Odorant Receptor
ОБОНЯНИЕ: РЕЦЕПТОРЫ ЗАПАХОВ
Odorant receptor genes in humans Peter Mombaerts Current Opinion in Genetics & Development Vol. 9, No. 3,P. 315-320. 1999
FISH—fluorescence in situ hybridization; ORF—open reading frame; OSN—olfactory sensory neuron; PCR—polymerase chain reaction; RT-PCR—reverse transcriptase PCR. *Тренированный нос парфюмера может идентифицировать* до 1000–3000 различных запахов. Что такое запах? Для наземных видов, таких как человек, обонятельная система распознает volatile (воздушные) лиганды. Необходимо достаточное давление газа, которое поставляет человеку гидрофобные органические молекулы с небольшими функционаьными группами и молекулярным весом до <310 daltons. Запахи имеют различныую химическую структуру и минимальные различия могут вести к выраженным изменениям качества запаха ( [1] [2] [3] .) Клеточные детекторы запахов - обонятельные сенсорные нейроны (OSNs) - расположены в сенсорном эпителии носовой полости. У человека этот сенсорный эпителий занимает область не более большой почтовой марки. OSNs генерируются в течение всей жизни и замещабт другие OSNs. Дендриты OSN заканчиваются ресничками (cilia), которые выпячиваются в носовую полость и покрыты слизью. Аксоны проходят в череп через отверстия в cribriform пластинке, а синапсы с нейронами второго порядка и промежуточными нейронами внутри конденсированной области нейропиля обонятельных луковиц называются гломерулы . В значительной степени процессинг информации происходит внутри луковиц. Исходящие из них нейроны проэцируются в piriform cortex и многие другие области головного мозга. Молекулярными детекторами запахов являются специфические рецепторы, концентриующиеся на поверхности OSN ресничек. Основной путь передачи сигналов у экспреиментальных видов позвоночных использует G-белками-опосредованную стимуляцию активности аденилат циклазы, обусловливающей подъем цАМФ, который открывает управляемые циклическими нуклеотидами канальцы с неспецифической избирательностью катионов. Подробнее об открытии обонятельных канальцев и роли ионов кальция в передаче обонятельного сигнала смотри ЗДЕСЬ Shepherd GM: Discrimination of molecular signals by the olfactory receptor neuron.** Neuron1994,13:771–790. Buck LB: Information coding in the vertebrate olfactory system. Annu Rev Neurosci1996,19:517–544. Hildebrand JG, Shepherd GM: Mechanisms of olfactory discrimination: converging evidence for common principles across phyla. Annu Rev Neurosci1997,20:595–631. Buck L, Axel R: A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell1991,65:175–187. • Skoufos E, Healy MD, Singer MS, Nadkarni PM, Miller PL, Shepherd GM: Olfactory receptor database: a database of the largest eukaryotic gene family. Nucleic Acids Res1999,27:343–345. •• Mombaerts P: Molecular biology of odorant receptors in vertebrates. Annu Rev Neurosci1999,22:487–509. Lancet D, Ben-Arie N: Olfactory receptors. Curr Biol1993,3:668–674. Sullivan SL, Adamson MC, Ressler KJ, Kozak CA, Buck LB: The chromosomal distribution of mouse odorant receptor genes. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93: 884–888. •• Rouiquier S, Taviaux S, Trask BJ, Brand-Arpon V, van den Engh G, Demaille J, Giorgi D: Distribution of olfactory receptor genes in the human genome. Nat Genet 1998, 18: 243–250. Buck LB: The olfactory multigene family. Curr Biol 1992, 2: 467–473. Selbie LA, Townsend-Nicholson A, lismaa TP, Shine J: Novel G-protein-coupled receptors: a gene family of putative human olfactory receptor sequences. Mol Brain Res 1992, 13: 159–163. Parmentier M, Libert F, Schurmans S, Schiffmann S, Lefort A, Eggerickx D, Ledent C, Mollereau C, Gérard C, Perret J et al.: Expression of members of the putative olfactory receptor gene family in mammalian germ cells. Nature 1992, 355: 453–455. Ben-Arie N, Lancet D, Taylor C, Khen M, Walker N, Ledbetter DH, Carrozzo R, Patel K, Sheer D, Lehrach H, North MA: Olfactory receptor gene cluster on human chromosome 17: possible duplication of an ancestral receptor repertoire. Hum Mol Genet 1994, 3: 229–235. Glusman G, Clifton S, Roe B, Lancet D: Sequence analysis in the olfactory receptor gene cluster on human chromosome 17: recombinatorial events affecting receptor diversity. Genomics 1996, 37: 147–160. Schurmans S, Muscatelli F, Miot F, Mattei MG, Vassart G: *The OLFR1* gene encoding the HGMPO7E putative olfactory receptor maps to the 17p13 → p12 region of the human genome and reveals an Mspl restriction fragment length polymorphism.** Cytogenet Cell Genet 1993, 63: 200–204. • Trask BJ, Friedman C, Martin-Gallardo A, Rowen L, Akinbami C, Blankenship J, Collins C, Giorgi D, ladonato S, Johnson F et al.: Members of the olfactory receptor gene family are contained in large blocks of DNA duplicated polymorphically near the ends of human chromosomes. Hum Mol Genet 1998, 7: 13–26. • Buettner JA, Glusman G, Ben-Arie N, Ramos P, Lancet D, Evans GA: Organization and evolution of olfactory receptor genes on human chromosome 11. Genomics 1998, 53: 56–68. Rouquier S, Friedman C, Delettre C, van den Engh G, Blancher A, Crouau-Roy B, Trask BJ, Giorgi D: A gene recently inactivated in human defines a new olfactory receptor family in mammals. Hum Mol Genet 1998, 7: 1337–1345. • Brand-Arpon V, Rouquier S, Massa H, de Jong PJ, Ferraz C, loannou PA, Demaille JG, Trask BJ, Giorgi D: A genomic region encompassing a cluster of olfactory receptor genes and a myosin light chain kinase (MYLK) gene is duplicated on human chromosome regions 3q13-q21 and 3p13. Genomics 1999, 56: 98–110. •• Trask BJ, Massa H, Brand-Arpon V, Chan K, Friedman C, Nguyen TO, Eichler E, van den Engh G, Rouquier S, Shizuya H, Giorgi D: Large multi-chromosomal duplications encompass many members of the olfactory receptor gene family in the human genome. Hum Mol Genet 1998, 7: 2007–2020. Fan W, Liu YC, Parimoo S, Weissman SM: Olfactory receptor-like genes are located in the human major histocompatibility comples. Genomics 1995, 27: 119–123. Issel-Tarver L, Rine J: The evolution of mammalian olfactory receptor genes. Genetics 1997, 145: 185–195. Carver EA, Issel-Tarver L, Rine J, Olsen AS, Stubbs L: Location of mouse and human genes corresponding to conserved canine olfactory receptor gene families. Mamm Genome 1998, 9: 349–354. Gruen JR, Nalabolu SR, Chu TW, Bowlus C, Fan WF, Goei VL, Wei H, Sivakamasundari R, Liu YC, Xu HX et al.: A transcription map of the major histocompatibility complex (MHC) class I region. Genomics 1996, 36: 70–85. Crowe ML, Perry BN, Connerton IF: Olfactory receptor-encoding genes and pseudogenes are expressed in humans. Gene 1996, 169: 247–249. Ressler KJ, Sullivan SL, Buck LB: A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell 1993, 73: 597–609. Vassar R, Ngai J, Axel R: Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell 1993, 74: 309–318. Vassar R, Chao SK, Sitcheran R, Nuñez JM, Vosshall LB, Axel R: Topographic organization of sensory projections to the olfactory bulb. Cell 1994, 79: 981–991. Ressler KJ, Sullivan SL, Buck LB: Information coding in the olfactory system: evidence for a stereotyped and highly organized epitope map in the olfactory bulb. Cell 1994, 79: 1245–1255. Mombaerts P, Wang F, Dulac C, Chao SK, Nemes A, Mendelsohn M, Edmondson J, Axel R: Visualizing an olfactory sensory map. Cell 1996, 87: 675–686. Rawson NE, Gomez G, Cowart B, Brand JG, Lowry LD, Pribitkin EA, Restrepo D: Selectivity and response characteristics of human olfactory neurons. J Neurophys 1997, 77: 1606–1613. •• Sharon D, Glusman G, Pilpel Y, Khen M, Gruetzner F, Haaf T, Lancet D: Primate evolution of an olfactory receptor cluster: diversification by gene conversion and recent emergence of pseudogenes. Genomics 1999,in press. •• Zhao H, Ivic L, Otaki JM, Hashimoto M, Mikoshiba K, Firestein S: Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science 1998, 279: 237–242. •• Krautwurst D, Yau KW, Reed RR: Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell 1998, 95: 917–926. Vanderhaeghen P, Schurmans S, Vassart G, Parmentier M: Specific repertoire of olfactory receptor genes in the male germ cells of several mammalian species. Genomics 1997, 39: 239–246. Vanderhaeghen P, Schurmans S, Vassart G, Parmentier M: Molecular cloning and chromosomal mapping of olfactory receptor genes expressed in the male germ line: evidence for their wide distribution in the human genome. Biochem Biophys Res Comm 1997, 237: 283–287. McCormack WT, Tjoelker LW, Thompson CB: Avian B-cell development: generation of an immunoglobulin repertoire by gene conversion. Annu Rev Immunol 1991,9:219–241.	Идентифицировано семейство генов, кодирующих предположительно обонятельные рецепторы, Buck и Axel в 1991 [4]. Эти гены обозначаются как 'olfactory receptor', 'odorant receptor', или 'odor receptor' гены, и обычно сокращенно обозначаются как 'OR genes'. OR последовательности собраны в специализированной базе данных [5•]. (Обзор OR генов см. [6••].) Microsmatic animals В отношении запаха животные могут быть охарактеризованы как 'macrosmatic' и 'microsmatic'. Люди слабо различают запахи по сравнению с другими видами позвоночных. Люди с врожденной или приобретенной потерей обоняния (anosmia) более чувствительны к болезненным проявлениям от поедания испорченной пищи, и не распознают отталкивающий запах пригоревшего. Кроме того жизнь сохранияющим свойством, закрепленным естественным отбором, у человека является гедонический аспект восприятия запаха человекаом, который является важным компонентом поседневной жизни. Выявляется скоррелированность нашей microsmatic природы с постепенным снижением числа функциональных OR генов у человека и появлением en masse OR псевдогенов в геноме человека. Общераспространное мнение, что ORs позвоночных обладают широкой специфичностью [1] [2] [3] и не имеют специфических 'ligands' таких какие имеют другие seven-transmembrane белки, которые распознают специфические нейротрнасмиттеры или гормоны. ORs воспринимают пахучие молекулы способом, сравнимым с взаимодействием между рецепторами антигенов (иммуноглобулины и T-клеточные рецепторы) и antigen-presenting молекулами (белками основного комплекса гистосовместимости). Разработаны функциональные методы, способные охарактеризовать репертуар восприятия запахов [33••] [34••]. OLFACTORY RECEPTOR (OR) GENES ОБОНЯТЕЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ГЕНЫ The largest family in the vertebrate genome OR гены клонированы у многих видов позвоночных. Кодирующие области OR генов не содержат интронов [4]. Продукты OR генов являются seven-transmembrane белками, как и большинство других G-белок-купированных рецепторов. OR гены имеют в 1 kb открытую рамку считывания (ORFs), которая не содержит интронов. Основные аминокислотные мотивы ORs включают LHTPMY во внутриклеточной петле 1, MAYDRYVAIC на конце трансмембранного домена 3 и в начале внутриклеточной петли 2, SY на конце трансмембранного домена 5, FSTCSSH в начале трансмембранного домена 6 и PMLNPF в трансмембранном домене 7. Напротив трансмембранные домены 3, 4 и 5 являются гипервариабельными областями: эти домены должны вместе формировать запах-связывающие карманы, аналогичные другим seven-transmembrane белкам. Максимальные различия в этих доменах ожидаются для семейства рецепторов, которые должны взаимодействовать с большим числом одорантов с широко варьирующей химической структурой. Репертуар генов OR может быть подразделен несколькими путями. Согласно одной классификации [7], ORs с >40% аминокислотной идентичностью называются "семействами", а с >60% идентичностью "подсемействами"; однако это деление часто базируется на информации о частичных последовательностях. Более практическая организация их базируется на гибридизационных подсемействах 'hybridization subfamilies' [4]; такие ORs имеют >80% идентичность нуклеотидов. Отличительным признаком OR генов у позвоночных является то, что они образуют кластеры во многих геномных сайтах [8] [9••]. Большинство семейств генов сгруппированы в кластеры в геноме: immunoglobulin, T-cell antigen receptor, major histocompatibility complex, homeobox, globin гены располагаются в небольшом числе кластеров. Такая геномная организация отражает их эволюционое происхождение в результате удвоений и дивергенции. Кроме того кластирование важно для регуляции генов. Минимальные подсчеты [4] выявляют 100–200 OR генов у крыс, более реальные подсчеты сделаны в последнее время 500–1000 OR генов у крыс и мышей [10]. Количество OR-подобных последовательностей у человека определено как 500–750 (L Buck, personal communication). Семейство OR генов самое большое из известных семейств с геноме млекопитающих, превосходит сложность семейств immunoglobulin и T-cell antigen receptor генов. Human odorant receptor genes Первые OR гены были идентифицированы у человека в 1992 [11] [12]. Небольшой кластер OR генов был охарактеризован в деталях и некоторые геномные области были секвенированы полностью. Первые результаты получены на кластере OR генов из 17p13 [13] [14], где они впервые были картированы [15]. Область в 350 kb представлена 16 OR-подобными последовательностями, из котрых 6 (38%) являлись псевдогенами [13]. Одна космида в 40 kb секвенирована целиком и выявлен необычный тип псевдогена, образующийся за счет слияния двух OR генов [14]. Секвенирование 36 kb космид человека, котрые были картированы на хромосоме 19, позволило идентифицировать три OR-подобные последовательности, из которых одна является функциональным геном [16•]. 25 новых OR-подобных последовательностей были охарактеризованы в отдельных областях хромосомы 11, из которых 19 (76%) были псевдогенами [17•]. Другие OR псевдогены, картированные в 11q11-12, образуют новое семейство OR генов [18]. Последовательность в 106 kb на 3p13 выявляет кластер из трех OR псевдогенов и включает псевдоген для киназы легкой цепи миозина [19•]. Fluorescent in situ hybridization (FISH) анализ OR-содержащих геномных клонов показаля, что многие из них гибридизируются с множественными сайтами в геноме [20••]. 44 мест, распределены по 13 хромосомам ; 33 из них содержат последовательности, которые перекрестно гибридизируются с с одним или несколькими геномными сайтами. Это первое указание на то, что больше-масштабные удвоения могут формировать репертуар существуюшщих OR генов. Другое геномное исследование OR-подобных последовательностей проведено в 6p21 [21], и в 7q35, 11q11, 19p13 [22] [23]. Обширная программа по клонированию и секвенированию OR генов позволила картировать все сайты, содержащие OR гены в геноме человека [9••]. OR гены находятся во всех хромосомах за исключением 20 и Y хромосомы. Открыто более 25 мест, вообще 53 сайта. Если некотрые OR гены являются одиночками ('singletons') — то число сайтов должно возрасти . Большое количество геномных мест делает проблематичной регуляцию OR генов. Экспрессия этих генов должна быть не только ограничена обонятельными нейронами (OSNs), но и разные OSNs должны экспрессировать различные OR гены. Когда сотни килобайс секвенированной геномной ДНК не выявляют ничего кроме handful псевдогенов, то маловероятно, что информация этих последовательностей сможет быть использована для понимания регуляции экспрессии OR генов, если псевдогены экспрессируются вообще. OR gene expression Экспрессию OR генов в OSNs человека не удается продемонстрировать каким дибо методом (in situ hybridization, single-cell RT-PCR etc.). Одна работа сообщает результаты RT-PCR из ткани носа человека [13]. Очень мало кДНК выделено скриннинг-библиотеками из нейральных и носовых тканей и не произведено сравниения их с геномной структурой, поэтому неясно происходят ли эти клоны из мРНК или геномной ДНК. [11] [24] [25]. Проблема и в отсутствии библиотек кДНК из обонятельной слизистой человека с большим числом зрелых OSNs. Субнабор функциональных OR последовательностей из набора их у человека порядка 120–465. У крыс и мышей OSNs, экспрессирующие OR гены, локализованы в одной из 4-х широких полос или "зонах" внутри обонятельного эпителия [26] [27]. Такая зональная организация сенсорного слоя не противоречит анатомическим или физиологическим исследованиям, но ее биологическое значение остается все еще необъясненным. Аксоны OSNs, экспрессирующих данные OR гены, проэцируются в небольшое число пространстенно определенных гломерул [28] [29]. Целенаправленный мутагенез у мышей показал, что OSNs, экспрессирующие данный OR ген, P2 ген, проэцируют свои аксоны в пару специфических гломерул на каждую обнятельную луковицу из возможного выбора в 2000 гломерул [30]. Локализация этих гломерул стереотипна и билатерально симметрична. Следовательно, гломерулы являются функциональными единицами, которые интегрируют обонятельную информацию [1] [2] [3]. Дополнительные генетические экспреименты [30] подтвердили мнение, что ORs безусловно вовлечены в механизмы, которые предопрделяют этот высоко репродуцируемый паттерн поэкций: вообще то ORs выполняют и добавочную роль, такую как наведение рецепторов для сигналов в обонятельной луковице. Неясно можно ли анатомическую организацию, описанную для мышей и крыс, экстраполировать на человека: зональная топография экспрессии OR не выявлена у человека при гибридизации in situ, как и аксональная конвергенция в специфические гломерулы. Известно так мало, что точное определение числа гломерул в обонятельных луковицах человека невозможно. Скудность информации характерна и для электрофизиологических исследований [31]. Expression in human testis Сообщалось о частичных или полных последовательностях ORF >50 ORs, клонированных с помощью PCR из кДНК семенников человека [12] [35]. Эти последовательности не обладают общими определенными свойствами при сравненнии с другими ORs. Тестикулярные OR гены человека картированы 11p22, 17q21 и 19p13-19p31 [36]. Курьезным явлется то, что только один псесдоген описан среди ORs. Экспрессия OR генов в зародышевой линии самцов может быть результатом плохой регуляции транскрипции. Так как большинство тестикулярных ORs не являются псевдогенами, то можно предположить, что продукты этих генов выполняют специфическую биологическую роль; но псевдогены вообще-то редко экспрессируются.Такая роль может быть связана с созреванием спермиев, подвижностью спермиев(chemokinesis) или аттракцией спермиев ооцитами (chemotaxis). Альтерантивное мнение заключается в том, что тестикулярные ORs являются 'OR-подобными генами' со специфической для спермиев экспрессией. Если некоторые тестикуляные рецепторы не экспрессируются в OSNs, то они и не должны называться 'ORs'. Variability in the human species Три OR-подобных последовательности, одна из которых может представлять собой функциональный ген, вставлены в повторяющиеся в 36 kb блоки, которые обнаруживаются в субтеломерном положении в хромосомах 3q, 15q, 19p [16•]. Добавочные блоки этих копий присутствуют полиморфно у индивидов различных этнических групп. Результат, что геном человека может содержать 7–11 копий этого блока, который включает три OR-like последовательности. Это пока единственные подобные отличия в геноме человека. Аллельные варианты OR генов человека появляются очень часто, но еще не описаны. Некоторые межиндивидуальные вариации находятся в OR-подобных последовательностях, которые или псевдогены или функциональные гены. Повышение порога восприятия, называемое hyposmias, встречаетс часто в популяциях человека; для любого случайно выбранного одоранта, часть тестируемых субъектов не может определить запах этого соединения в концентраци, при которой большинство его ощущает. Если набор OR генов у человека, скажем, 250 генов, то возможно опредлить наиболее частый аллель для каждого из генов. Межиндивидуальная изменчивость порогов обоняния может быть использована для выявления потенциальных ассоциаций с нарушениями настроения (mood) и психологическими или даже психиатрическими аффектами и синдромами. OLFACTORY RECEPTOR (OR) PSEUDOGENES ОБОНЯТЕЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПСЕВДОГЕНЫ Pseudogenes Первый из многих OR псевдогенов у человека выявлен на ранней стадии [11] а экспрессируемые псевдогены были позднее изолированы из библиотеки кДНК из ткани носа человека [25]. Теперь очевидно, что большая фракция OR-подобных последовательностей у человека является псевдогенами, в противоположность другим позвоночным [6••]. Наиболее обстоятельное изучение репертуара OR генов у человека [9••] выявило, что 63 из 87 отдельных OR PCR продуктов (72%) происходят из псевдогенов. ORF псевдогенов обычно прерывается более чем одной вредной мутацией, такой как нонсенс мутацией или вызывающей сдвиг рамки считывания вставкой или делецией. Необычная экспансия poly-T 5–12 нуклеотидов в середине трансмембранного домена 4 обнаружена у 18 из 63 псевдогенов. Некоторые клонируемые продукты являются результатом рекомбинации между высоко сходными последовательностями по PCR реакции. Этот феномен 'chimeric' OR генных последовательностей уже был задокументирован, когда космиды в 40 kb были секвенированы полностью [14], 3 из 6 OR фрагментов [13] [9••] не происходили из нуклеотидных последовательностей. Тем не менее высокая частота OR псевдогенов у человека подтверждается прямым геномным секвенированием и она скорее занижена. Некоторые OR-подобные последовательности столь дивергентны или дефектны, что что их перекресная гибридизация с зондом или малоконкурентными PCR праймерами не происходит. Кроме того большинство последовательностей представлено фрагментами ORF генов OR между трансмембранными доменами 2 и 7. В одном случае OR-подобные последовательности, исключены из псевдогенов, так как у них отсутствует как стартовые, так и стоп кодоны [19•]; эти последовательности не классифицируются как псевдогены по ним доступна лишь частичная информация. В целом последовательности из >150 клонов OR описаны [6••]. Частота псевдогенов OR у человека оценивается в 38–76% [9••] [13] [14] [17•]. У мышей или крыс практически нет псевдогенов; в наших исследованиях , <8% мышиных OR-подобных последовательностей являются псевдогенами (S Xie, P Feinstein, P Mombaerts, unpublished observations). Столь обширная дегенерация целого семейства генов в геноме человека еще не была задокументирована. Non-human primates Начаты исследования по сравнению последовательностей и геномной организации у человека и приматов, таких как шимпанзе, горилла и орангутанг [16•] [18] [20••] [32••]. Блок последовательностей в 36 kb, содержащий три OR-подобных гена, который появляется полиморфно в нескольких субтеломеных сайтах у человека, обнаружен только в одном месте, на 4q, у шимпанзе и гориллы [16•]. Последовательности ортологичные псевдогенам человека, которые могут быть отнесены к новому семейству OR, имеют непрерванную ORF в геноме у шимпанзе, орангутанга и гиббона [18]. Выявлено мало сайтов с геномными клонами, которые гибридизируются с многочисленными областями и стабильны во время дивергенции приматов, это указывает на то. что крупномасштабные различия между геномами приматов в основном занижены [20••]. Наиболее обширное исследование охарактеризовало кластер из 15 OR-подобных последовательностей в 19p15 шимпанзе [32••] которая является ортологом 15 OR-подобных последовательностей у человека в 17p13 [13] [14]. четыре из OR-подобных последовательностей являются псевдогенами, два из которых имеют вредные мутации, которые отличны у человека. Добавочный анализ ортологов OR генов у других Африканских apes указывает на то, что все 15 OR гена из геномного кластера были интактны во время разделения орангутанг/African apes, которое произошло ~9 million лет назад. Интересно, что дивергенция последовательностей ниже в функциональных генах, чем в псевдогенах, т.е. OR гены являются объектом селективного давления. Быстрое появление псевдогенов во время эволюции может отражать значительную редукцию уровня селекции OR генов во время эволюции приматов в соответствии со снижением их зависимости от чувствительности к запахам. Caveats Я не хочу уверять, что microsmatic состояниеу человека обусловлено безусловно снижением набора функциональных OR генов. Возможны два возражения. Первое, многие OR-подобные последовательности, называемые "псевдогенами" , т.к. содержат прерванные ORF на уровне геномной ДНК. Так как мало кДНК или RT-PCR продуктов из обонятельной слизистой носа было охарактеризовано, то возможно что вредные мутации корректируются с помощью конверсии генов или РНК редактирования. Например, в иммуноглобиновом вариабельном сегменте семейства генов у эмбрионов кур псевдогены выступают как доноры для генной конверсии, в результате возникают функциональные гены [37]. Во-вторых, возможно, что основная часть человеческого обоняния опосредуется очень отличающимися классами рецепторов одорантов, которые не могут быть получены с помощью используемых зондов и PCR праймеров. Conclusions У позвоночных OR гены образуют самое большое из известных семейств. Массивное и недавнее появление псевдогенов в геноме человека можно объяснить эколюционно снижением нашей зависимости от восприятия запахов: OR гены менее сильно подвержены давлению естественного отбора у видов, базирующихся в основном на восприятии визуальных и слуховых сигналов.

Идентифицировано семейство генов, кодирующих предположительно обонятельные рецепторы, Buck и Axel в 1991 [4]. Эти гены обозначаются как 'olfactory receptor', 'odorant receptor', или 'odor receptor' гены, и обычно сокращенно обозначаются как 'OR genes'. OR последовательности собраны в специализированной базе данных [5•]. (Обзор OR генов см. [6••].) Microsmatic animals

В отношении запаха животные могут быть охарактеризованы как 'macrosmatic' и 'microsmatic'. Люди слабо различают запахи по сравнению с другими видами позвоночных. Люди с врожденной или приобретенной потерей обоняния (anosmia) более чувствительны к болезненным проявлениям от поедания испорченной пищи, и не распознают отталкивающий запах пригоревшего. Кроме того жизнь сохранияющим свойством, закрепленным естественным отбором, у человека является гедонический аспект восприятия запаха человекаом, который является важным компонентом поседневной жизни.

Выявляется скоррелированность нашей microsmatic природы с постепенным снижением числа функциональных OR генов у человека и появлением en masse OR псевдогенов в геноме человека. Общераспространное мнение, что ORs позвоночных обладают широкой специфичностью [1] [2] [3] и не имеют специфических 'ligands' таких какие имеют другие seven-transmembrane белки, которые распознают специфические нейротрнасмиттеры или гормоны. ORs воспринимают пахучие молекулы способом, сравнимым с взаимодействием между рецепторами антигенов (иммуноглобулины и T-клеточные рецепторы) и antigen-presenting молекулами (белками основного комплекса гистосовместимости). Разработаны функциональные методы, способные охарактеризовать репертуар восприятия запахов [33••] [34••].

OLFACTORY RECEPTOR (OR) GENES

ОБОНЯТЕЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ГЕНЫ

The largest family in the vertebrate genome

OR гены клонированы у многих видов позвоночных. Кодирующие области OR генов не содержат интронов [4].

Продукты OR генов являются seven-transmembrane белками, как и большинство других G-белок-купированных рецепторов. OR гены имеют в 1 kb открытую рамку считывания (ORFs), которая не содержит интронов. Основные аминокислотные мотивы ORs включают LHTPMY во внутриклеточной петле 1, MAYDRYVAIC на конце трансмембранного домена 3 и в начале внутриклеточной петли 2, SY на конце трансмембранного домена 5, FSTCSSH в начале трансмембранного домена 6 и PMLNPF в трансмембранном домене 7. Напротив трансмембранные домены 3, 4 и 5 являются гипервариабельными областями: эти домены должны вместе формировать запах-связывающие карманы, аналогичные другим seven-transmembrane белкам. Максимальные различия в этих доменах ожидаются для семейства рецепторов, которые должны взаимодействовать с большим числом одорантов с широко варьирующей химической структурой.

Репертуар генов OR может быть подразделен несколькими путями. Согласно одной классификации [7], ORs с >40% аминокислотной идентичностью называются "семействами", а с >60% идентичностью "подсемействами"; однако это деление часто базируется на информации о частичных последовательностях. Более практическая организация их базируется на гибридизационных подсемействах 'hybridization subfamilies' [4]; такие ORs имеют >80% идентичность нуклеотидов.

Отличительным признаком OR генов у позвоночных является то, что они образуют кластеры во многих геномных сайтах [8] [9••]. Большинство семейств генов сгруппированы в кластеры в геноме: immunoglobulin, T-cell antigen receptor, major histocompatibility complex, homeobox, globin гены располагаются в небольшом числе кластеров. Такая геномная организация отражает их эволюционое происхождение в результате удвоений и дивергенции. Кроме того кластирование важно для регуляции генов.

Минимальные подсчеты [4] выявляют 100–200 OR генов у крыс, более реальные подсчеты сделаны в последнее время 500–1000 OR генов у крыс и мышей [10]. Количество OR-подобных последовательностей у человека определено как 500–750 (L Buck, personal communication). Семейство OR генов самое большое из известных семейств с геноме млекопитающих, превосходит сложность семейств immunoglobulin и T-cell antigen receptor генов.

Human odorant receptor genes

Первые OR гены были идентифицированы у человека в 1992 [11] [12]. Небольшой кластер OR генов был охарактеризован в деталях и некоторые геномные области были секвенированы полностью. Первые результаты получены на кластере OR генов из 17p13 [13] [14], где они впервые были картированы [15]. Область в 350 kb представлена 16 OR-подобными последовательностями, из котрых 6 (38%) являлись псевдогенами [13]. Одна космида в 40 kb секвенирована целиком и выявлен необычный тип псевдогена, образующийся за счет слияния двух OR генов [14]. Секвенирование 36 kb космид человека, котрые были картированы на хромосоме 19, позволило идентифицировать три OR-подобные последовательности, из которых одна является функциональным геном [16•]. 25 новых OR-подобных последовательностей были охарактеризованы в отдельных областях хромосомы 11, из которых 19 (76%) были псевдогенами [17•]. Другие OR псевдогены, картированные в 11q11-12, образуют новое семейство OR генов [18]. Последовательность в 106 kb на 3p13 выявляет кластер из трех OR псевдогенов и включает псевдоген для киназы легкой цепи миозина [19•].

Fluorescent in situ hybridization (FISH) анализ OR-содержащих геномных клонов показаля, что многие из них гибридизируются с множественными сайтами в геноме [20••]. 44 мест, распределены по 13 хромосомам ; 33 из них содержат последовательности, которые перекрестно гибридизируются с с одним или несколькими геномными сайтами. Это первое указание на то, что больше-масштабные удвоения могут формировать репертуар существуюшщих OR генов. Другое геномное исследование OR-подобных последовательностей проведено в 6p21 [21], и в 7q35, 11q11, 19p13 [22] [23].

Обширная программа по клонированию и секвенированию OR генов позволила картировать все сайты, содержащие OR гены в геноме человека [9••]. OR гены находятся во всех хромосомах за исключением 20 и Y хромосомы. Открыто более 25 мест, вообще 53 сайта. Если некотрые OR гены являются одиночками ('singletons') — то число сайтов должно возрасти .

Большое количество геномных мест делает проблематичной регуляцию OR генов. Экспрессия этих генов должна быть не только ограничена обонятельными нейронами (OSNs), но и разные OSNs должны экспрессировать различные OR гены. Когда сотни килобайс секвенированной геномной ДНК не выявляют ничего кроме handful псевдогенов, то маловероятно, что информация этих последовательностей сможет быть использована для понимания регуляции экспрессии OR генов, если псевдогены экспрессируются вообще.

OR gene expression

Экспрессию OR генов в OSNs человека не удается продемонстрировать каким дибо методом (in situ hybridization, single-cell RT-PCR etc.). Одна работа сообщает результаты RT-PCR из ткани носа человека [13]. Очень мало кДНК выделено скриннинг-библиотеками из нейральных и носовых тканей и не произведено сравниения их с геномной структурой, поэтому неясно происходят ли эти клоны из мРНК или геномной ДНК. [11] [24] [25].

Проблема и в отсутствии библиотек кДНК из обонятельной слизистой человека с большим числом зрелых OSNs. Субнабор функциональных OR последовательностей из набора их у человека порядка 120–465.

У крыс и мышей OSNs, экспрессирующие OR гены, локализованы в одной из 4-х широких полос или "зонах" внутри обонятельного эпителия [26] [27]. Такая зональная организация сенсорного слоя не противоречит анатомическим или физиологическим исследованиям, но ее биологическое значение остается все еще необъясненным. Аксоны OSNs, экспрессирующих данные OR гены, проэцируются в небольшое число пространстенно определенных гломерул [28] [29]. Целенаправленный мутагенез у мышей показал, что OSNs, экспрессирующие данный OR ген, P2 ген, проэцируют свои аксоны в пару специфических гломерул на каждую обнятельную луковицу из возможного выбора в 2000 гломерул [30]. Локализация этих гломерул стереотипна и билатерально симметрична. Следовательно, гломерулы являются функциональными единицами, которые интегрируют обонятельную информацию [1] [2] [3]. Дополнительные генетические экспреименты [30] подтвердили мнение, что ORs безусловно вовлечены в механизмы, которые предопрделяют этот высоко репродуцируемый паттерн поэкций: вообще то ORs выполняют и добавочную роль, такую как наведение рецепторов для сигналов в обонятельной луковице.

Неясно можно ли анатомическую организацию, описанную для мышей и крыс, экстраполировать на человека: зональная топография экспрессии OR не выявлена у человека при гибридизации in situ, как и аксональная конвергенция в специфические гломерулы. Известно так мало, что точное определение числа гломерул в обонятельных луковицах человека невозможно. Скудность информации характерна и для электрофизиологических исследований [31].

Expression in human testis

Сообщалось о частичных или полных последовательностях ORF >50 ORs, клонированных с помощью PCR из кДНК семенников человека [12] [35]. Эти последовательности не обладают общими определенными свойствами при сравненнии с другими ORs. Тестикулярные OR гены человека картированы 11p22, 17q21 и 19p13-19p31 [36]. Курьезным явлется то, что только один псесдоген описан среди ORs.

Экспрессия OR генов в зародышевой линии самцов может быть результатом плохой регуляции транскрипции. Так как большинство тестикулярных ORs не являются псевдогенами, то можно предположить, что продукты этих генов выполняют специфическую биологическую роль; но псевдогены вообще-то редко экспрессируются.Такая роль может быть связана с созреванием спермиев, подвижностью спермиев(chemokinesis) или аттракцией спермиев ооцитами (chemotaxis).

Альтерантивное мнение заключается в том, что тестикулярные ORs являются 'OR-подобными генами' со специфической для спермиев экспрессией. Если некоторые тестикуляные рецепторы не экспрессируются в OSNs, то они и не должны называться 'ORs'.

Variability in the human species

Три OR-подобных последовательности, одна из которых может представлять собой функциональный ген, вставлены в повторяющиеся в 36 kb блоки, которые обнаруживаются в субтеломерном положении в хромосомах 3q, 15q, 19p [16•]. Добавочные блоки этих копий присутствуют полиморфно у индивидов различных этнических групп. Результат, что геном человека может содержать 7–11 копий этого блока, который включает три OR-like последовательности. Это пока единственные подобные отличия в геноме человека.

Аллельные варианты OR генов человека появляются очень часто, но еще не описаны. Некоторые межиндивидуальные вариации находятся в OR-подобных последовательностях, которые или псевдогены или функциональные гены.

Повышение порога восприятия, называемое hyposmias, встречаетс часто в популяциях человека; для любого случайно выбранного одоранта, часть тестируемых субъектов не может определить запах этого соединения в концентраци, при которой большинство его ощущает. Если набор OR генов у человека, скажем, 250 генов, то возможно опредлить наиболее частый аллель для каждого из генов. Межиндивидуальная изменчивость порогов обоняния может быть использована для выявления потенциальных ассоциаций с нарушениями настроения (mood) и психологическими или даже психиатрическими аффектами и синдромами.

OLFACTORY RECEPTOR (OR) PSEUDOGENES

ОБОНЯТЕЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПСЕВДОГЕНЫ

Pseudogenes

Первый из многих OR псевдогенов у человека выявлен на ранней стадии [11] а экспрессируемые псевдогены были позднее изолированы из библиотеки кДНК из ткани носа человека [25]. Теперь очевидно, что большая фракция OR-подобных последовательностей у человека является псевдогенами, в противоположность другим позвоночным [6••].

Наиболее обстоятельное изучение репертуара OR генов у человека [9••] выявило, что 63 из 87 отдельных OR PCR продуктов (72%) происходят из псевдогенов. ORF псевдогенов обычно прерывается более чем одной вредной мутацией, такой как нонсенс мутацией или вызывающей сдвиг рамки считывания вставкой или делецией. Необычная экспансия poly-T 5–12 нуклеотидов в середине трансмембранного домена 4 обнаружена у 18 из 63 псевдогенов. Некоторые клонируемые продукты являются результатом рекомбинации между высоко сходными последовательностями по PCR реакции. Этот феномен 'chimeric' OR генных последовательностей уже был задокументирован, когда космиды в 40 kb были секвенированы полностью [14], 3 из 6 OR фрагментов [13] [9••] не происходили из нуклеотидных последовательностей.

Тем не менее высокая частота OR псевдогенов у человека подтверждается прямым геномным секвенированием и она скорее занижена. Некоторые OR-подобные последовательности столь дивергентны или дефектны, что что их перекресная гибридизация с зондом или малоконкурентными PCR праймерами не происходит. Кроме того большинство последовательностей представлено фрагментами ORF генов OR между трансмембранными доменами 2 и 7. В одном случае OR-подобные последовательности, исключены из псевдогенов, так как у них отсутствует как стартовые, так и стоп кодоны [19•]; эти последовательности не классифицируются как псевдогены по ним доступна лишь частичная информация.

В целом последовательности из >150 клонов OR описаны [6••]. Частота псевдогенов OR у человека оценивается в 38–76% [9••] [13] [14] [17•]. У мышей или крыс практически нет псевдогенов; в наших исследованиях , <8% мышиных OR-подобных последовательностей являются псевдогенами (S Xie, P Feinstein, P Mombaerts, unpublished observations). Столь обширная дегенерация целого семейства генов в геноме человека еще не была задокументирована.

Non-human primates

Начаты исследования по сравнению последовательностей и геномной организации у человека и приматов, таких как шимпанзе, горилла и орангутанг [16•] [18] [20••] [32••]. Блок последовательностей в 36 kb, содержащий три OR-подобных гена, который появляется полиморфно в нескольких субтеломеных сайтах у человека, обнаружен только в одном месте, на 4q, у шимпанзе и гориллы [16•]. Последовательности ортологичные псевдогенам человека, которые могут быть отнесены к новому семейству OR, имеют непрерванную ORF в геноме у шимпанзе, орангутанга и гиббона [18]. Выявлено мало сайтов с геномными клонами, которые гибридизируются с многочисленными областями и стабильны во время дивергенции приматов, это указывает на то. что крупномасштабные различия между геномами приматов в основном занижены [20••].

Наиболее обширное исследование охарактеризовало кластер из 15 OR-подобных последовательностей в 19p15 шимпанзе [32••] которая является ортологом 15 OR-подобных последовательностей у человека в 17p13 [13] [14]. четыре из OR-подобных последовательностей являются псевдогенами, два из которых имеют вредные мутации, которые отличны у человека. Добавочный анализ ортологов OR генов у других Африканских apes указывает на то, что все 15 OR гена из геномного кластера были интактны во время разделения орангутанг/African apes, которое произошло ~9 million лет назад. Интересно, что дивергенция последовательностей ниже в функциональных генах, чем в псевдогенах, т.е. OR гены являются объектом селективного давления. Быстрое появление псевдогенов во время эволюции может отражать значительную редукцию уровня селекции OR генов во время эволюции приматов в соответствии со снижением их зависимости от чувствительности к запахам.

Caveats

Я не хочу уверять, что microsmatic состояниеу человека обусловлено безусловно снижением набора функциональных OR генов. Возможны два возражения. Первое, многие OR-подобные последовательности, называемые "псевдогенами" , т.к. содержат прерванные ORF на уровне геномной ДНК. Так как мало кДНК или RT-PCR продуктов из обонятельной слизистой носа было охарактеризовано, то возможно что вредные мутации корректируются с помощью конверсии генов или РНК редактирования. Например, в иммуноглобиновом вариабельном сегменте семейства генов у эмбрионов кур псевдогены выступают как доноры для генной конверсии, в результате возникают функциональные гены [37]. Во-вторых, возможно, что основная часть человеческого обоняния опосредуется очень отличающимися классами рецепторов одорантов, которые не могут быть получены с помощью используемых зондов и PCR праймеров.

Conclusions

У позвоночных OR гены образуют самое большое из известных семейств. Массивное и недавнее появление псевдогенов в геноме человека можно объяснить эколюционно снижением нашей зависимости от восприятия запахов: OR гены менее сильно подвержены давлению естественного отбора у видов, базирующихся в основном на восприятии визуальных и слуховых сигналов.