+ и phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3 или PIP3) модулях, которые затрагивают метаболизм, транскрипцию генов, гипертрофию и контракцию кардиальных миоцитов (доступно на ). Список служит в качестве источника для prioritizing белков, чтобы использовать дрожжевые двугибридные ловушки (baits), а также меченных белков для субклеточнрой локализации и quantification, а также мишенй для perturbations. Список будет расширен по мере нахождения дополнительных белков, которые ассоциируют с или регулируются известными элементами сети. На кДНК и олигонуклеотид-базируемые микромассивы будут важными составляющими в наших усилиях сконструировать исчерпывающий список и со временем, тешим себя надеждой, получим детельную информацию об экспрессии специфических сплайс-вариантов индивидуальных сигнальных белков.
Наши сегодняшние карты передач сигналов содержат только намеки на взаимодействия, которые м. появиться внутри клеточной сети. В сотрудничестве с Myriad Genetics, мы начали получать новую информацию о межбелковых взаимодействиях, используя высоко-производительные дрожжевые двугибриюные системы. Одним из полученных примеров м. служить ассоциация между histone deacetylase 7 и транскрипционным фактором Mef2c (myocyte enhancer factor-2c), которая ранее была предположена Kao с сотр., использовавших метод иммунопрецпитации25. Дополнительные новые взаимодействия, которые м. представлять специальный интерес, включают взаимодействие рецепторов ryanodine с calcium-modulating cyclophilin лигандом; GTPase Dbl с транскрипционным фактором HAND2; и Mef2c с thyroid hormone receptor interactor 6. Этот раздел проекта позволит выявить многие новые белковые взаимодействия, которые смогут быть в дальнейшем проанализированы с помощью ко-иммунопреципитаци и fluorescence resonance energy transfer (FRET).
Др. важным элементом в расшифровке сигнальной сети является способность измерять потоки информации в пространстве и времени. Существенная часть этой информации будет получена с помощью наблюдений субклеточной локализации и движений green fluorescent белком-нагруженных белков и изучения FRET зондов, которые позволят анализировать в реальном времени. Размеры и сложная морфология кардиальных миоцитов делает кардиальные миоциты особенно интересными для микроскопии.
Dd;yj интегрировать динамические морфологические исследования миойитов с информацией, получаемой при др. способах анализа в AfCS. Напр., информация, получаемая из измерений транслокации serine/threonine kinase Akt из цитоплазмы в плазматические мембраны после активации трансмембранных тирозин киназных рецепторов, будет синтегрирована с изменеиями фосфорилирования Akt, а также с информацией о др. компонентах системы, которая генерирует или реагирует на PIP3. (О программа Альянса focus on the PIP3 см. или перевод.) Данные, полученные с помощью этих отличающихся экспериментальных подходов, усиливают и объясняют нашу высокую оценку сетевой системе, функционирующей в миоцитах.
Moving ahead
When we launched the AfCS effort two years ago, we could only speculate about our ability to develop a suitable model system using mouse cardiac myocytes. Development of a reproducible culture system for myocytes has been challenging, and although we continue to refine this model, we will soon be characterizing many signalling responses to individual ligands and combinations of ligands. We will identify the connectivity between signalling components, and eventually measure the flow of information through this system as comprehensively as possible. We are confident that the research community at large will profit from the contributions that we will bring to understanding the mouse cardiac myocyte.
